黄瓜FtsZs基因家族鉴定及分析

关键词：黄瓜；FtsZs基因；生物信息学分析；非生物胁迫反应；生物胁迫反应

黄瓜（CucumissativusL.）是世界性的十大蔬菜作物之一，而我国是黄瓜的主产国。2022年，我国黄瓜种植面积为131.15万hm2，总产量为7730.73万吨，分别占全球的60.32%和81.62%，均居世界第一位。

FtsZ（FilamentingtemperaturesensitiveZ）蛋白作为一种可溶性的胞质蛋白，是微管蛋白的结构同系物。FtsZ在离体条件下经诱导可通过多聚化作用组装成线形排列的有序结构，而这些由FtsZ蛋白组成的结构则与tubulin形成的原纤丝非常类似［1］，暗示了其功能的相似性。FtsZ蛋白多定位于质体或叶绿体，并作为质体分裂复合体的基本组成部分，组装成FtsZ环并招募至少二十多种蛋白质介导胞质分裂［2］。FtsZ可直接或间接地调控叶绿体分裂环中蛋白质的组装和定位，并驱动叶绿体的分裂。有研究表明，拟南芥FtsZ1、FtsZ2-1和FtsZ2-2定位于叶绿体的基质和类囊体上，可以通过影响叶绿体分裂，使叶绿体变大［3-5］。水稻（Oryzasativa）OsFtsZ1和OsFtsZ2-1过表达和敲低都会抑制淀粉体分裂，产生多形性淀粉颗粒［6］。与野生型相比，马铃薯ftsz1敲除突变体块茎中淀粉颗粒增大或淀粉粒黏度增加［7］。在小立碗藓中，利用基因编辑技术获得了ftsz2-1突变体，研究发现，ftsz2-1突变体的叶绿体分裂受到显著影响，甚至在其少数细胞中能观察到单个不分裂的丝状叶绿体［8］。在烟草中敲低FtsZ基因会干扰叶绿体的正常分裂过程，引起叶绿体发育的异常，并导致叶绿体数目的减少和体积的增加［9］。

目前黄瓜FtsZs家族的研究还未见报道，其功能尚不清楚。为了解析黄瓜FtsZs基因的功能，本文对黄瓜FtsZs家族成员进行了鉴定，分析了其基因结构及在染色体上的分布，研究了黄瓜FtsZs与拟南芥、番茄、甜瓜FtsZs的亲缘关系，确定了其组织表达特性及对生物和非生物胁迫的响应情况，研究结果可为探明黄瓜FtsZs作用机制提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 FtsZs家族基因的鉴定

分别从葫芦科基因组网站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB）、拟南芥基因组网站（https：//www.arabidopsis.org）和番茄基因组网站（https：//solgenomics.net）下载黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄gff、cds、pep、fasta文件，获得黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄所有注释基因信息。随后从Pfam数据库（http：//www.example.com）下载FtsZ保守域（PF12327）的HMM配置文件，在所下载注释基因信息中筛选黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄的FtsZs基因（默认参数和截止值为0.01）。使用Pfam工具（http：//www.example.com）和SMART（http：//www.example.com）对筛选获得的黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄FtsZ保守域进行鉴定，并根据其与拟南芥FtsZs的亲缘关系进行命名；使用ExPasy（htps：/web.ExPasy.org/computepI/）计算FtsZs的相对分子量（Mw）、氨基酸数量（AA）和等电点（pI）；使用Plant-mPLoc（http：//www.csbio.situ.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测FtsZs的亚细胞定位情况。

1.2 黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄FtsZs进化关系分析

利用MEGA7软件中的ClustalX对所有FtsZs蛋白序列进行对比，随后采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod，NJ）构建系统进化树，并用Bootstrap法（重复次数设定为1000）评估系统进化树，最终使用MEGA7呈现进化树。

1.3 黄瓜FtsZs基因及蛋白结构的分析

从黄瓜基因组网站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））获得FtsZs的内含子和外显子信息，并利用TBtools生成基因结构；使用MEME（htps：//www.omicsclass.com/article/432）在线网站分析黄瓜FtsZs的保守motif（设置基序数为10，基序的最小长度为6个氨基酸，基序的最大长度为10个氨基酸），并用TBtools可视化［10］；从黄瓜基因组网站（http：//CucurbitGenomicsDatabase（CuGenDB））获得FtsZs的蛋白序列，从SMART网站获得Tubulindomain和FtsZ-Cdomain两个保守结构域的蛋白序列，利用DNAMAN生成FtsZs蛋白序列并分析蛋白序列的差异。

1.4 黄瓜FtsZs组织表达特性分析

基于已有的RNA-seq数据（SRA046916）［11］，分析了黄瓜FtsZs在根、茎、叶、雌花、雄花、子房、未受精子房、已受精子房和卷须等九个组织的表达情况。并基于FPKM值使用TBtools软件（v2.086）可视化。

1.5 实时荧光定量PCR分析黄瓜FtsZs表达特性

将华北型黄瓜“9930”种于山东农业大学园艺实验站9号温室，并按照常规栽培方法进行管理。在结果期取根、茎、叶、雌花、雄花、卷须和果实等组织，采用TRIzol（湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取RNA，并用EvoM-MLV反转录预混型试剂盒Ver.2（t湖南艾科瑞生物工程有限公司）逆转录成cDNA。使用PrimerPremier5.0设计引物，并以黄瓜肌动蛋白基因作为内参（引物序列见附表S1）。采用SYBRGreenProTaqHS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）在CFXOpus96实时PCR检测系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行实时荧光定量PCR检测。采用2-ΔΔCt方法计算所选基因的相对表达水平［12］。对每个基因进行3次生物学和3次技术重复。

1.6 黄瓜FtsZs响应非生物和生物胁迫分析

从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载了盐胁迫（GSE116265）［13］、高温胁迫（GSE151055）［14］、冷处理（GSE210703）［15］和白粉病菌侵染（GSE81234）［16］的转录组数据，以分析黄瓜FtsZs的响应情况，并用TBtools可视化。

2 结果与分析

2.1 黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄FtsZs的鉴定

本文在黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄中分别鉴定到了3个、3个、3个和4个FtsZs基因，并按亲缘关系对其进行命名（见表1）。通过比对基因结构发现，基因间的长度相差很大，介于2050和17560bp之间，其中最短的基因为AtFtsZ1（2050bp），最长的基因为SlFtsZ2-1（17560bp）；它们的外显子数目介于6和8之间，黄瓜FtsZs基因的外显子多为7个，拟南芥FtsZs基因的外显子多为6个，番茄FtsZs基因的外显子多为7个。蛋白结构分析发现，氨基酸长度介于419和491AA之间；大部分基因偏酸性（AtFtsZ1，AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2，CsFtsZ1，CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，SlFtsZ1-1，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2，CmFtsZ1，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），只有1个基因偏碱性（SlFtsZ1-2）。黄瓜FtsZs基因长度与其他物种的差异较大，暗示FtsZs在不同物种中可能发挥不同的功能。

亚细胞定位预测结果显示，所有的FtsZ1s基因都在叶绿体和细胞质中有定位信号（AtFtsZ1，CsFtsZ1，SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2，CmFtsZ1），黄瓜和甜瓜的FtsZ2s基因都有细胞质定位信号（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2，CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），而拟南芥和番茄的FtsZ2s基因都有叶绿体定位信号（AtFtsZ2-2，SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2）。

2.2 黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄FtsZs进化关系分析

根据亲缘关系的远近，我们可以将FtsZs基因分为2个组。第一组包括1个黄瓜FtsZ基因（CsFtsZ1），1个甜瓜FtsZ基因（CmFtsZ1），1个拟南芥FtsZ基因（AtFtsZ1）和2个番茄FtsZs基因（SlFtsZ1-1，SlFtsZ1-2），其中黄瓜FtsZ基因和甜瓜FtsZ基因的亲缘关系最近，其次是拟南芥和番茄。第二个组包括2个黄瓜FtsZs基因（CsFtsZ2-1，CsFtsZ2-2），2个番茄FtsZs基因（SlFtsZ2-1，SlFtsZ2-2），2个拟南芥FtsZs基因（AtFtsZ2-1，AtFtsZ2-2），2个甜FtsZs基因瓜（CmFtsZ2-1，CmFtsZ2-2），其中黄瓜FtsZs基因和甜瓜FtsZs基因的亲缘关系最近，其次是拟南芥FtsZs基因和番茄FtsZs基因（图1）。

2.3 黄瓜FtsZs基因结构分析

研究发现，CsFtsZ1有6个外显子，氨基酸长度为421AA；CsFtsZ2-1有7个外显子，氨基酸长度为488AA；CsFtsZ2-2有7个外显子，氨基酸长度为479AA。CsFtsZ1与CsFtsZ2-1、CsFtsZ2-2在外显子数目和氨基酸长度上存在差异，CsFtsZ2-1与CsFtsZ2-2在基因结构上差异不大。

保守motif基序分析发现，黄瓜3个FtsZs基因均含有M1、M2、M3、M4、M5、M7、M9、M10这8个基序，而M6和M8这2个基序只存在CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2中。

保守结构域分析发现，黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄的FtsZs都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain结构域，暗示了基因进化上的保守性。

2.4 黄瓜FtsZs基因的组织表达模式

RNA-seq数据显示（图3），3个黄瓜FtsZs基因在叶、茎、子房和雌花中表达量较高，推测其参与了叶、茎、子房和雌花的生长发育。其中，CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2在雌花和未受精子房中的表达量差异较大，暗示其在雌花和子房生长发育中发挥不同的功能。

荧光定量PCR结果显示，黄瓜CsFtsZ2-1基因在华北型黄瓜“9930”叶片、雄花和雌花中的表达量较高。

2.5 黄瓜FtsZs基因在生物胁迫和非生物胁迫下的表达谱

利用盐胁迫、高温处理、冷胁迫和白粉病菌侵染RNA-seq数据，分析了黄瓜FtsZs基因在胁迫下的响应情况。首先，我们分析了黄瓜FtsZs基因在盐胁迫下的表达情况，结果显示，NaCl处理后，黄瓜CsFtsZ2-1基因下调，表明该基因可响应盐胁迫；硅（Si）被认为是植物的第四大基本元素，可增强抗逆性并促进植物的生长发育。在仅用Si处理的条件下和外源盐加硅（NaSi）处理下，黄瓜FtsZs的表达量差异不大（图4）。

黄瓜FtsZs基因对高温处理响应结果表明（图5），高温处理3h和高温处理6h后，黄瓜中的3个FtsZs基因表达水平没有明显变化，这表明黄瓜中的3个FtsZs基因不响应高温胁迫。

黄瓜FtsZs基因对冷胁迫响应结果表明（图6），冷处理3h和12h后，黄瓜中3个FtsZs基因表达均上调，而冷处理24h后只有CsFtsZ2-1基因上调，这表明黄瓜中的3个FtsZs基因均可响应冷胁迫。

分析了黄瓜FtsZs基因对白粉病的响应情况，结果显示，在白粉病敏感株系D8中，接种白粉病后，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1的表达量显著提高，表明两者可响应白粉病病原菌侵染；在白粉病抗性株系SSL508-28中，接种白粉菌前后，黄瓜FtsZs的表达量差异不大（图7）。

3 讨论

迄今为止，在大多数的原核生物中均发现了FtsZ基因，并对其功能进行了深入的研究。相较于原核生物，真核生物中FtsZs基因的报道较少。本文在黄瓜、甜瓜、拟南芥和番茄中分别鉴定到了3～4个FtsZs基因，暗示了FtsZs基因数目在不同物种间具有高度的保守性。拟南芥3个FtsZs基因中最长的为3269bp，最短的为2050bp；黄瓜3个FtsZs基因中最长的为6264bp，最短的为4493bp；甜瓜3个FtsZs基因中最长的为13038bp，最短的为4410bp；番茄4个FtsZs基因中最长的为17560bp，最短的为6365bp，暗示着在不同物种之间FtsZs基因的结构存在差异性（表1）。本文鉴定到的13个FtsZs基因都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain两个保守的结构域，但是不同物种之间保守结构域的基序是有差异的，即使是同属于葫芦科的黄瓜和甜瓜，它们保守结构域的基序也不完全相同（图2），这就暗示了该基因在进化上既有保守性又存在差异性，进一步说明不同物种之间FtsZs基因功能可能不尽相同。

有研究发现，木薯中的MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2定位于叶绿体内［17］。将MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2在拟南芥中异源表达，可影响拟南芥叶肉细胞中的叶绿体分裂进而使叶绿体数量减少［17］；在拟南芥中抑制AtFtsZ1-1或AtFtsZ2-1的表达也会通过影响叶绿体分裂使成熟叶细胞中叶绿体的数量减少［18］。我们利用在线网站预测了黄瓜中3个FtsZs基因的亚细胞定位情况，发现它们在叶绿体或细胞质中有定位信号，推测它们在黄瓜的叶绿体中起作用（表1）。

已有的研究表明，在木薯中过表达MeFtsZ2-1基因会使木薯植株早开花，顶端分支明显增多，叶片变小且数量增多［17］。我们利用RNS-seq数据和荧光定量PCR技术分析发现，黄瓜中3个FtsZs基因在叶中都有较高表达，推测其在黄瓜叶中发挥重要功能（图3）。我们利用荧光定量PCR技术研究发现，CsFtsZ2-1在雄花和雌花中表达量也较高，推测CsFtsZ2-1也会影响花的发育（图3），但其具体作用机制还需要做深入的研究。

前人研究表明，在300mMNaCl胁迫下，木薯FtsZ2-1的转录水平先降低后升高，在NaCl胁迫4h时达到最低水平，在NaCl胁迫48h时达到最高水平［19］。本文结果显示，黄瓜FtsZ2-1基因在75mM盐处理下表达下调。除此之外，我们还发现黄瓜CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-1基因可响应冷胁迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可响应白粉病菌侵染，暗示着黄瓜FtsZs基因在盐胁迫、冷胁迫和白粉病抗性中发挥作用。

4 结论

本文在黄瓜中鉴定到3个FtsZs基因，基因结构分析发现黄瓜FtsZs基因长度为1266～1467bp，外显子数目为6～7个，氨基酸长度为421～488AA；保守结构域分析发现它们都含有Tubulindomain和FtsZ-Cdomain两个保守的结构域。组织表达特异性分析发现，FtsZs在黄瓜叶、茎、子房和雌花组织中表达量较高；CsFtsZ2-1基因可响应盐胁迫，CsFtsZ1、CsFtsZ2-1和CsFtsZ2-2可响应冷胁迫，CsFtsZ1和CsFtsZ2-1可响应白粉病病原菌侵染。