不同油茶品种间儿茶素含量差异及油茶炭疽病关系

关键词：油茶；儿茶素；抗病性

油茶（CamelliaoleiferaAbel.）为山茶科山茶属油用植物总称，常绿小乔木或灌木，与油橄榄（OleaeuropaeaL.）、椰子（CocosnuciferaL.）、油棕（ElaeisguineensisJacq.）并称为世界四大木本油料植物；其经济价值高，市场前景广阔，油茶具有保健、生态、食用等价值；其资源分布范围广，全国14个省份种植面积达302万hm2；油茶种质资源丰富，全国目前大面积种植且具有悠久栽培历史的油茶物种有13个，其中普通油茶分布最广、面积最大、品系最多［1］。油茶炭疽病（ColletotrichumgloeosporioidesPenz）病菌能造成油茶落叶、落果、严重时能使整株死亡，是油茶发病率最高的主要病害。儿茶素是组成茶多酚的一类主要的物质，约占茶多酚总量的65%～80%，具有抗病菌、抗氧化、预防癌症等效用［2］。儿茶素类化合物中含量大的主要有表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechingallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）4种，约占儿茶素类化合物70%［3］。儿茶素类化合物对油茶炭疽病等植物病原真菌具有良好的抑制效果［4］。油茶中的儿茶素单体化合物在油茶品种间差异、空间分布特征及病菌抑制情况尚不明确，相关研究甚少。儿茶素单体化合物在油茶无性系品质及抗病性方面的优质品系筛选上尚无研究结论，试验通过研究分析4种主要儿茶素单体化合物在油茶品种间差异及炭疽病害的关联性，为油茶无性系优质品系筛选提供全面评价，同时为儿茶素类化合物在油茶叶炭疽病害协同防治上提供思考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

实验材料为‘长林3号’‘长林4号’‘长林18号’‘长林27号’‘长林40号’‘长林53号’油茶枝条长短基本一致的顶部、中部、基部叶片，6月采摘于湖北省恩施天池岭。取样区域年平均气温18.5℃，平均海拔900m，日照时数1356h，无霜期年平均280d，年平均降水量1320mm，土壤为黄棕壤，油茶树龄8年。取样时每个品种随机重复3株，每株在枝条不同部位采集叶片15片。

表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）标准品均为色谱纯，购于上海源叶生物科技有限公司，甲醇（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司），冰乙酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），超纯水。DIONEXP680高效液相色谱仪（杭州康迪仪器设备有限公司），FA2004B电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司），HX-03超声波清洗器（武汉恒信世纪科技有限公司），DZKW-D-2电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 实验方法

儿茶素含量检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法（HPLC）等［5，6］，本实验采用采用GB/T8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》［7］，并对HPLC法测定儿茶素类含量的方法进行了调整。色谱柱C18（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃；流动相A：0.1%乙酸水，流动相B：0.1%乙酸甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1，流动相流速1.0mL/min，紫外检测波长：273nm，进样量10μL。

分别精密称取EC、EGC、ECG、EGCG各10.000mg，分别置于10mL容量瓶中，用超纯水配制成1mg/mL的对照品储备液，低温遮光保存。

将油茶叶片60℃风干并捣碎，过60目筛的油茶叶粉末准确称取0.5g置于试管中，加入10mL超纯水，70℃水浴锅中提取15min，待冷却后将上清液转移到15mL容量瓶，并定容到10mL，摇匀，过0.22μm微孔滤膜待测。

1.3 油茶叶炭疽病害统计方法

按照《茶炭疽病测报调查与防治技术规程》（DB34/T2055-2014），在实验样地‘长林3号’区块内采用对角线样线法随机确定一个基点，每隔10m选定1株油茶树，总共选5株。每株油茶树的东西南北随机选取一个枝条，每个枝条顶部、中部、基部随机取5片叶，共计300片叶，观察其感染炭疽病害情况并记录。‘长林4号’‘长林18号’‘长林27号’‘长林40号’‘长林53号’采取同样操作方式进行统计。

1.4 数据处理

数据采用IBMSPSSStatistics22版软件进行方差分析、相关性分析等工作，采用单因素方差分析（one-wayANOVA）、最小显著差数法（Least-SignificantDifference）进行多重比较差异显著性检验（Plt;0.5），Pearson相关度分析。采用WPSoffice2019进行试验数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 样品测定与分析

取供试品溶液10μL进样分析，每份样品重复3次并计算各种儿茶素单体化合物成分的均值含量，结果见表2。其相对标准差RSD均小于10%，数据稳定性较高。

种内不同叶位的4种儿茶素单体化合物进行显著性差异分析，其儿茶素单体化合物含量差异均达到显著水平（Plt;0.05）。

对6个长林系列油茶品种间4种儿茶素单体化合物进行显著性差异分析，除其中‘长林40号’与‘长林3号’、‘长林4号’、‘长林18号’的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）差异达到显著水平（P值分别为0.023、0.005、0.003），其他品种儿茶素单体化合物存在差异低，未达到显著水平。

4种主要儿茶素单体化合物在品种内的总含量和枝条不同位置的总含量如图1所示，油茶品种间4种主要儿茶素单体化合物总含量相差较大，其中‘长林4号’gt;‘长林18号’gt;‘长林3号’gt;‘长林53号’gt;‘长林27号’gt;‘长林40号’；长林4号’含量达到6500mg/kg，‘长林40号’含量低于4000mg/kg；品种内不同叶位4种儿茶素单体化合物总含量与枝条伸育度有关，呈现出枝条顶部gt;枝条中部gt;枝条基部。

不同油茶品种内4种儿茶素单体化合物含量如图2所示，其4种儿茶素单体化合物含量大小依次为EGCGgt;EGCgt;ECGgt;EC；其中酯型儿茶素类化合物（EGCG、ECG）含量整体高于非酯型儿茶素类化合物，尤以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量最高，如‘长林4号’EGC为603mg/kg、EGCG为988mg/kg、EC为244mg/kg、ECG为345mg/kg。

2.2 油茶叶片炭疽病害发生情况分析

通过样线法，对不同油茶品种叶片炭疽病叶片进行统计，依据标准《油茶炭疽病防治技术规程》（DB34/T2055-2014），计算油茶叶片炭疽病感病指数100×Σ（各级叶片数×各级代表值）（/调查总叶数×最高级代表值）。结果见图3，同一品种油茶叶片炭疽病感指数与叶位相关，呈现病感指数随枝条伸育程度逐渐增加的趋势；不同长林系油茶品种枝条基部叶片的感病指数明显高于枝条中部、顶部叶片；‘长林40号’叶片整体感病指数最高。

通过对不同油茶品种枝条同部位的叶片发病率进行单因素方差分析，结果见表3。不同油茶品种枝条基部叶片发病率存在显著性差异，其中‘长林40号’与多数品种出现显著性差异；枝条相同部位叶片发病率差异不显著的品种说明儿茶素对炭疽病真菌的抑制率处于相同的浓度区间内。

2.3 油茶叶炭疽病发病率与儿茶素相关性分析

对油茶品种与不同叶位叶片的儿茶素单体含量、叶片炭疽病发病率变量进行Pearson相关度分析，结果如表3-4种主要儿茶素含量与枝条叶位病害率成中高度负相关。其中酯型儿茶素单体化合物（EGCG、ECG）相关性极强。

3 讨论

实验通过高效液相色谱法，测出长林系6个油茶品种间4种主要儿茶素单体化合物（表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯）含量，其差异较大，据张贱根等［8］研究，儿茶素单体化合物含量与不同树种种质资源，季节变化、生长环境、叶片老嫩程度相关。本次实验叶片老嫩一致，采摘生长环境、时间相同，说明儿茶素单体含量差异与油茶种质有关。龙丹等［9］研究，儿茶素具有诸多医疗保健功能和一些特殊性质。所以将儿茶素类化合物作为优质油茶品系选育辅助指标具有参考作用。

据单体江等［10］研究发现，叶部病害是危害油茶的主要病害，普遍是真菌性、细菌性病害，主要包括炭疽病、软腐病等，严重时油茶落叶、落果，造成茶油减产和品质降低。茶多酚在植物抑菌抗病中具有重要作用，据汪金莲等［11，12］研究，发现茶多酚对植物真菌具有显著的抑制效果，茶多酚在一定范围内对真菌的抑制率与多酚溶液的浓度成正比，本实验表明儿茶素含量、叶片炭疽病的发病率与油茶枝条是呈线性关系的，但部分油茶品种同位置的差异无显著性，可能儿茶素的浓度区间有关。目前关于茶多酚抗菌作用的研究很广泛，但其作用机制的研究结果尚不十分清晰。但据曾亮等［13］、陈敏等［14］研究发现，在茶多酚中儿茶素单体物质（EGCG、EGC、ECG、EC）具有显著的抑菌效果。本实验揭示了油茶叶片病害率与4种主要儿茶素单体化合物含量成负相关性，相关性均在中度和高度以上，实验对4种主要儿茶素单体化合物与油茶叶片炭疽病发病率之间的关联性作出初步评价，同时对油茶品种间枝条不同部位的儿茶素含量、叶片炭疽病发病率差异进行显著性分析，表明油茶枝条基部叶片的儿茶素含量可为油茶抗病品系选育提供参考。

实验发现不同油茶品种中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量远高于其他4种主要儿茶素单体化合物，这与黄彪等［15］研究发现一致，即表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）约占儿茶素类化合物总量的50％以上。据Ara－kawa等［16］发现，茶多酚的抗菌作用机理可能是EGCG与活性氧反应生成的过氧化氢，据Yanagawa等［17］发现，EGCG能显著提高药品抗菌活性，华德兴等［18］研究发现，EGCG和ECG能使苯唑西林抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的效果增强。肖波等［19］研究，多酚与维生素c配合使用对幽门螺杆菌抑制效果明显。实验发现酯型儿茶素类化合物（EGCG、ECG）含量与不同油茶品种叶片病害率相关度极强，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）相关系数整体最高，这说明油茶叶片抗病能力与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）抑菌浓度及活性明显有关。据葛建等［20］发现，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在抗癌、抗氧化、心脑血管保护、神经系统以及内分泌等方面作用突出，研究相对广泛且深入。所以在油茶品质及抗性评价中，酯型儿茶素单体化合物（EGCG、ECG）作为突出指标，能快速在油茶优质品系和抗病能力上做出初步评价。

实验结果显示4种主要儿茶素单体化合物含量与油茶叶片在枝条空间分布上相关，这与张澜等［21］研究一致，枝条顶端嫩叶含量高于枝条基部老叶的含量，也说明儿茶素单体化合物含量与叶片成熟度有关。据晏秀梅等［22］研究发现，茶多酚与茶皂素两者联合使用时具有协同抑菌效果。据陈书媛等［23］研究表明，儿茶素类化合物能与多种抗生素产生协同抑菌作用。本实验在油茶儿茶素类化合物与不同药品的协同防治效果，针对不同树龄用药浓度上提供了研究新思路，为油茶抗病性机理研究提供了新方向。

4 结论

本研究系统评价了4种主要儿茶素单体化合物（EC、EGC、ECG、EGCG）与油茶叶片病害在油茶长林系品种中的空间分布特征，分析了4种主要儿茶素单体化合物在不同油茶品种间差异性及油茶病害的相关性。研究发现EC、EGC、ECG、EGCG在不同油茶品种间存含量相差较大，儿茶素单体化合物与油茶叶片病害率在枝条空间上成中高度负相关。结果表明4种主要儿茶素单体化合物在油茶抗病性评价的参考作用，为油茶优质品系筛选提供参考依据。结果表明，酯型儿茶素类化合物（EGCG、ECG）可作为突出性指标，为油茶抗病能力做出快速初步评价。实验结果在不同环境下是否具有一般性还需进一步探讨。为油茶病害协同防治筛选高效药品及抗病机理研究提供思路。