棉花凝集素类受体蛋白激酶基因GhLecRK1响应棉蚜危害的功能分析

摘要：【目的】克隆棉花（Gossgpiumhirsutum）凝集素类受体蛋白激酶（LecRK1）基因GhLecRK 分析其在响应棉蚜危害中的功能，为培育棉花抗蚜新品种提供理论参考。【方法】在棉蚜诱导的棉花叶片全转录组测序数据分析基础上，克隆响应棉蚜危害的GhLecRK1基因，并对其序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR检测GhLecRK1基因在棉蚜诱导下的表达模式，运用瞬时过表达技术研究其在棉花对棉蚜防御响应中的功能。【结果】GhLecRK1基因开放阅读框（ORF）长度1233 bp，编码410个氨基酸残基，理论等电点（pI）8.36，预测蛋白质分子量45948 Da，由具有1个α-甘露糖凝集素结合结构域、1个S-糖蛋白结构域（SLG）和1个纤溶酶原/苹果/线虫结构域（PAN）组成，属G型凝集素类受体蛋白激酶。同源序列比对分析结果表明，GhLecRK1与其他植物的G型LecRLKs序列具有高度相似性（94.39%）。系统发育分析结果表明，GhLecRK1与Gossypium raimondii的Gr012449778.1亲缘关系最近。在棉蚜取食诱导后24、48和72 h的棉花植株的子叶、根、茎中GhLecRK1基因的表达量均有不同程度上调，但是仅有子叶在棉蚜取食24 h时GhLecRK1基因相对表达量显著上调（P<0.05，下同）。选择性和非选择性试验结果显示，瞬时过表达GhLecRK1基因棉花上棉蚜的数量均少于WT植株和pMD植株，且在取食48 h时过表达GhLecRK1基因棉花上棉蚜蜜露的分泌量显著减少。【结论】GhLecRK1基因响应棉花对棉蚜的防御反应，GhLecRK1基因过量表达后可增强棉花对棉蚜的抗性。

关键词：棉花；GhLecRK1基因；抗蚜性；瞬时过表达

中图分类号：S435.622.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）07-2116-10

Functional analysis of cotton lectin receptor-like kinase geneGhLecRK1 in response to damage caused byAphis gossypii Glover

HE Hua CHU Long-yan LI Jian-ping ZHANG Jian-min ，YU Yong-hao3*

（1School of Landscape and Horticulture，Wuhan University of Bioengineering，Wuhan，Hubei 430415，China；2College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434000，China；3Guangxi Key Laboratory ofBiology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007，China）

Abstract：【Objective】To clone cotton（Gossypium hirsutum）lectin receptor-like kinase（LecRK1）gene GhLecRK1 and analyze its function in the response to Aphis gossypii Glover damage，so as to provide theoretical reference for breeding new cotton varieties resistant to aphids.【Method】Based on the analysis of whole-transcriptome sequencing data of cotton leaves induced by A.gossypii，GhLecRK1 gene which responded to A.gossypii damage was cloned and its sequence was analyzed through bio-information method.Real-time fluorescence quantitative PCR was usea4O9ynRv5ycaRycS90UY9yRo29iBO+Wokbp0ma64S6E=d to measure GhLecRK1 gene expression pattern under the induction of cotton aphids.Transient overexpression technique was utilized to study its func-tion in cotton defense response to cotton aphids.【ResultabS5FHLh4elZBfHiCfnWIW3vKDrWEd+ztJYXOcz0rAA=】The open reading frame（ORF）of GhLecRK1 gene was made upof 1233 bp and encoded 410 amino acid residues.The theoretical isoelectric point（pI）was 8.36，and the predicted mo-lecular weight of GhLecRK1 protein was 45948 Da.GhLecRK1 protein was consisted of oneα-mannose lectin binding do-main，one S-glycoprotein domain（SLG），and one plasminogen/apple/nematode domain（PAN），therefore，it was a G-type lectin receptor-like kinase.Homologous sequence analysis showed that GhLecRK1 had high sequence similarity（94.39%）with G-type LecRLKs sequences from other plants.Phylogenetic analysis of indicated that GhLecRK1 was most closely related to Gr012449778.1 from Gossypium raimondii.The expressions of GhLecRK1 gene in the cotyledon，root and stem in cotton plants at 24 h，48 h and 72 h after A.gossypii feeding were up-regulated to varying degrees，butthe relative expressio of GhLecRK1 gene only significantly increased in the cotyledon at 24 h after A.gossypii feeding（P<0.05，the same below）.In addition，the results of selective and non-selective tests showed that the number of A.gossypii on transiently overexpressed GhLecRK1 gene cotton plants was less than those on WT plants and pMD plants respec-tively，and the amount of honeydew secreted by A.gossypii in overexpressed GhLecRK1 gene cotton plants was signifi-cantly reduced at 48 h after A.gossypii feeding.【Conclusion】GhLecRK1 gene responds to cotton defense response to A.gossypii.When GhLecRK1 gene is overexpressed in cotton plants，the resistance of cotton to A.gossypii is enhanced.

Key words：cotton；GhLecRK1 gene；aphid resistance；transient overexpression

Foundation items：General Project of National Natural Science Foundation of China（32372561）；New Agricultural Research and Reform Practice Project of Ministry of Education（Jiaogaotinghan〔2020〕20）

0引言

【研究意义】棉花（Gossypium hirsutum）是重要的纤维作物和油料作物，在我国国民经济生产中占据十分重要的地位（王业举等，2023）。随着Bt棉的推广使用，作为靶标害虫的棉铃虫［Helicoverpaarmigera（Hübner）］和棉红铃虫［Pectinophoragos-sypiella（Saunders）］等鳞翅目害虫虽然得到有效控制，但棉蚜（Aphis gossypii Glover）等刺吸式口器害虫却呈加重发生趋势（陆宴辉等，2020；明坤和闫硕，2020）。作为棉花的重要害虫之一，棉蚜不仅可吸取植物汁液造成直接危害，还可分泌蜜露引发煤污病以及传播病毒病造成间接危害，从而严重威胁棉花的安全生产（Shrestha and Parajulee，2013）。目前，棉蚜的防治主要依靠化学防治，但化学防治常会导致“3R”问题，因而棉蚜的绿色防控正逐步受到研究者的广泛重视（龙同等，2023）。利用植物的抗虫性防治棉蚜是一种环境友好型的害虫防治方式，符合植物保护“预防为主，综合防治”的战略方针和我国“减肥减药”的两减政策，在棉蚜的绿色防控中占据十分重要的地位（张海娜等，2015；杨彩峰等，2017；范元兰等，2020）。因此，不断挖掘棉花抗虫基因资源，对于利用棉花抗虫性防治棉蚜具有重要意义。【前人研究进展】植物凝集素类受体蛋白激酶（Lectinreceptor-like kinases，LecRLKs）是受体蛋白激酶（Receptor-like kinases，RLKs）家族中的一个亚族，是指含有1个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域蛋白（王梦龙等，2020）。LecRLKs主要由3部分组成，包括胞外区（含凝集素结构域）、跨膜区和胞内区（含近膜区和激酶结构域），其中胞外凝集素结构域可特异性可逆识别并结合胞外信号分子（王梦龙等，2020）。基于胞外区凝集素结构域多样性，LecRLKs被分为G型、L型和C型3种。L型和G型为植物特有类型，而C型存在于动物和植物中（Vaidetal.，2013）。近年来，越来越多的研究表明LecRLKs在植物的多个生物学过程中发挥重要作用。首先，LecRLKs可参与调控植物的生长发育。如水稻LecRK5可通过磷酸化UGPase调控花粉发育过程中胼胝质的生物合成（Wang et al.，2020）；L型凝集素类受体蛋白激酶AP1可在水稻花粉成熟过程中促进淀粉积累（He etal.，2021）；水稻的凝集素类受体蛋白激酶OsSRK1可通过调控水稻节间伸长来调控水稻植株高度（Li etal.，2022）。其次，Lec-RLKs在植物应对各种非生物胁迫过程中扮演着重要角色。如拟南芥LecRK-b2在种子萌发过程中是ABA响应的正向调节因子，并参与种子发育早期的盐胁迫和渗透胁迫响应（Deng et al.，2009）；来自南极苔藓（Pohlia nutans）的L型凝集素类受体蛋白激酶PnLecRLK1能增强拟南芥对低温胁迫的耐受性和脱落酸敏感性（Liu et al.，2017）；樱桃凝集素类受体蛋白激酶PaLectinL16可增强甜樱桃抗盐胁迫能力（Sun et al.，2022）。同时，LecRLKs可调节植物对病害胁迫的响应。如水稻的B型凝集素类受体Pi-d2可调控水稻对稻瘟病真菌病原体Magna-porthe grisea的抗性（Chen et al.，2006）；马铃薯的StLecRK-IV.1可通过影响正调节因子StTET8的稳定性负向调控土豆对晚疫病抗性（Guo et al.，2022）；烟草的G型凝集素类受体蛋白激酶NbERK1可与CERK1/LYK4形成复合体来增强烟草对真菌病原体核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性（Pi et al.，2023）。此外，LecRLKs还可同时扮演多种角色。如水稻的G型凝集素类受体蛋白激酶PWL1可调节叶片衰老和耐热性，同时负调控水稻对黄单胞菌（Xan-thomonas oryzae）的抗性（Xu et al.，2023）。除以上功能外，LecRLKs还可调节植物对害虫的胁迫响应。如对烟草凝集素类受体蛋白激酶1（LecRK1）的研究发现，LecRK1是抑制烟草天蛾（Manduca sexta）引发的水杨酸（Salicylic acid，SA）积累机制的一个元件，通过LecRK1抑制SA暴发可以不受约束地诱导茉莉酸（Jasmonic acid，JA）介导烟草的防御反应（Bonaventure et al.，2011；Gilardoni et al.，2011）；水稻凝集素类受体蛋白激酶基因簇Bph3（编码3个凝集素受体蛋白激酶）对水稻重要害虫褐飞虱具有持久的抗性（Liu et al.，2015）；拟南芥的凝集素类受体蛋白激酶LecRK-I.8与拟南芥对菜粉蝶卵的感知有关（Gouhier-Darimontetal.，2019）。目前关于LecRLKs调控植物对蚜虫抗性的研究尚未见报道。【本研究切入点】本课题组前期在对棉蚜诱导的棉花叶片转录组测序数据分析中发现受棉蚜诱导上调的棉花凝集素类受体蛋白激酶基因GhLecRK1（Zhong et al.，2022），推测其参与棉花对棉蚜的防御响应。但GhLecRK1在棉花对棉蚜防御响应中的具体功能尚未见报道。【拟解决的关键问题】通过PCR技术获得GhLecRK1基因完整开放阅读框（ORF）序列，利用生物信息学软件对其进行分析，采用实时荧光定量PCR检测GhLecRK1在棉蚜诱导下棉花不同组织中的表达水平，运用瞬时过表达技术获得GhLecRK1瞬时过表达棉花植株，分析GhLecRK1在棉花抗蚜性中的功能，为探究GhLecRK1在棉花对棉蚜防御响应的作用机制和培育棉花抗蚜新品种提供理论参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试棉花材料为陆地棉（G.hirsutum）众吉星7号，其种子由长江大学农学院作物育种学实验室提供；主要试剂：pMD18T cloning vector、限制性内切酶Xba I和BamH I、SYBR®PremixDimerEraserTM（Perfect Real Time）购自TaKaRa公司（日本）；Spec-trumTM Plant Total RNA Kit、Gel Extraction Kit（200）、E.Z.N.A.®Plasmid Mini Kit I购自OMEGA公司（美国）；DNA测序及各类引物合成均由武汉华大基因科技有限公司完成；大肠杆菌DH5α感受态细胞和pMD植物过量表达载体由长江大学昆虫分子生物学实验室提供。主要仪器设备包括PCR仪（Eppendorf，德国）、5424R高速冷冻低温离心机（Eppendorf，德国）、实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）等。

1.2试验方法

1.2.1棉花种植和棉蚜饲养棉花种子用无菌水浸泡1 d至露白，然后播种在充满营养土的塑料盆（直径9 cm）中，种植后8 d的幼苗用于农杆菌菌液注射，14 d左右叶片完全展开的幼苗用于GhLecRK1表达谱检测。试验所用棉蚜采自长江大学试验棉田，在室内用Coker 312棉花进行继代饲养，饲养温度25℃，相对湿度70%，光周期（光照∶黑暗）16 h∶8 h。供试棉蚜均为刚羽化的棉蚜成虫。

1.2.2 GhLecRK1基因克隆使用RNA提取试剂盒SpectrumTM Plant Total RNA Kit提取被棉蚜取食48 h后的棉花叶片总RNA，经DNA酶消化后反转录合成cDNA作为PCR模板，所用试剂（用量）：RNA（5.0µL，约2µg）、oligo（dT）15 primer（1.0µL）、1%DEPC ddH2O（10.5µL）、M-MLV 5×Re-action buffer（5.0µL）、dNTP mixture（2.0µL）、Re-combinant RNase Inhibitor（1.0µL）、M-MLV RNase（0.5µL）。根据棉蚜诱导的棉花叶片的转录组测序结果获得GhLecRK1的ORF序列设计引物，其中上游引物为GhLecRK1-F（5'-GCTCTAGAATGAATCCTGTTTTA TGGCTTC-3'）、下游引物为GhLecRK1-R（5'-TAGG ATCCTTACCTCGCATCCATCAAATCT-3'）以上述cDNA为模板进行PCR扩增GhLecRK 反应体系15.0µL：cDNA模板0.5µL，上、下游引物各0.5µL，2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 7.5µL，ddH2O 6.0µL。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃2 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物电泳后使用Gel Extraction Kit切胶回收，然后连接克隆载体pMD18T转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，PCR检测获得阳性克隆后摇菌送武汉华大基因科技有限公司测序。

1.2.3 GhLecRK1基因蛋白序列的生物信息学分析利用生物软件Lasergen 7.0分析GhLecRK1的相对分子质量、理论等电点（pI）和疏水性等理化性质。在NCBI中利用BLASTp对GhLecRK1进行同源搜索，获得GhLecRK1的同源序列，利用DNAman 7.0进行序列比对，使用MEGA 7.0构建GhLecRK1与其他植物凝集素类受体蛋白激酶的系统发育进化树。利用网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对测序序列进行结构域分析。

1.2.4棉蚜诱导下GhLecRK1基因在棉花组织中的表达谱测定选取生长14 d长势一致的供试棉花植株，每株接种50头刚羽化的棉蚜成虫，对照植株不接棉蚜（CK）。待棉蚜分别取食24、48和72 h时，分别采取棉花的子叶、真叶、根和茎，提取总RNA后反转录合成cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。GhLecRK1的实时荧光定量PCR上游引物序列为5'-ATGACCCTCAGTTATG-3'、下游引物序列为5'-T CATCCCGACACAAG-3'。内参基因为GhUBI 其上游引物序列为5'-CTGAATCTTCGCTTTCACCGT TATC-3'、下游引物序列为5'-GGGATGCAAATCTT CGTGAAAAC-3'。以SYBR Green为荧光染料进行实时荧光定量PCR检测。反应体系20.0μL：cDNA模板0.5μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.3μL，ddH2O 8.9μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃10 s，53℃30 s，65℃5 s，95℃50 s，进行39个循环。每处理4次重复，每个生物学样品重复4次。采用2-ΔΔCt法计算不同诱导处理下GhLecRK1基因的相对表达量（Livak and Schmitt-gen et al.，2001）。

1.2.5 GhLecRK1基因过表达载体的构建及转化

从含pMD18T-GhLecRK1（含Xba I和BamH I酶切位点）菌液提取质粒，用限制性内切酶Xba I和BamH I分别双酶切pMD18T-GhLecRK1质粒和pMD质粒，然后将GhLecRK1基因片段与切开的pMD进行连接反应转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后摇菌提取质粒pMD-GhLecRK1。采用热激法将质粒pMD-GhLecRK1转化到农杆菌GV3101感受态细胞，获得阳性克隆后摇菌。

1.2.6 GhLecRK1基因在棉花叶片中的瞬时表达

采用子叶注射的方法实现GhLecRK1在棉花植株中的瞬时过表达。吸取200μL保存的含有pMD-GhLecRK1的农杆菌菌液至50 mL LB液体培养基中（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平），28℃下180 r/min摇菌至菌液吸光度为0.5（波长600nm）。然后4000r/min离心5min，去上清液后用含100μmol/L的乙酰丁香酮与10 mmol/L MgSO4的MS侵染液悬浮菌体。选取生长8 d长势一致的棉花子叶，蒸馏水清洗叶片背面，75%酒精擦拭，再用蒸馏水清洗残留乙醇，用1 mL注射器吸取侵染液进行子叶背面注射。将注射的棉花植株放入25℃、光周期为16 h∶18 h的培养箱中培养，分别在注射24、48和72 h后采取棉花子叶提取总RNA，然后反转录合成cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。以棉花管家基因GhUBI1作为内参基因进行实时荧光定量PCR检测菌液注射后GhLecRK1基因在棉花叶片中的瞬时表达水平。反应体系20.0μL：cDNA模板0.5μL，qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.5μL，ddH2O 8.5μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃10 s，53℃30 s，65℃5 s，95℃50 s，进行39个循环。

1.2.7瞬时过表达GhLecRK1基因对棉花抗蚜性的影响

1.2.7.1选择性试验分别在菌液注射24、48和72 h后剪取棉花植株叶片（pMD-GhLecRK1植株、pMD植株和WT植株）放入直径为15 cm的培养皿内部边缘，皿底平铺1层滤纸，用含有MS营养液的棉球包裹子叶叶柄保湿。选取15头生长一致的刚羽化棉蚜成虫置于培养皿中央，24 h后观察记录不同叶片上的棉蚜数量。以pMD植株和WT植株为对照组，每组重复4次。

1.2.7.2非选择性试验取菌液注射后24、48和72 h的棉花植株（pMD-GhLecRK1植株、pMD植株和WT植株），每株接入15头生长一致的刚羽化棉蚜成虫，24 h后观察记录不同叶片上的棉蚜数量，以pMD植株和WT植株为对照组，每组重复4次。

1.2.7.3棉蚜蜜露试验选取注射后叶片完整的pMD-GhLecRK1植株、pMD植株和WT植株各4株，每株棉花叶片上接种30头生长一致的刚羽化棉蚜成虫；在棉花植株下平铺1层滤纸收集棉蚜的蜜露，分别在棉蚜取食24、48和72 h后取下滤纸，并更换新滤纸。试验中种植棉花植株的塑料盆用保鲜膜包裹以防止土壤中的水分将滤纸打湿。收集的滤纸浸入含0.1%（w/v）茚三酮的丙酮溶液中，然后放置在烘箱中烘干处理30 min，烘干后滤纸上的蚜虫蜜露呈现紫色斑点。为了更准确地测量蜜露量，将滤纸上的紫色蜜露剪下，撕成碎片，放入1 mL 90%（v/v）甲醇溶液中，4℃下提取染色1h，期间连续搅拌。待提取结束后，放入离心机中，7500 r/min离心2min收集上清液，测量上清液在500 nm处的吸光度，以90%甲醇为空白对照（Hu etal.，2023）。

2结果与分析

2.1 GhLecRK1基因的克隆与序列分析结果

GhLecRK1基因ORF序列通过棉蚜诱导的棉花叶片的全转录组测序获得。以该序列为参考设计引物，以棉花叶片的cDNA为模板进行PCR，然后连接克隆载体pMD18T转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后测序，结果显示与转录组测序获得的序列一致。序列分析显示，GhLecRK1 ORF长度1233 bp（图1-A）。GhLecRK1蛋白编码410个氨基酸残基，理论等电点（pI）8.36，预测蛋白质分子量45948 Da。对GhLecRK1蛋白序列进行结构域预测，结果显示，GhLecRK1含有1个α-甘露糖凝集素结合结构域、1个S-糖蛋白结构域（SLG）和1个纤溶酶原/苹果/线虫结构LGXUV1wuXJe0zMnTw03hoM1bmIAY57ReP+xiLkWBJik=域（PAN），符合G型凝集素类受体蛋白激酶的结构特征（图1-B）。

2.2棉花GhLecRK1蛋白系统进化分析结果

使用NCBI中的BLASTp对GhLecRK1基因的预测蛋白序列进行同源检索，获得与GhLecRK1蛋白序列同源的植物序列。然后分别用DNAMAN 7.0和MEGA 7.0对所获得的同源序列进行序列比对和构建系统发育进化树。同源序列比对分析表明，GhLecRK1与其他植物的G型LecRLKs具有高度序列相似性（94.39%）（图2-A）。GhLecRK1及其他植物LecRLKs蛋白的系统发育分析显示，GhLecRK1与Gossypium raimondii的Gr012449778.1亲缘关系最近（图2-B）。

2.3 GhLecRK1基因在棉蚜诱导下的表达水平

为了解GhLecRK1基因在棉花防御棉蚜作用中的角色，分别检测棉蚜诱导不同时间下棉花根、茎、子叶、真叶中GhLecRK1的表达水平。结果显示，与对照相比，当棉蚜取食棉花植株24 h时，子叶中GhLecRK1基因相对表达量显著增加（P<0.05，下同），但48和72 h时无显著差异（P>0.05，下同）（图3-A）；GhLecRK1在真叶中不同时间点的相对表达量与对照相比均有所下调，但差异未达显著水平（图3-B）；与对照相比，GhLecRK1在根和茎中的相对表达量在不同时间点时均有不同程度上调，但差异均未达显著水平（图3-C和图3-D）。

2.4 GhLecRK1基因在棉花叶片中的瞬时过表达分析结果

将构建的过表达载体pMD-GhLecRK1通过农杆菌介导法注射到棉花子叶中，在菌液注射24、48和72 h后通过实时荧光定量PCR检测GhLecRK1在棉花子叶中的表达水平。结果（图4）显示，瞬时过表达GhLecRK1基因棉花子叶中菌液注射24h时表达水平极显著高于对照（WT植株和pMD植株）（P<0.0 下同），为对照的100多倍；随着时间的推移，GhLecRK1的表达水平逐渐下降，但与对照相比仍达极显著水平。

2.5瞬时过表达GhLecRK1基因对棉花抗蚜性的影响

选择性试验分析结果显示，pMD-GhLecRK1棉花植株上棉蚜的数量在菌液注射24和48 h后分别显著低于WT植株和pMD植株（图5-A）。非选择性试验结果显示，pMD-GhLecRK1植株叶片上棉蚜数量在菌液注射后24和48 h后显著低于WT植株和pMD植株（图5-B）。综上结果表明，GhLecRK1在棉花植株中的瞬时过表达能提升棉花对棉蚜的抗性。

2.6瞬时过表达GhLecRK1基因对棉蚜分泌蜜露的影响

蜜露分泌量在一定程度上可反应棉蚜的取食情况。棉蚜蜜露显色反应分析结果（图6-A）显示，菌液注射后24和48 h时pMD-GhLecRK1植株叶片下滤纸上紫色蜜露点少于对照pMD植株和WT植株。棉蚜蜜露量化分析显示在48 h时pMD-GhLecRK1植株叶片下滤纸上紫色蜜露OD500 nm显著低于对照pMD植株及WT植株（图6-B）。

3讨论

植物在长期的进化过程中为了应对各种外界环境条件演化出一系列识别和传递信号的蛋白分子，其中比较典型的是植物细胞质膜上的RLKs，而Lec-RLKs是类受体蛋白激酶家族的重要成员（王梦龙等，2020）。作为重要的纤维和油料作物，棉花LecRLKs研究报道仅见于Phillips等（2013）鉴定和克隆的GhLecRK- 表达分析显示GhLecRK-2在棉花响应黄萎病菌感染时显著上调，但关于棉花LecRLKs调控棉花抗虫性研究尚未见报道。故本研究在棉蚜诱导的棉花转录组测序分析基础上克隆了棉花基因GhLecRK 其编码410个氨基酸残基，含有“-甘露糖凝集素结合结构域、SLG结构域和PAN结构域。此外，GhLecRK1与其他植物的G型LecRLKs序列具有高度相似性，与Gossypium raimondii的Gr012449778.1亲缘关系最近。基于以上结果，推断其为G型凝集素类受体蛋白激酶。

植物凝集素类受体蛋白激酶基因在不同的生物胁迫下表达水平存在差异。如拟南芥的LecRK-I.8在拟南芥对菜粉蝶产卵的响应中上调表达（Gouhier-Darimontetal.，2019），但马铃薯StLecRK-IV.1在对晚疫病的响应中下调表达（Guo et al.，2022）。同一植物不同的凝集素基因在同种生物胁迫下其表达水平不同，如感染番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）7 d后，番茄的SlyLecRLKs007、SlyLecRLKs036、SlyLec-RLKs044、SlyLecRLKs047和SlyLecRLKs080基因的相对表达量显著降低，但SlyLecRLKs090的表达在TYLCV感染植株和未感染植株间无显著差异（Zhao et al.，2018）。本研究中，在棉蚜取食棉花植株24h时子叶中GhLecRK1基因表达量显著增加，初步暗示GhLecRK1基因的表达水平与棉蚜的诱导呈正相关，这一结果与同为半翅目昆虫褐飞虱对水稻基因OsLecRK1、OsLecRK12和OsLecRK13的诱导表达水平趋势一致（Liu et al.，2015）。

植物凝集素类受体蛋白激酶在调节植物生长发育及应对各种非生物胁迫和生物胁迫中扮演着重要角色（王梦龙等，2023；Upadhyay and Shumayla，2023）。虽然其调控植物抗虫性的研究相对较少，但其调控植物抗虫性的研究正逐步深入。如烟草LecRK1可诱导JA介导的烟草防御反应（Bonaven-ture et al.，2011；Gilardoni et al.，2011）、水稻凝集素类受体蛋白激酶基因簇Bph3（OsLecRK1、OsLecRK12和OsLecRK13）对褐飞虱具有持久抗性（Liu et al.，2015）、拟南芥LecRK-I.8参与拟南芥对菜粉蝶卵的感知（Gouhier-Darimontetal.，2019）。从以上研究可知，植物凝集素类受体蛋白激酶可正向调控植物的抗虫性。本研究通过选择性试验和非选择性试验对GhLecRK1基因在棉花上对棉蚜防御响应中的功能进行了验证，结果表明，瞬时过表达GhLecRK1棉花植株上棉蚜的数量均少于WT植株和pMD植株，且在48 h时取食过表达GhLecRK1棉花的棉蚜蜜露分泌量显著减少，暗示GhLecRK1可以正向调控棉花对棉蚜的抗性，与现有植物凝集素类受体蛋白激酶对害虫的抗虫性研究结果一致。

在长期的植物与蚜虫协同进化过程中，植物形成了精细而复杂的信号网络来调控植物对蚜虫的抗性（杨珍等，2019；Shih etal.，2023）。如GhCalS5通过促进胼胝质形成参与棉花对棉蚜的防御反应（Sanabrietal.，2012）；棉花基因GhMYB18可通过调控SA和类黄酮的合成来提高棉花对棉蚜的抗性（Hu etal.，2023）；GhMYC1374通过介导黄酮类和游离棉酚合成调控棉花对棉蚜的防御反应（Zhang et al.，2023）。本研究虽然明确了GhLecRK1正向调控棉花对棉蚜的抗性，但其精细调控棉花对棉蚜的防御响应机制有待进一步探究。

4结论

GhLecRK1基因响应棉花对棉蚜的防御反应，当过表达GhLecRK1后，棉花对棉蚜的抗性增强，表明GhLecRK1可正向调控棉花对棉蚜的抗性。

参考文献（References）：

范元兰，陈敏，王其刚，张颢，邱显钦.2020.植物蚜虫及其抗性研究进展［J］.江苏农业科学，48（14）：33-44.［FanY L，Chen M，Wang Q G，Zhang H，Qiu X Q.2020.Research progress of plant aphids and their resistance［J］.Jiangsu Agricultural Sciences，48（14）：33-44.］doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.14.006.

龙同，郑文廉，秦鸿德，别墅，廖先清，万中义，罗小康.2023.江汉平原棉花病虫害绿色防控策略［J］.湖北植保，（2）：73-77.［Long T，Zheng W L，Qin H D，Bie S，Liao X Q，Wan Z Y，Luo X K.2023.Green prevention and control strategies for cotton diseases and pests in the Jianghan Plain［J］.Hubei Plant Protection，（2）：73-77.］doi：10.3969/j.issn.1005-6114.2023.02.025.

陆宴辉，梁革梅，张永军，杨现明.2020.二十一世纪以来棉花害虫治理成就与展望［J］.应用昆虫学报，57（3）：477-490.［Lu Y H，Liang G M，Zhang Y J，Yang X M.2020.Advances in the management of insect pests of cotton in China since the 21st century［J］.Chinese Journal of Applied Entomology，57（3）：477-490.］doi：10.7679/j.issn.2095-1353.2020.054.

明坤，闫硕.2020.近几年我国棉花主要病虫害发生及防控情况分析［J］.棉花科学，42（3）：13-19.［Ming K，Yan S.2020.Analysis of the occurrence and control of cotton main di-seases and pests in China in recent years［J］.Cotton Scien-ces，42（3）：13-19.］doi：10.3969/j.issn.2095-3143.2020.03.002.

王梦龙，骆素微，李晓诗，彭小群.2023.植物凝集素类受体激酶参与非生物胁迫响应的研究进展［J］.广西植物，43（11）：2159-2169.［Wang M L，Luo S W，Li X S，Peng X Q.2023.Research advances on plant lectin-like receptor kinases in abiotic stress response［J］.Guihaia，43（11）：2159-2169.］doi：10.11931/guihaia.gxzw202302002.

王梦龙，彭小群，陈竹锋，唐晓艳.2020.植物凝集素类受体蛋白激酶研究进展［J］.植物学报AdHlgu6Z8feh7dPF7k6/k5DOrzEBrWSMXFYUSIFGD7s=，55（1）：96-105.［Wang M L，Peng X Q，Chen Z F，Tang X Y.2020.Research advances on lectin receptor-like kinases in plants［J］.Chi-nese Bulletin of Botany，55（1）：96-105.］doi：10.11983/CBB19130.

王业举，张虎，张博，常玉杰，高文举，耿世伟，陈琴，陈全家.2023.235份陆地棉表型性状遗传多样性分析［J］.江苏农业学报，39（3）：636-644.［Wang Y J，Zhang H，Zhang B，Chang Y J，Gao W J，Geng S W，Chen Q，Chen Q J.2023.Genetic diversity analysis of 235 upland cotton mate-rials phenotypic traits［J］.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，39（3）：636-644.］doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.03.003.

杨彩峰，李刚强，王楠，许芳芳，郭文芳，刘德虎.2017.抗蚜基因在棉花育种中的潜在应用［J］.植物学研究，6（3）：124-133.［Yang C F，Li G Q，Wang N，Xu F F，Guo W F，LiuD H.2017.Potential application of aphid resistance gene in cotton breeding［J］.Botanical Research，6（3）：124-133.］doi：10.12677/br.2017.63017.

杨珍，钟肖，冯佩，马琪琪，苏奇，王香萍，张建民.2019.植物对蚜虫危害的防御响应研究进展［J］.山东农业科学，51（2）：167-172.［Yang Z，Zhong X，Feng P，Ma Q Q，Su Q，Wang X P，Zhang J M.2019.Advances in research of plant defense response to aphid attack［j］.Shandong Agri-cultural Sciences，51（2）：167-172.］doi：10.14083/j.issn.1001-4942.2019.02.032.

张海娜，钱玉源，刘祎，王广恩，崔淑芳，金卫平，李俊兰.2015.蚜虫防治研究概况及在棉花上的应用［J］.农学学报，5（8）：36-39.［Zhang H N，Qian YY，Liu Y，Wang G E，Cui S F，Jin W P，Li J L.2015.Research survey on aphid control and its application in cotton［J］.Journal of Agricul-ture，5（8）：36-39.］

Bonaventure G.2011.The Nicotiana attenuata LECTIN REC-EPTOR KINASE 1 is involved in the perception of insect feeding［J］.Plant Signaling&Behavior，6（12）：2060-2063.doi：10.4161/psb.6.12.18324.

Chen X W，Shang J J，Chen D X，Lei C L，Zou Y，Zhai W X，Liu G Z，Xu J C，Ling Z Z，Cao G，Ma B T，Wang Y P，Zhao X F，Li S G，Zhu L H.2006.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance［J］.The Plant Journal，46（5）：794-804.doi：10.1111/j.1365-313X.2006.02739.x.

Deng K Q，Wang Q M，Zeng J X，Guo X H，Zhao X Y，Tang D Y，Liu X M.2009.A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response［J］.Journal of Plant Biology，52：493-500.doi：10.1007/s 12374-009-9063-5.

Gilardoni P A，Hettenhausen C，Baldwin I T，Bonaventure G.2011.Nicotiana attenuata LECTIN RECEPTOR KINASE1suppresses the insect-mediated inhibition of induced de-fense responses during Manduca sexta herbivory［J］.ThePlant Cell，23（9）：3512-3532.doi：10.1105/tpc.111.088229.Gouhier-Darimont C，Stahl E，Glauser G，Reymond P.2019.

The Arabidopsis lectin receptor kinase LecRK-I.8 is in-volved in insect egg perception［J］.Frontiers in Plant Science，10：623.doi：10.3389/fpls.2019.00623.

Guo L，Qi Y T，Mu Y，Zhou J，Lu W H，Tian Z D.2022.Potato StLecRK-IV.1 negatively regulates late blight resistance by affecting the stability of a positive regulator StTET8［J］.Horticulture Research，9：uhac010.doi：10.1093/hr/uhac010.

He Z Y，Zou T，Xiao Q，Yuan G Q，Liu M M，Tao Y，Zhou D，Zhang X，Deng Q M，Wang S Q，Zheng A P，Zhu J，Liang X Y，Yu X M，Wang A J，Liu H N，Wang L X，Li P，Li S C.2021.An L-type lectin receptor-like kinase promotes starch accumulation during rice pollen maturation［J］.De-velopment，148（6）：dev196378.doi：10.1242/dev.196378.

Hu Z W，Zhong X，Zhang H R，Luo X C，Wang Y X，Wang Y，Liu T，Zhang Y，Wang X P，An H L，Xu D，Wan P，Yang Y Z，J Zhang J M.2023.GhMYB18 confersAphis gossypii Glover resistance through regulating the synthesis of sali-cylic acid and flavonoids in cotton plants［J］.Plant CellReports，42（2）：355-369.doi：10.1007/s00299-022-02961-z.

Li B，Li Y X，Qiu M D，Dong H，Li X S，Liu X M，He C S，Li L.2022.OsSRK a lectin receptorr-like kinase，controlsplant height by mediating internode elongation in Oryza sativa L.［J］.Molecular Breeding，42（12）：74.doi：10.1007/s11032-022-01340-6.

Liu S H，Wang J，Chen K S，Zhang Z H，Zhang P Y.2017.The L-type lectin receptor-like kinase（PnLecRLK1）from the Antarctic moss Pohlia nutans enhances chilling-stress to-lerance and abscisic acid sensitivity in Arabidopsis［J］.Plant Growth Regulation，81：409-418.doi：10.1016/j.csbj.2017.03.002.

Liu U Q，Wu H，Chen H，Liu Y L，He J，Kang H Y，Sun Z G，Pan G，Wang Q，Hu J L，Zhou F，Zhou K N，Zheng X M，Ren Y L，Chen L M，Wang Y H，Zhao Z G，Lin Q B，Wu F Q，Zhang X，Guo X P，Cheng X N，Jiang L，Wu C Y，Wang H Y，Wan J M.2015.A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice［J］.Nature Biotechnology，33（3）：301-305.doi：10.1038/nbt.3069.

Livak K J，Schmittgen T D.2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCt method［J］.Methods，25（4）：402-408.doi：10.1006/meth.2001.1262.

Phillips S M，Dubery I A，van Heerden H.2013.Identification and molecular characterisation of a lectin receptor-like kinase（GhLecRK-2）from cotton［J］.Plant Molecular Biology Reporter，31（1）：9-20.doi：10.1007/s 11105-012-0470-2.

Pi L，Zhang Y F，Wang J H，Wang N，Yin Z Y，Dou D L.2023.AG-type lectin receptor-like kinaseinNcotianabenthamia-na enhances resistance to the fungal pathogen Sclerotinia scletorum by complexing with CERK1/LYK4［J］.Phytopa-thology Research，5（1）：1-14.doi：10.1186/s42483-023-00182-0.

Sanabri N M，van Heerden H，Dubery I A.2012.Molecular characterisation and regulation of a Nicotiana tabacum S-domain receptor-like kinase gene induced during an early rapid response to lipopolysaccharides［J］.Gene，501（1）：39-48.doi：10.1016/j.gene.2012.03.073.

Shih P Y，Sugio A，Simon J C.2023.Molecular mechanisms underlying host plant specificity in aphids［J］.Annual Re-view of Entomology，68：431-450.doi：10.1146/annurev-e-nto-120220-020526.

Shrestha R B，Parajulee M N.2013.Potential cotton aphid，Aphis gossypii，population suppression by arthropod preda-tors in upland cotton［J］.Insect Science，20（6）：778-788.doi：10.1111/j.1744-7917.2012.01583.x.

Sun Y，Zhao X H，Gao Y H，Jiao J，Sun Y D，Zhu D Z，Yang J J，Wu F L，Su H Y.2022.Genome-wide analysis of lectin receptor-like kinases（LecRLKs）in sweet cherry（Prunus avium）and reveals PaLectinL16 enhances sweet cherry resistance with salt stress［J］.Environmental and Experi-mental Botany，194：104751.doi：10.1016/j.envexpbot.2021.104751.

Upadhyay S K，Shumayla.2023.Plant receptor-like kinases［M］.Pittsburgh：Academic Press：2139-2154.

Vaid N，Macovei A，Tuteja N.2013.Knights in action：Lectin receptor-like kinases in plant development and stress res-ponses［J］.Molecular Plant，6（5）：1405-1418.doi：10.1093/mp/sst033.

Wang B，Fang R Q，Zhang J，Han J L，Chen F M，He F R，Lin Y G，Chen L T.2020.Rice LecRK5 phosphorylates an UGPase to regulate callose biosynthesis during pollen development［J］.Journal of Experimental Botany，71（14）：4033-4041.doi：10.1093/jxb/eraa 180.

Xu J M，Wang C L，Wang F J，Liu Y P，Li M，Wang H J，Zheng Y H，Zhao K J，Ji Z Y.2023.PWL a G-type lectin receptor-like kinase，positively regulates leaf senescence and heat tolerance but negatively regulates resistance to Xanthomonas oryzae in rice［J］.Plant Biotechnology Jour-nal，21（12）：2525-2545.doi：10.1111/pbi.14150.

Zhang Y，Wang Y W，Liu T，Luo X C，Wang Y，Chu L Y，Li J P，An H L，Wan P，Xu D，Yang Y Z，Zhang J M.2023.GhMYC1374 regulates the cotton defense response to cot-ton aphids by mediating the production of flavonoids and free gossipol［J］.Plant Physiology and Biochemistry，205：108162.doi：10.1016/j.plaphy.2023.108162.

Zhao T M，Wang J Y，Zhang B L，Hou X L.2018.Genome-wide analysis of lectin receptor-like kinases in tomato（Solanum lycopersicum）and its association with the infec-tion of tomato yellow leaf curl virus［J］.Plant Molecular Biology Reporter，36：429-438.doi：10.1007/s 11105-018-1091-1.

Zhong X，Yang Y Z，Feng P，Ma Q Q，Su Q，Wang X P，Zhang J M.2022.Transcriptomic profiling of cotton leaves in response to cotton aphid damage［J］.Acta Physiologiae Plantarum，44（10）：98.doi：10.1007/s 11738-022-03438-y.

（责任编辑麻小燕）