水稻橙叶植原体在病株中积累及其经电光叶蝉传播的主要特征

摘要：【目的】探究水稻橙叶植原体（Rice orange leaf phytoplasma，ROLP）在水稻植株体内的扩散和积累以及其经由主要介体电光叶蝉传播的特征，以加深对水稻橙叶病发生规律的认识，为病菌继代保存和田间病害防控提供科学依据。【方法】采用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测ROLP在感病水稻植株不同部位积累动态及在叶蝉体内的增殖动态；以2～3龄电光叶蝉若虫为传菌介体，测定其在病程约20 d的菌源病株上取食不同时间的获菌率；采用稻苗感病试验测定病菌在叶蝉体内的循回期；通过单虫单苗共培养试验测定病菌经电光叶蝉向3～4叶期水稻幼苗传播的效率。【结果】水稻幼苗感病后，病菌先在受侵染叶片中缓慢增殖，10～15 d后经主茎向下扩展，随后在分蘖的茎和叶组织中大量增殖，约30 d后引致分蘖发病；病株受侵染叶片的上部茎和叶组织中仅有微量或没有病菌存在，根部仅实时荧光定量PCR检测到微量病菌。2～3龄电光叶蝉在菌源植株上取食15、25和35 d的获菌率分别为26.67%、71.11%和85.56%。病菌在叶蝉体内的循回期为25 d左右，度过循回期的带菌叶蝉单虫单苗取食12、24和48 h可分别使24.44%、46.67%和47.78%的水稻苗染病。【结论】ROLP在水稻植株体内呈不均匀分布，以感病30 d前后的分蘖茎和叶组织中含量最高，受侵叶片的上部茎和叶组织中无病菌分布。病菌经电光叶蝉高效传播的获菌取食时间、体内循回期和传菌取食时间分别为15 d、25 d和24 h。

关键词：水稻橙叶病；植原体；电光叶蝉；病菌增殖动态；传播特征

中图分类号：S435.11文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）07-2108-08

Accumulation in infected rice and transmission characteristics viaRecilia dorsalis of rice orange leaf phytoplasma

ZHOU Si-qi，YANG Xiao-rong，WANG Zhi-yi，YANG Xin，ZHANG Tong，ZHOU Guo-hui*

（College of Plant Protection，South China Agricultural University/Guangdong Province Key Laboratory of MicrobialSignals and Disease Control，Guangzhou，Guangdong 51064 China）

Abstract：【Objective】In this study，the diffusion and accumulation of rice orange leaf phytoplasma（ROLP）in rice plants and its transmission characteristics by its main vector，Recilia dorsalis，were investigated.This would enhance the understanding of the occurrence patterns of rice orange leaf disease and provide scientific basis for pathogen preservation and field disease control.【Method】Semi-quantitative PCR and real-time fluorescence quantitative PCR were used to de-tect the accumulation dynamics of ROLP in different tissues of infected rice plants and its proliferation dynamics in R.dor-salis.Second-to third-instar nymphs of R.dorsalis were used as vectors.The ROLP acquisition efficiency of R.dorsalis at approximately 20 days post infection（dpi）feeding on ROLP source plants for varying durations was determined.Thecir-culative period of ROLP in R.dorsalis was determined through rice seedling infection experiment.The transmission effi-ciency of ROLP from R.dorsalis to three-to four-leaf stage rice seedlings was determined by single-insect and single-seedling co-culture experiment.【Result】After rice seedlings were infected，ROLP initially proliferated slowly in the in-fected leaves，and expanded downward through the main stem after 10 to 15 d.Subsequently，it proliferated extensivelyin the stem and leaf tissues of tillers，causing tiller disease onset after about 30 d.Only trace amount of strains or no strains were detected in the upper stem and leaf tissue of infected leaves，and only trace amounts of strains were detected by real-time fluorescence quantitative PCR in the root.The ROLP acquisition rates of second-to third-instar R.dorsalis after feeding on source plants for 15，25 and 35 d were 26.67%，71.11%and 85.56%respectively.The circulative period of ROLP in R.dorsalis was approximately 25 d.Inoculative single R.dorsalis that completed the circulative period could transmit ROLP to 24.44%，46.67%and 47.78%rice seedlings after feeding on single plant for 1 2 and 48 h respec-tively.【Conclusion】The distribution of ROLP is uneven in rice plants，with the highest content in the stem and leaf ti-ssues of tillers around 30 dpi.No ROLP is found in the upper stems and leaf tissues of infected leaves.ROLP acquisition feeding time，circulative period and transmission feeding time of ROLP for efficient transmission by R.dorsalis are 15 d，25 d and 24 hrespectively.

Key words：rice orange leaf disease；phytoplasma；Recilia dorsalis；pathogen proliferation dynamics；transmission characteristics

Foundation items：Guangdong Key Area Research and Development Project（2019B020217003）

0引言

【研究意义】水稻橙叶病引起水稻全株叶片黄化，水稻不能抽穗结实，严重时导致病株枯萎死亡，对水稻生产构成重大威胁。该病于1960年首次在泰国被发现（Satioetal.，1976），上世纪70年代末至90年代初曾在马来西亚、斯里兰卡、菲律宾和中国等地流行为害（吴自强等，1980；Hibino etal.，1987；张曙光等，1995），此后近20年间未见该病发生为害的报道。但近十年来，该病在亚洲多地再次暴发成灾。2015和2016年，Li等（2015）、何园歌等（2016）报道该病害在华南地区再流行；随后多篇文献陆续报道该病在印度、菲律宾、越南、泰国和柬埔寨等国再流行（Valarmathi et al.，2013；Nguyen et al.，2016；Jon-son et al.，2020；Ong et al.，2021）。我国华南稻区是水稻橙叶病重发区之一，据不完全统计，2013年广东省罗定市受害面积53.3 ha，发病田块一般减产10%～30%，重病田块减产50%～80%，甚至绝收（陈怡光，2015）；2017年广东省肇庆市封开县受害面积50 ha，发病田减产10%～40%（黄圳等，2020）；2018和2019年广东省雷州市发病面积分别为153.3和46.7 ha（周润声，2020）；2018—2020年广西来宾市兴宾区发病面积分别为1333.3、3333.3和4000 ha（黄连群等，2023）。由于该病病原不能人工体外培养，有关其致病机理、发生规律、品种抗性及防控技术研究严重滞后。明确水稻橙叶病病原菌在感病植株中的积累动态和传播特征，不仅可加深对该病害流行规律的认识，还可为建立该病菌实验室扩繁侵染试验体系提供理论依据，具有重要的理论和实际意义。【前人研究进展】水稻橙叶病病原为水稻橙叶植原体（ROLP），是一种无细胞壁的原核生物，归属于植原体暂定属翠菊黄化组或16S rDNA序列第1组（Can-didatus phytoplasma asteris，16SrI group）（Lee et al.，2000；张松柏等，2009）。ROLP仅侵染水稻，专性寄生于寄主植物韧皮部，前人研究认为，其不侵染成株期水稻，或即使侵染也不发病（林奇英等，1983；张曙光等，1999）。该病菌可经多种稻叶蝉以持久增殖型方式传播，已知传播介体包括电光叶蝉（Reciliadosalis）（林奇英等，1983；谢双大等，1995；张曙光等，1995）、黑尾叶蝉（Nephotettixcineticeps）（Li etal.，2015）和二点黑尾叶蝉（N.virescens）（Jonson etal.，2020），其中以电光叶蝉传菌效率最高，是我国田间主要传菌介体。ROLP在受侵植株体内的分布和积累情况与介体叶蝉从发病植株上的获菌效率密切相关，但未见有关的系统研究报道，仅有一些研究者报道采用电子显微镜或DAPI染色法在感病植株韧皮部细胞内观察到植原体的存在（Hibino etal.，1987；张曙光等，1995；Li etal.，2015；Onget al.，2021）。关于介体叶蝉的传菌特性，不同的文献报道差异很大，这给病害流行规律解析及病菌人工保存扩繁体系的建立造成很大困扰。林奇英等（1983）报道，电光叶蝉取食病株4 h即可获得ROLP，获菌率为4.4%，取食24 h获菌率达25.6%；病菌在叶蝉体内的循回期因环境温度而异，25.7℃下平均18d，28.5℃下平均11 d；带菌叶蝉传菌最短时间为30min，传菌效率为26.7%。张曙光等（1995）报道，电光叶蝉最短取食2 min可获菌，且获菌率为50.0%；25～30℃下病菌在叶蝉体内的循回期为17 d左右；带菌叶蝉传菌最短时间为5min，传菌效率达50.0%。Jonson等（2020）报道，二点黑尾叶蝉需在病株上取食5 d并经过20d左右的病菌循回期才能传菌，传菌取食1d才能获得较高的传菌率（10%～20%）。Zhang等（2022）采用免疫电镜、qPCR和Western blotting对带菌电光叶蝉进行了检测，发现在病株上取食7 d后的叶蝉体内ROLP积累量很低，此时病菌仅存在于叶蝉肠腔内；随后的7～14 d，病菌才进入叶蝉肠道上皮细胞增殖；直至14～21 d，病菌才穿越肠道进入体腔内大量增殖；最终在28 d后进入唾液腺。因此，有必要对ROLP介体传播特性进行再测定。【本研究切入点】病菌在受侵植物体内的分布和积累与介体昆虫从发病植株上获取病菌的效率密切相关；而介体昆虫对病菌的获取和传菌效率是决定病害发生与流行的关键因素。【拟解决的关键问题】采用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术对ROLP在感病水稻植株中的积累动态及在叶蝉体内的增殖动态进行深入研究，进一步明确ROLP在受侵水稻和电光叶蝉体内的积累特征，并通过测定电光叶蝉传菌参数等建立ROLP人工保存扩繁体系，以加深对水稻橙叶病发生规律的认识，为病菌继代保存和田间病害防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1供试水稻、菌源和介体昆虫

本研究所使用的水稻材料为粳稻品种日本晴（Nipponbare，Nip），种子由广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室扩繁保存。感染ROLP的水稻植株采集自广东省云浮市，盆栽于防虫网室中，经电光叶蝉传播使病菌在日本晴水稻幼苗上继代保存。电光叶蝉从广东省云浮市水稻田采集，在实验室养虫笼中的日本晴水稻幼苗上扩繁，经PCR检测为ROLP阴性的纯化种群作为供试无菌叶蝉。将2～3龄无菌电光叶蝉若虫放至感染ROLP的水稻植株上使其取食，获得饲菌或携菌电光叶蝉。

1.2水稻组织和电光叶蝉虫体总DNA提取及ROLP分子检测

1.2.1样品总DNA提取取0.1 g供试水稻植株不同部位（主茎第2平展叶、主茎茎中部、主茎茎基部、分蘖第2平展叶、分蘖茎中部、分蘖茎基部和根部）或单头电光叶蝉虫体在液氮中研磨成粉状，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取总DNA，提取产物溶于30～50µL ddH2O，分光光度计测定DNA浓度和纯度，用ddH2O稀释至合适浓度作为ROLP分子检测模板。

1.2.2病菌PCR检测引物采用Wang等（2020）设计筛选的靶向ROLP细胞分裂蛋白基因FtsH-1的特异引物1355C-F/R（5'-GCAAAAGCACTTGCAG GAGAG-3'/5'-GCTTGTCTTGCTTTTATGTCGG-3'）进行ROLP的PCR、半定量PCR和实时荧光定量PCR检测。半定量PCR和实时荧光定量PCR时，水稻和电光叶蝉的内参基因分别为OsEF1a（引物OsEF1a-F/R：5'-ACATTGCCGTCAAGTTTGCTG-3'/5'-AACAGCCACCGTTTGCCTC-3'）和Actin（引物Actin-F/R：5'-CATCAGGGTGTCATGGTGGG-3'/5'-GGTCTCAAACATGATCTGGGTCA-3'）。

1.2.3 PCR和半定量PCR检测采用2×Taq Mas-ter Mix试剂盒（南京诺唯赞生物技术有限公司）进行。反应体系25.0µL：样品DNA模板50 ng，10μmol/L上、下游引物各1.0µL，2×Taq Master Mix 10.0µL，ddH2O补足至25.0µL。扩增程序：95℃预变性1 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，进行30个循环；72℃延伸10min。反应设备为T100 PCR仪（美国Bio-Rad公司）。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，荧光染料染色后在凝胶成像系统中照相记录。半定量PCR时，运用Image J对ROLP和内参基因扩增产物条带进行灰度值分析，同一样品用2个灰度值的比值（ROLP/OsEF1a或ROLP/Actin）代表该样品中ROLP的相对含量。

1.2.4实时荧光定量PCR检测采用SYBR®Pre-mix Ex TaqTMⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）进行。反应体系20.0µL：样品DNA模板50 ng，10µmol/L上、下游检测引物或内参基因引物各0.5µL，2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0µL，ddH2O补足至20.0µL。扩增程序：95℃预变性1min；95℃10 s，60℃30 s，进行40个循环；95℃延伸10 s。采用2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR结果的Ct值进行分析处理，其中ΔΔCt=试验组靶基因与内参Ct之差-对照组靶基因与内参Ct之差，用其代表样品中ROLP的相对含量。

1.3 ROLP在水稻植株不同部位中的积累动态测定

2～3龄无病菌电光叶蝉在病源水稻植株上饲菌取食25 d至成虫，取初羽化成虫转接到育苗盘中3～4叶期健康日本晴水稻幼苗上，每苗接虫2.5头左右，在养虫笼中共培养，2 d后清除电光叶蝉，将水稻幼苗盆栽于防虫网室中，网室环境温度25～30℃、相对湿度75%～90%（广州4—6月及8—10月）。在带菌叶蝉取食后15、30和45 d时，取供试稻株不同部位，抽提总DNA，半定量PCR及实时荧光定量PCR检测ROLP相对含量，每个时间点获取5株病株检测数据（接虫后15d时，病害症状尚未显现，需根据供试植株随后的症状表现判定检测数据是否有效），计算平均值并进行差异显著性分析。

1.4电光叶蝉获菌率测定

以刚显症的分蘖期水稻病株（3～4叶期染病，病程20 d左右）作为菌源植株，测定电光叶蝉获菌率。将菌源植株盆栽置于养虫笼中，每笼3～4株，接入无病菌电光叶蝉2～3龄若虫，每笼接虫50头左右，在25～30℃、相对湿度75%～90%的环境下（广州4—6月及8—10月）遮光共培养。分别于共培养后15、25和35 d时采用PCR检测10头虫的获菌情况。试验共进行4批次（春季和秋季各2批次），每批次设3次重复（3个养虫笼）。

1.5电光叶蝉体内ROLP积累量测定

按1.4所述方法进行电光叶蝉获菌饲养，饲菌取食5 d后，将供试叶蝉转移至3叶期的健康水稻幼苗上继续饲养，15、25和35 d后取虫，单头虫抽提总DNA，将PCR检测呈ROLP阳性的DNA稀释至大致相同的浓度（约50 ng/µL），以Actin为内参基因进行ROLP半定量PCR及实时荧光定量PCR检测，每处理3次重复，每重复检测叶蝉10头以上。

1.6 ROLP在电光叶蝉体内循回期测定

取在菌源植株上饲菌取食5 d的3～4龄电光叶蝉若虫100头左右，转移至盆栽健康水稻苗上，养虫笼中共培养，15、25和35 d时各取30头接入育有20株3～4叶期健康稻苗的育苗盘上共培养2 d，进行传菌试验。传菌处理后的稻苗移栽至试验田，每周施用1次噻虫嗪或呋虫胺等杀虫剂防虫，30 d后观察病害症状并进行PCR检测。试验设3次重复，计算供试稻苗感病率，判断ROLP在电光叶蝉体内的循回期。

1.7电光叶蝉传菌效率测定

将饲菌取食5 d的电光叶蝉转移至健康水稻苗上培养25 d，使病菌在叶蝉体内度过循回期；将单头叶蝉转移至内置1株3～4叶期健康稻苗的试管中，分别取食传菌12、24和48h，取出供试稻苗移栽至试验田，30 d后观察发病情况并进行PCR检测。试验设3次重复，每重复测试30头叶蝉。传菌试验结束后对供试叶蝉进行PCR检测，调查带菌电光叶蝉引致稻苗感病的数量，计算其传菌效率，传菌效率（%）=感病植株数/供试植株数×100。

1.8统计分析

用Excel 2016对试验数据进行整理分析，将相关数据导入GraphPad Prism 8.0绘图。采用SPSS 23.0中的邓肯氏新复极差（DMRT）法对数据进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1水稻橙叶植原体在感病植株不同部位积累量的病程动态

观察发现（图1），15 dpi（感染后天数，Days post infection）时，受侵植株几乎没有发病症状；25 dpi时病株症状逐渐显现并加重，先是病株分蘖最基部叶片从叶尖开始向下逐渐黄化，接着分蘖上的叶片自下而上依次出现黄化（图中未显示）；30 dpi时，分蘖下部的2～3张叶片呈现黄化，而主茎各叶片仍保持绿色，此时病株基本停止生长；45 dpi时，病株各分蘖的所有叶片均黄化，主茎茎基部叶片也开始黄化，但主茎上部1～2张叶片仍保持绿色，此时病株接近死亡；50 dpi时病株全株干枯死亡（图中未显示）。

根据症状发展进程，本研究对感染ROLP不同天数的病株不同部位病菌积累量进行检测。半定量PCR（图2）和实时荧光定量PCR（图3）均显示，叶尖在10 dpi时能检测到微量病菌积累，随后5 d能在病株主茎中检测到微量病菌（图中未显示），说明ROLP经主茎向下扩展；在病株的主茎上，第2平展叶和茎中部在15 dpi时有一定数量的病菌积累，但在随后的30和45 dpi时仅有微量或没有病菌存在（此时的第2平展叶和茎中部均为15 dpi后新生组织）；而主茎茎基部在3个病程点均有较低数量的病菌积累。在病株的分蘖上（病株因生长受限和枯萎死亡，仅产生2个一级分蘖），所检测的3个部位（第2平展叶、茎中部和茎基部）在15～45 dpi病程期间均有较多数量的病菌存在，病菌含量均随病程发展而增加，其中以30dpi时叶片中病菌积累量最大，分蘖茎中部与茎基部病菌积累量差异不大。在病株的根中，始终仅有极微量的病菌存在（半定量PCR不能检测到）。

2.2电光叶蝉获菌率测定结果

以病程约20 d的病株为菌源材料，测试2～3龄电光叶蝉饲菌取食15、25和35 d的获菌率，结果（图4）显示，电光叶蝉取食菌源水稻15 d后平均获菌率为26.67%，而取食25和35 d后，平均获菌率分别提高至71.11%和85.56%，方差分析显示饲菌取食25 d的获菌率显著（P<0.05，下同）高于饲菌取食15 d但与饲菌取食35 d的获菌率无显著差异（P>0.05，下同）。表明需要较长的饲菌取食时间（15 d）电光叶蝉群体才能达到较高的获菌率，适当延长饲菌取食时间可提高电光叶蝉的获菌率。试验中发现，稻虫共培养15 d时，供试菌源植株（约35 dpi）下部约一半的叶片表现为橙黄色，供试叶蝉发育为4～5龄高龄若虫；共培养25 d时，供试菌源植株（约45 dpi）下部约2/3的叶片表现为橙黄色，供试叶蝉发育为成虫；共培养35 d时，供试菌源植株（约55 dpi）整株叶片橙黄色，部分植株干枯死亡，部分供试叶蝉死亡。

2.3水稻橙叶植原体在电光叶蝉体内的增殖动态

半定量PCR（图5）和实时荧光定量PCR结果（图6）均显示，在获菌后的15 d内，电光叶蝉体内的ROLP含量很低；获菌25d后，病菌含量有明显提高；至35 d时，病菌含量仍有所提高，但增幅没有前期明显。半定量PCR检测数据显示，3个病程点叶蝉体内病菌相对含量差异显著（图5）；但实时荧光定量PCR检测数据显示，获菌后25 d时电光叶蝉体内病菌含量显著高于15d，而25 d与35d间的电光叶蝉体内病菌含量差异不显著（图6）。表明ROLP可在电光叶蝉体内增殖，但侵染早期增殖速度非常慢，提示电光叶蝉获菌后需要经过较长时间才具有传菌能力。

2.4水稻橙叶植原体在电光叶蝉体内循回期测定结果

电光叶蝉在菌源植株上取食5 d，经在健康水稻上饲养15、25和35 d后，以30头叶蝉转接到20株3～4叶期水稻幼苗上传菌2 d，结果显示，3次试验共90头饲菌叶蝉分别可导致60株水稻中的0、38和41株感病。即ROLP在电光叶蝉体内的循回期为15d以上，饲菌后25d，带菌叶蝉具有较强的传菌能力，继续延长循回期并不能明显提高叶蝉的传菌效率。

2.5带菌电光叶蝉取食时长对传菌效率的影响

以获菌后度过25 d病菌循回期的电光叶蝉和3～4叶期水稻幼苗为材料进行传菌试验，单虫单苗传菌取食12、24和48 h，结果分别导致24.44%、46.67%和47.78%的稻苗感病。表明电光叶蝉取食传菌的最佳时间为24h，传菌取食时间过短，传菌成功率较低，但继续延长取食时间并不能明显提高传菌成功率。

3讨论

本研究揭示了ROLP在感病水稻植株体内的扩展及积累过程，即病菌侵入水稻后，先在受侵染叶片（15 dpi时的主茎第2或第3片平展叶）中缓慢增殖，10～15 d后经主茎向下扩展，随即进入新生的分蘖，在分蘖的茎和叶组织中大量繁殖，约在30 dpi时引致分蘖发病。在30和45 dpi时主茎第2平展叶及茎中部仅有微量或没有病菌存在，表明病菌并未沿主茎向上扩展至上部新生组织。病菌的这一扩散模式，与该病害症状发展过程相吻合，即病株症状首先出现在分蘖下部叶片上，当病株所有分蘖都黄化或枯死后，主茎上部叶片才枯萎死亡。

本研究首次发现ROLP不侵入植株接种叶上部的叶片和茎组织，这一发现对水稻疑似病样的病原检测具有重要的指导意义，可避免因取样部位不恰当而产生假阴性检测结果；同时也给水稻成株期抗性和病害侵染循环提供了一个合理的解释，即ROLP不侵染成株期水稻或即使侵染也不发病（林奇英等，1983；张曙光等，1999）。但根据病害田间流行过程，成株期病株是该病害侵染循环中的一个重要环节，因为苗期染病的植株在分蘖后期都会干枯死亡（张曙光等，1999），不能作为叶蝉取食获菌的病源。而田间稻叶蝉寿命通常为1个月左右（卢增斌等，2013），水稻收割后转入下季秧田或越冬场所的叶蝉成虫均为水稻拔节期之后扩繁产生，由于病菌不能经叶蝉卵传，因此这些叶蝉必须从成株期水稻上获得病菌。已有研究表明，病区早稻或晚稻收获后介体叶蝉群体中ROLP带菌率很高，最高可达50%以上（谢双大等，1995；陈彪等，2021），说明，病区田间存在较多的成株期无症病株。本研究未对ROLP侵染水稻分蘖叶片后的扩散情况进行检测，但根据病菌侵染主茎叶片后的扩散模式推导，分蘖叶片中的病菌只能向该分蘖产生的次级分蘖扩散。尽管这些感病的次级分蘖在水稻拔节后可为介体叶蝉提供菌源，但在生产上作为无效分蘖，无论其表现症状与否，均易被忽视，这也是田间不能观察到成株期病株的原因之一。病菌不侵入主茎上部叶片对病害流行的作用具有双重性，一方面，上部叶片可保持较长时间光合功能，延长病株存活时间，使得传病介体取食获菌的机会增加；另一方面，主茎上部叶片不含病菌，使得在该部位取食的叶蝉无法获菌。

本研究仅通过实时荧光定量PCR能在水稻根部组织中检测到病菌，而半定量PCR不能在水稻根部组织中检测到病菌，说明ROLP并不大量进入根组织或不在根组织中大量增殖，水稻根部在病菌的系统扩散中可能不起重要作用。虽然Ong等（2021）采用DAPI染色法在感病水稻根部观察到病菌分布，但病菌从主茎进入分蘖的通道可能是叶腋，因为分蘖是从叶腋芽发育而来（刘杨等，2011）。

多个研究小组对介体叶蝉传菌特性进行了研究，但所得结果差异很大。如林奇英等（1983）测得电光叶蝉最短获菌时间为4h，但张曙光等（1995）报道电光叶蝉最短取食2 min即可获菌，而Jonson等（2020）报道二点黑尾叶蝉需在病株上取食5 d才能高效获菌。总体上，本研究测得的电光叶蝉获菌时间、病菌体内循回期及传菌时间均比30年前文献报道（林奇英等，1983；张曙光等，1995）的长，而与近期Jonson等（2020）测定的结果较相近。本研究发现电光叶蝉必须在病株上取食15 d才能达到较高的获菌率（26.67%）；25～30℃环境条件下，病菌在叶蝉体内的循回期为25 d左右；带菌叶蝉取食12h传菌效率为24.44%，取食24h传菌效率才达到46.67%。本研究结果与Zhang等（2022）观察到的病菌在叶蝉体内的侵染过程相吻合。造成本研究结果与30年前报道存在明显差异的原因可能是病菌发生了变异，以往的文献（Satioetal.，1976；Hibino etal.，1987；谢双大等，1995；张曙光等，1995，1999）均报道ROLP仅经电光叶蝉传播，近年的研究发现黑尾叶蝉（Li et al.，2015）和二点黑尾叶蝉（Jonson etal.，2020）也能传病，Li等（2015）认为可能是病菌发生了变异使其获得了经新介体的传播能力，进而导致病害的再流行，传播特性改变可能是病菌获得经新介体传播能力的代价。

综合本研究结果，提出ROLP人工保存扩繁技术建议：以病程20d左右的分蘖期病株作为菌源，以2～3龄电光叶蝉若虫为起始传菌介体，获菌取食25 d后转至3～4叶期水稻幼苗上传菌24h以上。多次试验证实，这一技术能在实验室中成功继代保存ROLP菌源，预期可在品种抗性鉴定和病菌致病机理及病害防控研究中发挥积极作用。

4结论

水稻橙叶植原体在病株体内呈不均匀分布，主要在染病后的新生分蘖茎叶组织中大量增殖和积累，侵染点上部的新生组织中无病菌分布。病菌经电光叶蝉高效传播的获菌取食时间、体内循回期和传菌取食时间分别为15 d、25 d和24h。

参考文献（References）：

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