鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

关键词：鸡喉气管炎病毒；TK基因；实时荧光定量PCR；特异性；敏感性；重复性

中图分类号：S858.31 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）06-0128-05

鸡传染性喉气管炎是由喉气管炎病毒（Infec-tious laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一种急性、接触性呼吸道传染病，主要侵染鸡的喉头和气管上皮细胞，同时也对鸡鼻窦、气囊和肺组织产生影响，被世界卫生组织（OIE）列为必须通报的疾病。ILTV首次于20世纪30年代报道自美国，属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，病毒粒子为直径85～105nm的正20面体立体对称结构，有囊膜，是危害鸡集约化养殖的主要病毒性呼吸道传染病致病菌之一。近年来，在山东、江苏、河北等部分地区，鸡传染性喉气管炎的发病率不仅在蛋鸡中增高，在蛋种鸡和商品肉鸡中也呈增加趋势。

ILTV只有一个血清型，临床病变有严重和轻微两种形式，严重者表现出呼吸困难、气喘、咳出带血分泌物等主要症状，发病率和致死率高达70%。该病易与其他呼吸道疾病，如新城疫、传染性支气管炎等混淆，因此建立一种快速有效的诊断方法对ILTV的监测具有重要意义。

ILTV的基因组有79个开放阅读框，编码多种结构蛋白和致病性蛋白，其中，TK基因编码胸腺嘧啶激酶，在核酸代谢中起主要作用，是病毒的主要毒力基因，也是构建基因缺失疫苗的主要靶标。本研究对ILTV的TK基因保守区域进行分析，利用Primer 5软件设计了1对荧光定量PCR引物，建立了ILTV的实时荧光定量PCR检测方法，为ILTV的监测与诊断提供技术支持。

1材料与方法

1.1病毒与临床病料

ILTV、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感H5（AIV-H5）、H9亚型灭活毒株（AIV-H9）、新城疫病毒（NDV）均由山东省禽病诊断与免疫重点实验室鉴定并保存。临床样本为2022年1月一2023年1月该实验室接收的病料组织，-80℃保存。

1.2主要试剂

SimplyP病毒DNA/RNA提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、18-T载体连接试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Premix Taq^TM

1.3引物的设计与合成

根据GenBank已公布的ILTV的TK基因保守序列，利用软件Primer 5.0分别设计1对普通PCR引物和1对荧光定量PCR引物（表1），均由北京华大基因科技有限公司合成，离心后用ddH₂O稀释至10μmol/L，-20℃保存。

1.4病毒核酸提取

将储存于-80℃的感染ILTV的鸡尿囊液按照SimplyP病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，于-80℃保存。

1.5质粒标准品的准备

以ILTV DNA为模板，利用引物TK-P1/P2对TK基因进行PCR扩增。扩增体系为：Taq Mix12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 2.0μL，加ddH₂O补足至25μL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸7 min;4℃保存。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用胶回收试剂盒纯化回收330 bp处阳性目的片段：使用18-T载体连接试剂盒将纯化回收片段与18-T载体16℃连接30 min后，按说明书转化至DH5α感受态细胞：在氨苄阳性的LB营养琼脂平板上涂抹培养并筛选阳性克隆，挑取合格单菌落接入含氨苄的液体LB培养基中过夜扩大培养。用质粒提取试剂盒提取重组质粒后基因测序。