不同种植年限设施菜地黄壤微生物群落演变特征

关键词：设施蔬菜；种植年限；黄壤；微生物群落结构；高通量测序

中图分类号：S154.3：S626 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2024）06-0065-10

设施蔬菜生产在满足人们生活需求和增加农民收入方面发挥着重要作用。2021年，我国设施蔬菜种植面积达到400万hm²。然而，随着生产规模的快速扩大，长期集约化种植造成的连作障碍已成为制约我国设施蔬菜产业可持续发展的重要瓶颈。因此，了解设施蔬菜连作障碍的机制，有利于制定有效措施来解决长期制约设施蔬菜可持续经营中存在的难题。设施菜地长期种植通常会导致土壤质量恶化，影响蔬菜产质量，不利于设施蔬菜可持续生产。随着设施菜地连年种植，土壤质量的变化被认为是造成连作障碍的重要原因，如土壤酸化和盐碱化、土壤养分耗竭和失衡、植物毒性和自毒性化合物的释放及积累等。此外，土壤生物特性也受到越来越多的关注，特别是土壤微生物在土壤质量中占有重要地位，具有维持土壤肥力和减轻土壤污染的作用。相关研究表明，土壤微生物群落组成和多样性在改善土壤质量和保持土壤健康方面具有重要作用，通常作为衡量土壤质量变化的重要指标。众多研究表明，种植制度和土地利用类型会强烈影响土壤微生物的丰度和群落结构。然而，与露天栽培相比，设施种植通常具有高养分投入、高灌溉频率和较高土壤温度等特点，会导致土壤微生物群落发生显著变化。由此可知，通过研究设施蔬菜长期种植过程中土壤微生物群落结构的变化，并探索其与连作障碍之间的关系，有利于改善土壤质量。

黄壤为我国西南地区的主要土壤类型，其中贵州黄壤占全国黄壤面积的30.27%，在我国农业生产中具有重要地位。黄壤具有质地黏重、透水性差、养分含量低、酸性强等特点，不利于设施蔬菜的持续健康发展。目前，设施蔬菜土壤微生物方面的研究主要集中在潮土、褐土等类型上，关于设施黄壤中微生物群落的演变规律未见报道。为此，本研究利用高通量测序技术，通过对不同种植年限下贵州设施菜地黄壤微生物群落进行分析，揭示细菌和真菌群落的演变特征及其环境驱动因子，从土壤微生物角度解析设施黄壤的连作障碍机制（土壤质量退化的内在因素），以期为实现设施黄壤的可持续利用提供科学依据。

1材料与方法

1.1供试土壤

供试土壤样品采集于贵州省铜仁市和平乡（109°07′44″E，27°46′46″N），土壤类型为黄壤，年降水量1313mm。2023年8月选择4种不同种植年限（1、5、10、12年）设施菜地，主要种植黄瓜、茄子和豇豆等。以氮磷钾复合肥作为基肥，施用量为1200～1500 kg/hm²；氮肥为追肥，施用量为600～750kg/hm²。各种植年限的设施菜地随机选择3个重复，每样地内按“S”形（五点法）采取0～20 cm土层土壤样品后混合，过2mm筛，一部分-80℃保存用于土壤微生物（细菌和真菌）分析，一部分风干后用于土壤理化性质分析。

1.2土壤化学指标测定

土壤pH值、有机碳（SOC）、全氮（TN）、碱解氮（AN）、速效磷（AP）和速效钾（AK）含量的测定方法见表1。

1.3土壤DNA提取及高通量测序

利用DNA提取试剂盒（Sigma-Aldrich，Ger-many）提取土壤DNA，应用核酸定量仪对DNA浓度和纯度进行检测。土壤细菌和真菌扩增引物见表2。利用Illumina MiSeq平台对土壤细菌16SrRNA和真菌ITS进行测序。基于QIIME分析平台对原始FASTQ文件进行过滤、拼接、去除嵌合体。序列比对后按照97%相似性水平划分操作分类单元（OTU）。在细菌和真菌数据库中，应用RDP Classifier提供的参考序列和分类系统对土壤细菌和真菌中97%相似水平的OTU代表序列进行分类注释。

1.4数据处理与分析

利用Mothur软件计算细菌和真菌群落的α多样性指数；运用Origin 21软件对土壤细菌和真菌优势类群作图；利用R软件进行PCoA、RDA和SEM分析；采用SPSS 21.0软件对土壤理化性质、细菌和真菌群落α多样性指数、群落相对丰度进行方差分析和显著性检验（Plt;0.05）。

2结果与分析

2.1不同种植年限对黄壤化学性质的影响

设施蔬菜长期种植对黄壤的化学性质有显著影响，由表3可知，随种植年限的延长，土壤pH值和速效钾含量逐渐降低；其中pH值在种植5年后显著下降，速效钾含量在种植1年后就开始显著下降。土壤有机碳含量随种植年限呈先增后减的趋势，种植12年时显著低于其他年限。全氮和碱解氮含量随种植年限增加逐渐增加：其中全氮含量在种植1年时显著低于其他处理，其他种植年限之间差异不显著：碱解氮含量在种植年限之间有显著差异，种植12年时最高，为172.12mg/kg。速效磷含量在种植5年后呈现显著递增趋势，种植12年较种植1、5、10年分别增加56.02%、63.28%、14.87%。

2.2不同种植年限黄壤细菌和真菌多样性指数

由表4可知，不同种植年限设施菜地黄壤中细菌和真菌分别获得质控后序列数为83655～88856条和60016～74117条。随种植年限增加，土壤细菌OTUs逐渐减少，种植12年时OTUs数为3116个，显著低于其他种植年限。土壤真菌的OTUs在种植5年时最少，显著低于种植1年和12年。

土壤细菌α多样性指数均大于真菌。土壤细菌Chaol指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数变化大致相同，在种植1、5、10年间差异不显著，种植12年时显著低于1年、5年和10年。由此可知，设施黄壤中细菌群落α多样性对1～10年之间的蔬菜栽培不敏感。种植1、10年和12年间黄壤真菌群落各α多样性指数无显著性差异。种植5年真菌群落的Chaol指数和ACE指数与种植1、12年间有显著差异。种植5年时真菌群落的Shannon指数和Simpson指数与1、10、12年之间有显著差异。设施菜地黄壤中细菌丰富度和多样性随种植年限增加递减，在种植12年时发生显著变化：真菌丰富度和多样性随种植年限增加呈先减后增趋势，种植5年时达到最低，并发生显著变化。

2.3不同种植年限土壤细菌和真菌群落组成

在细菌门水平上，将平均相对丰度lt;1%的类群归类为其他，得到9个类群（图la），分别为变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimo-nadetes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、粘菌门（Myxococcota）、厚壁菌门（Firmicutes）和疣微菌门（Verrucomicrobiota），其中变形菌门（30.50%～36.68%）、芽单胞菌门（15.20%～19.39%）、放线菌门（14.83%～17.01%）、绿弯菌门（9.14%～13.38%）、酸杆菌门（8.11%～11.90%）为优势菌门，总相对丰度为85.25%～90.22%。在真菌门水平上，子囊菌门（Ascomycota）、被孢菌门（Mortierellomycota）和担子菌门（ Basidiomycota）的相对丰度均达到1%以上，总相对丰度平均为97.32%（图1b）。

由图2可知，不同种植年限中，变形菌门、芽单胞菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门和子囊菌门存在显著差异。其中，变形菌门相对丰度随种植年限增加逐渐降低，种植1年时最高（36.68%），分别与种植5年、10年和12年间差异显著；芽单胞菌门相对丰度随种植年限增加递增，种植12年时显著高于其他种植年限：放线菌门相对丰度在种植1年后显著增加，且种植5年、10年和12年之间无显著差异；在种植10年时，绿弯菌门和酸杆菌门相对丰度显著高于其他种植年限；子囊菌门相对丰度在种植1年、5年和10年中没有显著变化，种植12年时显著下降。以上结果表明，长期种植对设施菜地黄壤细菌和真菌群落组成有显著影响。

在细菌属水平上，得到相对丰度在1%以上的10个类群（图3a），其中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）相对丰度高于其他属。鞘氨醇单胞菌属相对丰度在各种植年限之间均有显著差异，种植1年后显著降低，种植10年时最低（4.50%），在种植12年时表现出显著增加。芽单胞菌属相对丰度随种植年限增加递增，在种植12年时显著高于其他种植年限，1年、5年和10年之间无显著差异。

真菌属水平上，相对丰度大于1%的类群有7个，其中毛葡孢属（Botryotrichum）和青霉菌属（Penicillium）为优势类群，相对丰度分别为11.36%～52.90%和6.99%～22.50%。毛葡孢属相对丰度在种植5年时显著高于其他种植年限：种植1年时最低（11.36%），与种植10年和12年之间差异不显著。青霉菌属相对丰度随种植年限的增加递增，在种植12年时最高，为22.50%，分别与1年和5年之间有显著差异。可见，种植年限对细菌和真菌属水平上优势类群影响较大。

2.4不同种植年限土壤细菌和真菌群落的层次聚类和PCoA分析

对不同种植年限土壤细菌和真菌OTU构建的层次聚类树分析（图4）表明，种植年限明显改变了土壤细菌和真菌群落结构。土壤细菌相同种植年限的3个重复均聚类在一起，其中种植10年与12年距离较近，与种植1年距离较远（图4a）。土壤真菌在种植1年与5、10、12年分离较明显（图4b）。总体可知，在设施菜地黄壤种植1年后，细菌和真菌群落结构发生明显分离，种植年限越长分离越明显。

PCoA分析进一步证实不同种植年限土壤细菌和真菌群落结构差异明显。PCoAl和PCoA2对土壤细菌和真菌群落分别解释了总变异的51.8%、39.4%和18.3%、24.2%（图5）。总体可知，土壤细菌种植1年和5年分布在同一象限内，距离较近，说明群落结构相似度较高。12年与1、5、10年距离较远，说明细菌群落结构差异较大。土壤真菌种植10年与12年之间距离较近，1年与5年、10年和12年发生明显分离，说明真菌群落结构差异较大。结果表明，种植年限越长对土壤细菌群落影响越大，土壤真菌群落在种植1年后开始发生明显变化。

2.5土壤细菌和真菌群落结构与土壤理化性质的关系

种植年限对微生物群落的作用可能主要由土壤化学性质的变化引起。通过RDA分析细菌和真菌优势菌属与土壤化学性质之间的关系，结果（图6a）显示，RDA1和RDA2分别解释了土壤细菌群落变异的74.19%和13.68%，前两轴解释了总变异的87.87%。RDA1和RDA2分别解释了土壤真菌群落变异的50.04%和29.38%，前两轴解释了总变异的79.42%（图6b）。表明微生物群落结构与土壤环境密切相关。由表5可知，pH值对土壤细菌和真菌群落有显著影响；有机碳、速效钾、速效磷对土壤细菌和真菌群落有极显著影响；全氮和碱解氮对土壤真菌群落有极显著影响：碱解氮对土壤细菌群落有显著影响。

通过结构方程，构建种植年限一土壤养分一细菌和真菌群落结构及多样性之间的关系模型（图7）表明，种植年限对设施菜地黄壤中细菌和真菌群落结构均有直接的显著影响（Plt;0.05），其中对细菌群落有负影响，对真菌群落有正影响，对真菌的影响强于细菌。种植年限直接对速效磷产生显著的正影响（Plt;0.05），直接对碱解氮产生极显著的正影响（Plt;0.001），对土壤pH值和速效钾直接产生极显著的负影响（Plt;0.001）。种植年限通过降低土壤pH值和速效钾含量，间接抑制真菌群落和细菌群落及其多样性。速效钾对土壤真菌多样性有极显著负影响（Plt;0.001）。

3讨论与结论

本研究中，设施菜地黄壤种植5年以上显著降低了土壤pH值，表明长期种植导致土壤酸化，可能与黄壤的特性、长期施用氮肥和蔬菜大量吸收钙等因素有关。土壤有机碳含量随种植年限先增加后逐渐减少，与Zhao等的研究结果不一致，可能与本研究区域有机肥料施用较少和蔬菜复种指数高有关。此外，全氮含量和碱解氮含量随种植年限增加而增加，表现出营养积累现象，可能与设施蔬菜生产中当地农民持续大量施用氮肥，以及长期种植抑制蔬菜对养分的吸收等因素有关。速效钾含量随种植年限增加逐渐降低，与宋蒙亚等的研究结果一致。设施菜地黄壤中速效钾含量不断减少可能有两个方面原因：一是氮肥施用较多，钾肥施用较少，蔬菜在吸收氮素时，也吸收较多的钾；二是设施菜地有机肥料施用较少，没有对钾进行有效补充。

土壤微生物多样性在维持土壤健康和质量方面具有重要意义，对土壤环境变化较敏感。长期施用无机肥料，特别是大量施用氮肥可降低土壤细菌和真菌多样性。本研究中，土壤细菌群落的Chaol指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数在种植1～10年之间没有显著差异，种植10年后土壤细菌丰富度和多样性显著下降。这可能是由于黄壤本身缺少养分，施肥在一定时间内有利于改善土壤质量，为细菌生长提供适宜的环境条件；然而，长期种植和施肥会导致土壤细菌丰富度和多样性下降。土壤真菌多样性和丰富度指数在种植5年时显著降低，随后在种植10、12年时略有增加。原因可能是随种植年限增加，土壤微生物会保持一定的弹性，同时真菌在不良土壤环境下具有较强的耐受能力。相关研究表明，设施种植年限通过改变土壤理化性质，进而影响土壤微生物群落。本研究中，OTU层次聚类和PCoA分析表明，种植年限显著改变了设施菜地黄壤中细菌和真菌群落结构。土壤微生物群落结构直接反映土壤的生物功能。因此，解决设施栽培长期连作障碍的关键在于不断改善土壤微生物群落结构，使土壤固有的生物功能保持畅通。

高通量测序结果表明，细菌门水平上的优势类群为变形菌门、芽单胞菌门、放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门，与前人研究结果类似。然而，Tian等研究认为，变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和放线菌门是优势类群，与本研究有所差异，可能与土壤类型和种植年限等不同有关。变形菌门在土壤中分布较为广泛，适宜生长在pH值和碳含量较高的营养环境。本研究中，变形菌门相对丰度在设施种植1年时最高，可能与该时期土壤pH值和有机碳含量均较高有关。芽单胞菌门具有嗜盐的特点，适宜生长在盐碱环境，对极端环境具有较强的耐受性。芽单胞菌门相对丰度随种植年限增加递增，可见长期设施栽培下较强的土壤盐碱化有利于该类群生长。放线菌门具有分解动植物残体的作用。放线菌门相对丰度随种植年限增加递增，可能由于设施蔬菜在长期种植中产生较多的蔬菜残体对放线菌生长有促进作用。酸杆菌门相对丰度在种植10年时显著高于其他种植年限，可能由于酸杆菌门具有寡营养特点，适宜生长在有机质较低的酸性环境。子囊菌门为真菌的优势门，与前人研究结果一致，且在农业土壤中广泛分布。子囊菌门相对丰度在种植12年时最低，且与其他种植年限差异显著，这可能由于子囊菌种群特别容易受到高营养水平的影响，特别是设施蔬菜长期种植中过量氮肥的输入，对子囊菌有抑制作用。

土壤作为土壤微生物生存最重要的生境，长期设施栽培中土壤理化性质的显著改变可能是导致土壤细菌和真菌群落结构变化的主要因素。土壤pH值是影响土壤微生物群落组成的最重要环境因子。事实上，许多土壤性状如有机碳和盐度等指标，都直接或间接地与pH值有关。Zhang等研究认为，土壤有机碳的变化及种植年限的延长，可通过减少微生境中的氧气扩散来影响微生物群落组成。由此可知，土壤pH值在确定微生物群落方面的重要性并不能完全排除其他土壤特性对土壤微生物群落结构方面的影响。因此，在不同种植年限设施菜地黄壤微生物群落组成中，土壤养分可能发挥着重要作用。本研究中，速效钾与土壤细菌和真菌群落有极显著相关关系，该发现具有重要的意义。因为近年来大多数相关研究关注氮、磷容易导致土壤富营养化和地下水污染，而钾由于对地下水污染影响较小，其重要性常常被忽略。本研究发现，土壤理化性质对土壤真菌的影响程度强于细菌，说明真菌可能对土壤质量的变化更敏感。

综上所述，连续种植5年以上显著改变了设施菜地黄壤的化学性质和微生物群落。随种植年限延长，变形菌门和子囊菌门相对丰度逐渐降低，芽单胞菌门相对丰度逐渐增加，放线菌门和绿弯菌门相对丰度呈先增后减趋势。种植年限均对细菌和真菌群落有直接显著影响，且对真菌的影响比细菌更加明显。土壤pH值和速效钾对土壤细菌和真菌群落有直接显著影响。本研究为了解设施菜地黄壤对种植年限的响应提供了较多的见解，并明确了影响土壤微生物群落的主要因素，有助于加强黄壤的质量管理，实现设施蔬菜的可持续发展和土壤质量的改善。