转录组测序筛选口腔鳞状细胞癌中差异表达环状RNA

翟堃 刘絮影 李锦存 胡晨 于丽丽 樊美荣 黄永清 马坚

摘要：目的  利用转录组测序技术对口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织进行测序，筛选OSCC中差异表达的环状RNA（circRNA），并探讨可能与OSCC相关的信号通路。方法  收集3对OSCC患者的癌及癌旁正常组织，提取总RNA，构建circRNA文库，对其进行转录组测序，获得circRNA表达谱，筛选差异表达circRNA并进行GO和KEGG分析；构建ceRNA网络，分析预测circRNA在OSCC中的作用，并利用cytoscape软件对网络进行可视化。结果  本研究鉴定出了差异表达的circRNA281个，上调的有33个，下调的有248个。GO富集分析中主要参与细胞器组织的调节、GTP酶活性的调节；细胞组分主要在锚定连接、P小体；分子功能在核苷三磷酸酶调节活性、GTPase激活剂活性等生物学过程；KEGG主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、调节干细胞多能性的信号通路、ErbB信号通路、细胞粘附连接等通路。最终筛选出7个差异表达的circRNA、2个差异表达的miRNA和3个差异表达的mRNA。结论  通过转录组测序鉴定出口腔鳞状细胞癌circRNA几乎全部为的外显子circRNA，主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、GTP酶活性的调节等通路。

关键词：口腔鳞状细胞癌；环状RNA；转录组测序

中图分类号：R739.8                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.12.001

文章编号：1006-1959（2024）12-0001-06

Transcriptome Sequencing in Screening Differentially Expressed Circular RNAs

in Oral Squamous Cell Carcinoma

Abstract：Objective  To screen the differentially expressed circular RNA （circRNA） in oral squamous cell carcinoma （OSCC） by transcriptome sequencing， and to explore the possible signaling pathways related to OSCC.Methods  Three pairs of cancer and paracancerous normal tissues of OSCC patients were collected. CircRNA library was constructed after extracting total RNA， then transcriptomic sequencing was carried out. The profile of circRNA was identified and annotated to obtain differentially expressed circRNAs， which were analyzed by GO and KEGG. Meanwhile， the ceRNA network was constructed to analyze and predict the role of circRNA in OSCC， and the network was visualized by cytoscape software.Results  In this study， 281 differentially expressed circRNAs were identified， of which 33 were up-regulated and 248 were down-regulated. GO enrichment analysis was mainly involved in the regulation of organelle tissue and GTPase activity. The cell components were mainly anchored junctions and P bodies. Molecular function in nucleoside triphosphatase regulatory activity， GTPase activator activity and other biological processes; KEGG was mainly enriched in the regulation of actin cytoskeleton， signaling pathways regulating stem cell pluripotency， ErbB signaling pathway， cell adhesion and connection. Finally， 7 differentially expressed circRNAs， 2 differentially expressed miRNAs and 3 differentially expressed mRNAs were screened.Conclusion  Transcriptome sequencing identified that almost all of the oral squamous cell carcinoma circRNA are exon circRNA， which are mainly enriched in the regulation of actin cytoskeleton and the regulation of GTPase activity.

Key words：Oral squamous cell carcinoma;Circular RNA;Transcriptome sequencing

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinomas， OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤[1]。全球唇癌、口腔癌和咽喉癌的发病人数约为52.95万例，死亡人数约为29.23万人，分别占所有癌症病例的3.8%和癌症死亡人数的3.6%[2]。OSCC早期症状与良性病变不易区分，发现时已进入中晚期，其平均5年生存率为50%[3]。因此，寻找与疾病发生和发展相关的肿瘤标志物，实现早诊、早治及预后判断至关重要。CircRNA是一种特殊的内源性非编码RNA，1976首次在仙台病毒中被发现，随后在真核生物中也出现相关报道[4，5]。近年来，已经在不同的细胞系和物种中发现了大量circRNA。作为一类非编码RNA家族的成员，其在真核生物转录组中广泛表达，其与线性RNA的不同之处在于其3′端与5′端相连，形成闭合的共价环状结构。该结构使circRNA耐酶消化，较线性RNA更加保守和稳定[6]。目前，circRNA被认为与mRNA相似，是mRNA前体修饰的重要产物[7]。同时，circRNA可作为竞争性的内源性RNA（ceRNAs），多个circRNA具有miRNA反应元件（MREs），使其能够与miRNA相互作用，并阻止miRNA与靶mRNA的相互作用，进而来调控靶基因表达[8-10]。越来越多的研究发现[11，12]，circRNA的异常表达可引起正常组织中基因表达紊乱，从而导致克隆增殖异常和病理病变，是多种致癌因素共同作用的结果。大量研究表明[13，14]，circRNA已被证实参与了多种疾病的发生发展，包括乳腺癌、泌尿系统癌。另外，Li L等[15]研究表明，Circ_LPAR3在OSCC中表达上调，并通过miR-513b-5p激活VEGFC和AKT1来促进了OSCC的进展。最近的研究发现，部分circRNA具有较为明显的抑癌效应[16]和促癌作用[17]。CircRNA在OSCC细胞系和组织中显著的差异表达，可作为恶性肿瘤的新型分子标志物。所有这些特征使得circRNA具有潜在分子诊断标志物价值，但其表达特性在OSCC中报道较少。本研究应用3对口腔鳞状细胞癌患者组织进行转录组测序，筛选出与OSCC发生发展相关的差异表达circRNA并探索其相关通路，构建相关的竞争性内源RNA网络，期望寻找出OSCC的相关生物标记物。

1材料与方法

1.1研究对象  研究对象来源于2019年2月-10月宁夏医科大学总医院口腔颌面外科病房住院行OSCC手术患者3例，样本采集均征得患者同意，且签署知情同意书。本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会审批通过后开展。研究对象疾病诊断均由专科医师及病理诊断明确后纳入。纳入标准：①病理学诊断为OSCC（舌/颊/牙龈部位）的癌及癌旁正常组织；②患者术前均未接受过放化疗；③原发性肿瘤；④首次行OSCC病损切除术；⑤无其他肿瘤及相关系统性病史。排除标准：①继发性肿瘤；②术前接受过放化疗；③有其他肿瘤及相关系统性病史。

1.2提取总RNA  使用Trizol Reagent提取组织样本中的总RNA，其质量要求通过Agilent 2100 BioAnalyzer检测结果RIN≥7，28S和18S的RNA的比值≥1.5∶1，起始量的要求范围是2～3 μg。

1.3文库构建及测序构建  circRNA的链特异性文库，去除总RNA中的rRNA并进行RNA片段化处理，然后进行第一链和第二链cDNA合成，继而修复cDNA尾端、加dA尾、连接接头，再进行PCR扩增，质检合格后混合文库并测序。

1.4 CircRNA差异表达分析  使用limma软件根据circRNA的ID，提取表达量结果进行统计分析，得到circRNA的差异分析结果。差异circRNA筛选标准为：|log2FC|>=1且P值≤0.05，其中实验或对照组中至少一组表达量平均值≥0.5，表达的样本数占总的样本数的2/3或实验组或对照组中至少一组中有2/3以上的样本表达此基因，且要求该组的平均表达量≥1。

1.5 CeRNA网络构建  为了进一步研究circRNA在OSCC中的可能机制，首先基于差异circRNA-mRNA和circRNA-miRNA的共表达分析。共表达分析的基本方法是对差异circRNA、mRNA和mircoRNA的全部样本表达值进行相关性计算，筛选出显著相关的circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。

1.6 GO和KEGG功能注释富集分析  利用KOBAS数据库将得到的ceRNA网络中circRNA进行GO（Gene Onotology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）分析，进一步了解circRNA可能参与的生物学功能。

2结果

2.1 CircRNA在OSCC中的表达谱  通过转录组测序技术共鉴定出5156个circRNA，其中4655个已知，501个未报道。统计分析显示281个显著差异表达circRNA中，上调的有33个（11.74%），下调的有248个（88.26%），见图1A、1B。其中，上调和下调的差异表达最为明显的前5个circRNA，见表1。OSCC组织标本中circRNA表达水平有明显的差异，并呈聚类关系见图2。此外，还发现外显子circRNA数量几乎占差异表达CircRNA的100%，见图3A、3B。

2.2 差异表达circRNA富集分析  GO富集分析包括分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）、生物过程（biological process）3部分。其中在分子功能部分中差异表达circRNA主要富集在GTP酶激活剂活性、核苷-三磷酸酶调节活性、GTP酶调节活性催化活性，小GTP酶结合、GTP酶结合等；在细胞组分中主要参与了细胞质、粘着连接、细胞核、细胞连接等；生物学过程含有细胞骨架组织、GTP酶活性的调节、细胞器组织、大分子修饰、调节小GTP酶介导的信号转导等生物学过程，见图4A。KEGG富集分析结果显示：差异表达circRNA主要参与了，肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞连接，调节干细胞多能性调节信号通路，缝隙连接、TGF-β信号等通路，见图4B。

2.3 CeRNA网络构建  基于测序结果分析的circRNA-miRNA相互作用、miRNA-mRNA相互作用的预测，最终筛选出7个差异表达的circRNA、2个差异表达的miRNA和3个差异表达的mRNA构建circRNA-microRNA-mRNA网络，见图5。7个差异表达的circRNA和2个miRNA形成8对相互作用，2个差异表达的miRNA和3个差异表达的mRNA形成3对相互作用，7个差异表达的circRNA和3个差异表达的mRNA形成12对相互作用，最终构成包含12个节点和23条线的circRNA-microRNA-mRNA调控网络。

3讨论

口腔癌是一种常见的头颈恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%～4%，其中90%以上的口腔癌为OSCC[18]。其发病原因仍不清楚，寻找肿瘤的生物标志物成为提高该类疾病治疗水平及预后的一个研究热点。随着生物信息学的发展，研究显示circRNA与OSCC的发生发展有相关性。在OSCC研究中已经发现异常表达circRNA有作为潜在生物标志物的可能，比如Li B等[19]通过高通量测序及逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证了hsa_circ_0008309口腔鳞状细胞癌组织中表达明显下调且与病理分化有显著相关性。

本研究通过转录组测序获得3对OSCC癌及癌旁正常组织标本中circRNA的表达谱。共鉴定出5156个circRNA；其中大部分circRNA存在于circRNA数据库为已知（n=4655，96.44%），少部分为未报道的circRNA（n=501，3.56%）。281个差异表达circRNA中，上调的有33个（11.74%），下调的有248个（88.26%）。此外，还发现外显子circRNA数量几乎占差异表达circRNA的100%；但既往研究报道与OSCC相关的circRNA，本次转录组测序结果中并未筛查出。火山图和分层聚类热图显示，与相邻组织标本相比，OSCC组织标本中circRNA表达水平有明显的差异，并呈聚类关系。

GO富集分析不管在分子功能部分中还是生物学过程中差异表达circRNA都参与了GTP酶的相关的信号通路。有研究表明[20]，GTP酶与肿瘤的发生发展息息相关。在KEGG和GO分析的细胞组分部分结果显示，差异表达circRNA都参与了细胞连接等信号通路。细胞连接在肿瘤的扩散能力中可能具有重要作用。有研究表明[21]，部分基因的表达可以破坏细胞-细胞连接结构，从而影响细胞的侵袭能力。KEGG富集分析显示，差异表达circRNA与TGF-β信号通路及调节干细胞多性能信号通路等也有显著相关性。其中TGF-β信号通路也是circRNA对OSCC作用最显著的信号通路。Zhang X等[22]研究表明，circLDLRAD3在OSCC中下调，并通过海绵miR-558调控TGF-β信号通路，抑OSCC的发展并影响EMT过程。TGF-β信号转导异还有可能导致多种疾病的发生，比如胚胎发育异常、肿瘤、组织纤维化、心血管疾病和免疫性疾病等。调节干细胞多功能性的信号通路也是circRNA对OSCC作用最显著的信号通路之一。

研究共构建出41个ceRNA网络，其中上调的有7个，下调有34个。有的circRNA可与多个microRNA相结合，与每个microRNA也可有多个结合位点；有的circRNA只可与一个microRNA相结合，且与microRNA结合位点较少，只有数个；其中CBT15_circR_3482可与79个microRNA进行结合，数量为最多；hsa-miR-1273h-5p与CBT15_circR_3482结合位点数目为85个，hsa-miR-6780a-5p与CBT15_circR_3482结合位点数目为70个，hsa-miR-3192-5p与CBT15_circR_3482结合位点数目为69个，远高于其他microRNA与circRNA的结合位点数目。在ceRNA网络中，CBT15_circR_3482的表达量为上调，CBT15_circR_2486、CBT15_circR_2485、CBT15_circR_227、CBT15_circR_4852、CBT15_circR_1731的表达量均为下调。CBT15_circR_3482的表达量上调，且可与79个microRNA进行结合，结合位点数目远高于其他circRNA与这些microRNA的结合位点数目，可推测出CBT15_circR_3482可能作为竞争性的内源性RNA（ceRNAs），通过与microRNA（hsa-miR-1273h-5p、hsa-miR-6780a-5p、hsa-miR-3192-5p等）相结合，作为microRNA海绵来隔离microRNA，并阻止microRNA与靶mRNA的相互作用，来调控靶基因表达。CircRNA-microRNA网络显示每个差异表达circRNA与多个肿瘤相关microRNA相关，证实circRNA通过microRNA海绵效应促进肿瘤的发展。到目前为止，关于circRNA在OSCC中的作用的研究报道依旧较少，筛选OSCC中潜在的circRNA标志物并探究其潜在的机制尤为重要。circRNA的主要功能是通过miRNA反应元件（MRE）结合并吸收rna结合蛋白。与此同时，许多研究也发现一些circRNA可以被翻译[23，24]。CircRNAs在OSCC中起microRNA海绵的作用，其潜在的生物学功能有待进一步研究验证。本次研究通过全转录组测序，获得circRNA及microRNA表达谱，进行了相关通路分析及ceRNA网络预测，但是后续仍需要通过实验验证。

本研究通过转录组测序技术获得3对OSCC癌及癌旁正常组织标本中circRNA的表达谱。筛选出差异表达circRNA共281个，并探索了其相关的信号通路，其可能通过GTP酶的相关的信号通路、TGF-β信号通路及细胞连接等通路影响OCC的发生发展。同时，构建出41个ceRNA网络，其中上调的circRNA有7个，下调circRNA有34个。

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