细胞外基质硬度对人前列腺癌细胞可塑性调控作用的研究

郑雨 马磊 李睿智 牟洁 李菁 王栋 祝海

［摘要］ 目的

探讨细胞外基质硬度对人前列腺癌细胞LNCaP可塑性调控的作用。

方法 将人LNCaP细胞分别于杨氏模量为3 GPa（A组）、20 kPa（B组）、6 kPa（C组）和1 kPa（D组）四种不同硬度细胞外基质培养皿中培养1周。采用明场显微镜及荧光显微镜观察各组细胞在不同硬度基底上的形态；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术检测各组细胞的管腔细胞标志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底细胞标志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA的表达水平。

结果 明场显微镜及荧光显微镜观察结果显示，A组人LNCaP细胞呈现典型铺展上皮细胞形态，而B～D组均呈现团聚小细胞片状态，且D组细胞形成了三维类器官结构。RT-qPCR结果显示，四组人LNCaP细胞中KI67、P63基因表达水平无显著差异（P＞0.05）；B组PCNA基因表达水平显著高于A、C组（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05）；B组CK5基因表达水平显著高于其他三组（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05）；D组AR、CK8、CK18、PSA基因表达水平显著高于其他三组（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）。

结论 硬度较低（杨氏模量1 kPa）的细胞外基质环境能较好维持人LNCaP细胞的管腔细胞特征，而硬度较高（杨氏模量20 kPa）的细胞外基质能使人LNCaP细胞呈现出中间态细胞表型，或许是导致前列腺癌发生的因素之一。

［关键词］ 前列腺肿瘤；细胞系，肿瘤；细胞外基质；细胞可塑性

［中图分类号］ R737.25;R329.24    ［文献标志码］ A

前列腺癌发生发展的过程中往往伴随着癌细胞可塑性的变化。细胞可塑性是指一种类型的细胞变成另一种类型细胞的过程[1]。癌细胞的可塑性特性可使前列腺癌细胞逃避靶向药物作用，从而促进肿瘤细胞存活，与肿瘤侵袭性增加密切相关，给临床肿瘤治疗增加极大难度[2]。细胞外基质是肿瘤早期或中期微环境发生改变的因素之一，可影响细胞的行为和表型[3]，与实体肿瘤的发生有着紧密的联系[4]。实体肿瘤的发生发展往往同时伴随着肿瘤硬度的增加[5]。细胞外基质的成分和生物力学性质的改变可为前列腺癌细胞创造适当的生长条件，从而促进前列腺癌发展及癌细胞的侵袭性和耐药性[6]。目前国内外有关细胞外基质对前列腺癌细胞可塑性影响的研究较少，本研究在实验室前期建立的细胞外基质硬度可调的基础上，探究细胞外基质硬度对人前列腺细胞LNCaP的可塑性调控作用，以求为控制前列腺癌进展提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人LNCaP细胞、细胞培养基1640、胎牛血清、PBS磷酸缓冲液均购自武汉普诺赛生命科技有限公司，青霉素、链霉素、两性霉素B溶液的三抗溶液购自上海生物科技股份有限公司，胰蛋白酶购自青岛艾菲特生工生物科技有限公司，反转录试剂及其试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，Trizol试剂、Nanodrop仪购自美国Thermo Fisher科技有限公司，OCT包埋剂、倒置荧光显微镜购自美国赛默飞世尔科技有限公司，DAPI荧光染料购自北京索莱宝生物科技有限公司，电动明场显微镜购自日本Nikon公司，4%多聚甲醛固定液购自武汉卡诺斯科技有限公司，蔗糖购自上海阿拉丁生化科技有限公司，实验用离心管、培养皿和枪头耗材购自上海依科赛生物技术有限公司。

1.2 人LNCaP细胞的分组与培养

将实验室前期配制好的细胞外基质溶液[7]倒入培养皿中孵育1 h，用PBS磷酸缓冲液清洗普通聚苯乙烯培养皿基底（杨氏模量约为3 GPa）作为A组，将不同容量的细胞外基质溶液倒入培养皿中，置于无菌干燥盒中37 ℃干燥48～72 h，得到杨氏模量约为20 kPa（B组）、6 kPa（C组）和1 kPa（D组）的胞外基质基底。将人LNCaP细胞在含体积分数0.05 CO2、温度36～37 ℃、湿度95%的环境下培养7 d后，在电动明场显微镜下观察细胞，当细胞铺占整个培养皿约80%的面积时，用质量浓度2.5 g/L的胰蛋白酶将大片状细胞完全消化后，移至脱落细胞培养皿进行计数。分别取约3×105个细胞量种植于上述四组细胞外基质基底上进行培养，四组细胞每天更换相应培养基5 mL，培养环境同前，培养7 d后备用。

1.3 显微镜观察各组细胞形态

使用电动明场显微镜观察1.2中各组细胞形态并拍照。用4%多聚甲醛固定四组细胞30 min，每组细胞均依次浸没于质量浓度150、300 g/L的蔗糖溶液中各24 h进行脱水处理，随后包埋于OCT包埋剂中进行冰冻切片。加入DAPI荧光染料染色30 min后封片，随后进行荧光显微镜观察拍照。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞相关基因表达水平

取1.2中各组细胞，每组各取部分使用Trizol试剂提取人LNCaP细胞总RNA，使用Nanodrop仪测定RNA浓度与纯度。按照反转录试剂盒使用说明书将RNA反转录为cDNA，使用RT-qPCR法检测各组细胞中管腔细胞标志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底细胞标志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA表达水平，以GAPDH为内参，引物名称及其序列见表1。

1.5 统计学方法

使用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以[AKx-D]±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结  果

2.1 四组细胞的形态学比较

电动明场显微镜及荧光显微镜观察结果显示，A组人LNCaP细胞铺展良好，呈现典型的单层上皮细胞形态，B～D组中人LNCaP细胞以团聚的小细胞片形式生长，且D组人LNCaP细胞生长为三维类器官结构。见图1、2。

2.2 四组细胞中管腔细胞标志物、基底细胞标志物及增殖基因表达水平比较

RT-qPCR检测结果显示，B组细胞增殖基因PCNA表达水平显著高于A、C组（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05），增殖基因KI67表达水平四组间无显著差异（P＞0.05）；D组管腔细胞标志物基因AR、CK18、CK8、PSA表达水平显著高于其他三组（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）；B组基底细胞标志物基因CK5表达水平显著高于其他三组（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05），而基底细胞标志物基因P63表达水平四组间无显著差异（P＞0.05）。见表1。

3 讨  论

传统观点认为细胞外基质只是一个简单的组织细胞支持结构，但随着研究的不断深入，细胞外基质的结构复杂性和功能多样性被逐渐认识[8-9]。细胞外基质是细胞赖以生存的微环境，且直接参与细胞间的力学转导、信息传递、调节干细胞行为等一系列生物学活动[10-11]。癌细胞的增殖、存活及其侵袭能力也在很大程度上依赖于肿瘤微环境中的细胞外基质[12]，反之癌细胞也可重塑胞外基质，两者相互作用从而导致肿瘤的生长、扩散及转移[13-14]。不同硬度的细胞外基质可以调节肿瘤的基因型和表型，诱导癌细胞表型变化[15]。肿瘤转移的基本特征包括侵袭性、可塑性、微环境调节能力及在侵袭组织中定殖能力，这些特征都与细胞外基质的性质（组成、密度和硬度等）紧密相关[16-17]。

大多数前列腺癌细胞属于管腔细胞类型，其管腔细胞标志物AR和PSA基因表达水平较高[18]。本研究选择人LNCaP细胞进行实验验证，原因为LNCaP细胞系具有较为明显的上皮细胞特性，细胞分裂速度较快[19]，对雄激素较敏感[20]，且表达管腔细胞的关键生物标志物基因AR、PSA等，这些特点使其广泛应用于前列腺癌的研究。本研究结果显示，不同硬度的细胞外基质能够影响人LNCaP细胞形态，人LNCaP细胞在软基底上较易团聚成小细胞片，尤其是在D组基底（杨氏模量1 kPa）上形成三维类器官球状结构，而在较硬的A组基质（杨氏模量3 GPa）上铺展良好，形成紧密的单层上皮细胞层，这意味着硬基底可能促进人LNCaP细胞的相互连接和迁移。

本研究针对人LNCaP细胞增殖能力，检测了细胞中两种增殖标志物基因KI67和PCNA，结果显示B组（杨氏模量20 kPa）PCNA表达水平显著高于A、C组（杨氏模量3、6 kPa），而另一种增殖基因KI67表达水平四组间无显著差异。该结果表明细胞外基质硬度对于肿瘤细胞增殖能力的调节可能是非线性的，即在某些特定细胞外基质硬度范围内，肿瘤细胞增殖相关基因表达才随硬度增高而上调，该结果有待后续深入研究。

肿瘤细胞的可塑性是近年来前列腺癌研究领域的热点之一。本研究结果显示，D组细胞的管腔细胞标志物AR、CK8、CK18、PSA表达最高，表明软细胞外基质环境更有利于管腔细胞的表型维持和生长。另外，B组细胞的基底细胞标志物CK5表达水平显著高于其他三组，该结果表明基底软硬程度可调节LNCaP细胞的可塑性。在B组细胞外基质中，人LNCaP细胞同时具备管腔细胞和基底细胞的特征，呈现出中间态细胞的特征。中间态细胞是人胚胎发育过程中短暂出现的一种细胞类型，在成人前列腺组织中数量减少，中间态细胞可能是前列腺癌的重要细胞来源。本研究结果提示细胞外基质硬度的增强可能在前列腺癌中间态细胞形成的调控中发挥作用。

另外，本研究具有一定的局限性，如体外实验与体内真实情况具有一定差异。本研究所利用的体外模型是基于不同厚度的细胞外基质所呈现硬度（杨氏模量）的不同[21-22]，然而体内影响细胞外基质的肿瘤微环境更为复杂，如细胞外基质的重排、交联、沉积及特定细胞外基质蛋白的降解等[23-24]，另外体内外细胞外基质的蛋白成分也有一定差异[25]。上述差异是本研究难以模拟的部分，有待后续研究进一步改进。

本研究比较了四种不同硬度的细胞外基质对人LNCaP细胞的可塑性影响，发现硬度较低（杨氏模量1 kPa）的细胞外基质环境能较好维持前列腺细胞的管腔细胞特征，而硬度较高（杨氏模量20 kPa）的细胞外基质能使人LNCaP细胞呈现出中间态细胞表型，或许是导致前列腺癌发生的因素之一。

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