加拿大与云南烟叶中性香味成分的差异性分析

孙正光 席高磊 王泽宁 杨鹏飞 王秋领 杨靖 陈芝飞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.027

摘要：为揭示加拿大和云南优质烟叶中性香味成分的差异，使用同时蒸馏萃取（SDE）和液-液萃取法（LLE）获得2种烟叶的中性香味成分，利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析中性香气成分的种类和含量，通过正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）明确2种烟叶中性香味成分的差异性。结果表明，加拿大烟叶共鉴定出59种中性香味成分，总含量为92.02 μg/g，云南烟叶共鉴定出63种中性香味成分，总含量为113.91 μg/g；云南烟叶中类胡萝卜素降解产物含量高于加拿大烟叶，加拿大烟叶中棕色化反应产物类和其他类成分含量高于云南烟叶；基于OPLS-DA法中重要性投影值（VIP>1）共筛选出18种差异中性香味成分，其中云南烟叶香气贡献率较突出的有12种中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-环氧-β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大马酮、香叶基丙酮、二氢大马酮、巨豆三烯酮c、棕榈酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合欢基丙酮和苯乙醇；加拿大烟叶含量较突出的有6种香气成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羟甲基二氢呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。得出OPLS-DA方法能较好地区分加拿大与云南烟叶中性香味成分的差异，可以为烟叶产地的溯源提供方法支撑。

关键词：烟叶；萃取；中性香味成分；正交偏最小二乘法判别分析；差异性分析

中图分类号：S572.01  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）10-0197-06

收稿日期：2023-06-20

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（编号：81903507）；河南中烟工业有限责任公司科技项目（编号：2021410001300094）。

作者简介：孙正光（1998—），男，云南大理人，硕士研究生，主要从事烟草香精香料研究。E-mail：zgsun914@163.com。

通信作者：王秋领，高级工程师，主要从事香精香料和烟草化学研究，E-mail：jrwql395139@sina.com；陈芝飞，硕士，研究员，主要从事香精香料和烟草化学研究，E-mail：chenzhifei@126.com。

加拿大烟叶具有特征性强、香气优雅、劲头适宜等特点，在卷烟叶组配方中作为主料烟使用时，具有提升卷烟香气格调、收敛烟气和柔和吸味的作用。目前，加拿大烟叶仅在我国一二类卷烟品牌（如利群等）的叶组配方中使用，占比为5%左右，对巩固和彰显卷烟醇和淡雅、柔绵细腻的风格特征贡献较大［1］。因此，明确加拿大与国内优质烟叶的香味成分差异，诠释其不同风格特征的物质基础，能为加拿大烟叶的替代工作提供有效支撑，促进国家烟草行业的高质量发展。

卷烟抽吸品质是多种致香物质协同作用的结果［2-3］。李炎强等对云南烟叶香味成分进行深入的分离鉴定研究，以了解云南烟叶感官特征与物质组成的关系［4］；陈晨等利用国内卷烟中性和碱性香味成分的差异性有效区分了不同风格类型的卷烟［5-6］。传统可视化分析为无监督的多元变量统计，且无法获得特征差异性物质［7］，而正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）将正交信号矫正（OSC）与偏最小二乘判别分析（PLS-DA）相结合，为有监督的判别分析，能有效去除不相关的差异因素来筛选组间的差异变量［8］。貊志杰等运用 OPLS-DA判别分析方法探究了不同烤烟品种石油醚提取物的差异性，有效区分了其香韵风格形成的物质基础［9］；Esteves等利用OPLS-DA法快速高效准确地对不同蘑菇样本进行了鉴定区分［10］；Huang等通过OPLS-DA法分析了品种、栽培方法和产地对红江柑橘挥发性成分的影响及其差异性［11］。因此，本研究利用OPLS-DA法对比分析加拿大与云南烟叶中性香味成分的差异性，以期为进口优质烟叶的替代和开发提供数据支撑和方法途径。

1  材料与方法

1.1  主要仪器与试剂

（1）仪器：高速多功能粉碎机（2500Y，永康市铂欧五金制品有限公司）、气相色谱-质谱联用仪（8890-5977B，美国安捷伦科技有限公司）、同时蒸馏萃取装置（郑州赛克斯玻璃仪器有限公司）、低温冷却液循环泵（DLSB-5-20，郑州长城科工贸有限公司）、数显恒温水浴锅（HH-S2，江苏金怡仪器科技有限公司）、调温电热套（ZDHW，北京中兴伟业仪器有限公司）。

（2）试剂材料：二氯甲烷（色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司）、盐酸、无水硫酸钠、氢氧化钠（分析纯，烟台市双双化工有限公司）、2，6-二氯甲苯（98.6%，北京百灵威科技有限公司）；A1～A5为加拿大烟叶，B1～B5为云南烟叶，均为C3F等级（河南烟草工业有限责任公司提供）。

1.2  试验方法

1.2.1  同时蒸馏萃取（SDE）和液-液萃取法（LLE）获得烟叶中性成分

将加拿大和云南烟片分别用多功能粉碎机打碎成烟末，称取30.0 g烟末于1 000 mL圆底烧瓶中并加入400 mL纯净水，250 mL 茄型瓶中放入100 mL二氯甲烷，同时蒸馏萃取2.5 h得到二氯甲烷萃取液。二氯甲烷经5%NaOH碱洗5次，5%HCl酸洗5次后获得中性成分萃取液（20 mL/次）。中性成分萃取液经无水Na2SO4干燥后常压浓缩至1 mL，加入100 L 2，6-二氯甲苯（0.556 7 mg/mL）内标溶液后通过GC-MS进行化学成分分析。

1.2.2  中性成分的GC-MS检测条件

色谱条件：Agilent DB-5 MS毛细管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；进行口温度：280 ℃；载气：99.999%高纯度氦气，流速：1.0 mL/min；进样量为1.0 μL；分流模式为分流进样，分流比为2 ∶1。升温程序：初始温度为40 ℃，保持10 min；2.5 ℃/min升至190 ℃，保持25 min；1.5 ℃/min升至270 ℃，保持0 min。

质谱条件：采用SCAN模式，传输线温度为 280 ℃；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为 150 ℃；离子源为XTR-EI源，电子能量为70 eV；溶剂延迟时间为8 min；扫描范围：35～550 amu。

1.2.3  数据分析

NIST 20谱库检索结合保留指数对比分析进行化合物定性分析；采用内标-半定量法进行定量分析；Origin 2018绘制雷达图，结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统绘制中性成分指纹图谱；SIMCA 14.1进行OPLS-DA分析并计算重要性投影值（VIP）；用SPSS 27.0 进行独立样本t检验计算P值；用TBtools绘制聚类热图。

2  结果与分析

2.1  烟叶中性香味成分指纹图谱

根据色谱组分保留时间及丰度绘制烟叶中性成分指纹图谱，具体如图1所示，不同地区烟叶中性成分种类基本相似，但含量存在明显差异性。

2.2  烟叶中性香味成分总体情况

经谱库检索和保留指数定性分析，加拿大烟叶共鉴定出83种化合物，而云南烟叶共鉴定出89种。其中，中性香味物质共69种，加拿大烟叶59种（总含量92.02 μg/g），云南烟叶63种（总含量 113.91 μg/g）（表1）。加拿大烟叶中类胡萝卜素降解形成的香味成分共18种，西柏烷类降解形成的香味成分1种，棕色化反应形成的香味成分10种，苯丙氨酸转化产物4种，其他类26种；与之对应，云南烟叶中不同种类的香味成分分别为19、1、11、4、28种。由图2可知，加拿大烟叶各成分占比表现为类胡萝卜素类降解产物＞其他类＞西柏烯类降解产物＞棕色化反应产物类＞苯丙氨酸类降解产物，云南烟叶表现为中类胡萝卜素类降解产物＞西柏烯类降解产物＞苯丙氨酸类降解产物＞其他类＞棕色化反应产物类。

云南烟叶风格特征主要表现为清甜香韵，香气飘逸；加拿大烟叶则表现为焦甜香韵，香气浓郁丰满，透发性强。云南烟叶中类胡萝卜降解产物含量占比最高且远高于加拿大烟叶，这类成分是云南烟叶清香风格的主要内在因素［12］。加拿大烟叶的棕色化反应产物类含量明显高于云南烟叶，这是加拿大烟叶呈现焦甜感，形成浓香风格的成因之一。

2.3  烟叶中性香味成分差异性

为明确加拿大和云南烟叶中性香味成分的差异性，以69种中性香味成分和不同地区作为因自变量，通过OPLS-DA法区分2种不同地区烟叶中性香味成分的差异，如图3-a所示。该模型判别分析中R2x为0.787，R2y为0.994，Q2为0.959，因自变量R2和预测指数Q2均大于0.5，表明模型稳定可接受［13］。经过200次置换响应检验，模型的预测指数Q2与Y轴相交于负半轴（图3-b），说明该模型拟合有效，不存在模型过拟合［14］，因此该模型结果可鉴别加拿大烟叶与云南烟叶的中性香味成分差异性。

通常认为VIP大于1可作为解释区分2个不同样本物质的差异性成分，因此以显著性差异且重要性投影值大于1的中性香味成分（P<0.05且 VIP>1）为筛选标椎［13］（表1、图3-c），进一步筛选加拿大与云南烟叶中关键差异性中性香味成分。由图4可知，共筛选出18种关键差异性中性香味成分，其中类胡萝卜素降解产物9种，西柏烯类降解产物1种，棕色化反应产物类2种，苯丙氨酸类降解产物2种，其他类4种。聚类热图分析表明，区域A为加拿大烟叶含量较突出的有6种香气成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羟甲基二氢呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮；区域B为云南烟叶中含量较突出的有12种中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-环氧-β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大马酮、香叶基丙酮、二氢大马酮、巨豆三烯酮c、棕榈酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合欢基丙酮和苯乙醇。

类胡萝卜素类降解形成的香味成分阈值低、刺激性小、香气质好、对烟叶香气贡献率大，是影响烟叶香气质和香气量的重要组分［15］。巨豆三烯酮具

有烟草香和辛香底韵，具有增强烟香、调和烟气的作用［16］，巨豆三烯酮的4个同分异构体在云南烟叶中显著存在，但相关研究表明，含量最高的巨豆三烯酮b对烟叶香气质有负向作用［17］，也侧面凸显卷烟抽吸品质是多种致香物质及其含量协同作用的结果［18］。李章海等提出并建立了9种中性香气成分与烟叶香型指数之间的回归模型，其中茄酮对浓香风格贡献较大，大马酮及棕榈酸甲酯对清香风格贡献较大［19］，本研究结果与之相一致。茄酮作为典型的类西柏烷类物质，它可以调和香气，从而使香气更加持久。徐秀娟等研究发现，糠醛与卷烟抽吸透发性关系密切［20］，而本研究的加拿大与云南烟叶中糠醛含量呈极显著性差异（P=0.003<0.01），这或许是加拿大烟叶香气浓郁，透发性强的原因之一。苯乙醇带有甜香、坚果香，苯乙醛具有花香、清甜香，苯丙氨酸类降解产物贡献云南烟叶的果香、清香风格［21-22］。加拿大烟叶其他类差异中性香味成分氧化石竹烯、α-石竹烯、α-香附酮皆为倍半萜类化合物，倍半萜类化合物可以增加香气的透发持久性。

3  结论

通过SDE和LLE获得了加拿大和云南烟叶的中性成分，GC-MS分析测定了不同烟叶中性香气成分的种类和含量。 2 种烟叶共检测出69种中性香味物质，加拿大烟叶共鉴定出59种中性香味成分，云南烟叶共鉴定出63种，成分种类基本相似，但各类物质的含量存在差异性；以P<0.05且VIP>1为标准，通过OPLS-DA法鉴别加拿大烟叶与云南烟叶的中性香味成分的差异性，筛选得到18种差异中性香味成分，其中云南烟叶中含量较突出的有12种中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-环氧-β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大马酮、香叶基丙酮、二氢大马酮、巨豆三烯酮c、棕榈酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合欢基丙酮和苯乙醇；加拿大烟叶含量较突出的有6种香气成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羟甲基二氢呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。

本试验仅对比分析了加拿大与云南烟叶中性香味成分的差异性，初步明确了2种烟叶不同风格特征的中性香味物质基础，为加拿大烟叶的替代工作提供了有效的数据支撑。但卷烟品质的优劣是多种致香成分协同作用的结果，后续研究会进一步增加香味成分种类，如酸性、碱性、糖苷、糖酯类化合物等。并结合活性阈值和分子感官科学，以特征化学成分为原料模拟调香，使优质进口烟叶特征风格再现，从而降低国内优质卷烟发展对进口烟叶的依赖性，为凸显及固化产品风格特征提供技术保障。

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