?山苍子油对猕猴桃溃疡病菌的抑菌活性及应用研究?

颜志豪　董卫国　左仁芳　杨欣朋　李晓刚

摘要：采用室内平板抑制试验评价抑菌效果的方法，检测出山苍子油对猕猴桃溃疡病菌表现明显的抑制作用；对分离纯化的湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分子生物学鉴定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；通过乳化剂筛选，找到最佳复配乳化剂组合SK-33SC：YUS-D935=1∶1（质量比），并配制出25%山苍子油EW；采用比浊法测定25%山苍子油EW对猕猴桃溃疡病菌的EC50值为8.581mg/L，回归方程为y=-2.21+2.38x，相关系数为0.965；田间试验结果表明，25%山苍子油EW 200倍稀释液对猕猴桃溃疡病秋季防效达到82.69%、春季防效达到78.92%，且较2%春雷霉素水剂（加收米）以400倍液喷雾的秋季防效高60.91%、春季防效高38.30%。

关键词：猕猴桃；溃疡病；山苍子油；乳化剂

中图分类号：S436.634文献标识码：A文章编号：1006-060X（2024）05-0072-07

Inhibitory Activity and Field Control Effect of Litsea cubeba Oil on

Pseudomonas syringae pv. actinidiae

YAN Zhi-hao1，2，DONG Wei-guo3，ZUO Ren-fang4，YANG Xin-peng1，2，LI Xiao-gang1，2

（1. College of Plant Protection， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Provincial Engineering Research Center of Pest Early Warning and Control， Changsha 410128， PRC; 3. Plant Protection and Inspection Station of Luxi County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Luxi 416100， PRC; 4. Plant Protection and Inspection Station of Fenghuang County Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Fenghuang 416200， PRC）

Abstract： The indoor plate inhibition test confirmed the inhibitory effect of Litsea cubeba oil on Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The pathogen causing kiwifruit canker in western Hunan was isolated and identified as P. syringae pv. actinidiae based on the molecular evidence. The composition of the emulsifier combination was optimized as SK-33SC∶YUS-D935=1∶1 （mass ratio）， and L. cubeba oil 25% EW was prepared. The median effective concentration （EC50） of L. cubeba oil 25% EW against P. syringae pv. actinidiae was determined as 8.581 mg/L by turbidimetry， with the regression equation of y=-2.21+2.38x （r=0.965）. The field experiment results showed that the control effect of the 200× diluent of L. cubeba oil 25% EW on kiwifruit canker reached 82.69% in autumn and 78.92% in spring， which were 60.91% and 38.30% higher than those of 400× diluent of 2% kasugamycin aqueous solution in autumn and in spring， respectively.

Key words： kiwifruit; canker; Litsea cubeba oil; emulsifier

猕猴桃属猕猴桃科猕猴桃属多年生藤本植物[1]，因其果实富含维生素、氨基酸和矿物质等多种人体必须营养物质，被称为水果之王，备受消费者青睐[2]。

猕猴桃溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性细菌性病害，主要危害猕猴桃的新梢、枝蔓、叶片和花蕾，以危害1～2 a树龄枝梢为主，降低座果率，形成的果实较小或畸形，该病菌传播快，病害来势凶猛，发病严重时导致树体死亡，流行年份致使全园濒于毁灭，造成重大经济损失，此病菌被列为全国植物检疫对象。关于猕猴桃溃疡病的病原菌，存在一些不同的观点和理论，美国学者Opgenorth等[3]

在1983年将该病原菌定为丁香假单胞菌李致病变种（P. syringae. pv. morsprunorum），后来日本学者Takikawa等[4]将猕猴桃溃疡病的病原菌鉴定为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae），此外，也有其他学者报道称猕猴桃溃疡病的病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种（P. syringae pv. syingae）[5， 6]。世界上主要商业种植猕猴桃的国家都不同程度的受到了猕猴桃溃疡病的危害，国内四川、陕西、湖南、贵州等地猕猴桃种植区发生严重，极大地影响了猕猴桃产业健康发展[7-9]。猕猴桃溃疡病的发病原因比较复杂，匡美美等[10]认为湘西州猕猴桃溃疡病的发病率和病情指数与栽培品种、海拔高度、果园管理水平等因素有关。目前防治猕猴桃溃疡病的主要有春雷霉素、噻唑锌、王铜、噻霉酮等药剂。李黎等[11]通过室内抑菌率实验研究发现2%春雷霉素水剂500倍液的平均抑菌率为69.34%，具有明显的抑菌效果。杨贵琴等[12]发现通过农药复配对猕猴桃溃疡病进行防治效果较好，其中四霉素与噻霉酮按照一定比例复配后其EC50值能达到1.14 mg/L，共毒系数为124.96，田间防效为68.12%；四霉素与戊唑醇按照一定比例复配后EC50值能达到1.46 mg/L，共毒系数为123.73，田间防效为66.83%。这些化学农药在实验室内对猕猴桃溃疡病的病原菌具有明显的抑制作用，但田间防治效果却未达预期。对现有登记的农药田间表现不佳的分析，主要原因在于猕猴桃溃疡病病原菌对现有化学农药产生高抗性，且这些农药对猕猴桃植株的渗透性和内吸能力较差，不能传导到致病菌所作用的韧皮层。特别是在南方地区，春季雨期持续时间长、施药窗口期短、空气湿度大等不利防治条件导致一些猕猴桃种植园的溃疡病不能得到有效控制。

山苍子（Litsea cubeba essential）是一种属于樟科木姜子属的植物，它是我国特有的香料植物资源之一，从山苍子的花、果实和枝叶中可提取天然香精油——山苍子油[13]。已有研究报告指出，山苍子油在实验室条件下对多种细菌和真菌具有良好的抑制效果，具有广谱抗菌特性[14-15]。山苍子油中的主要化学成分为柠檬醛，其在一定浓度下能够破坏真菌与细菌的细胞结构，使得细胞膜通透性增加，导致细胞内容物泄漏，最终导致细胞死亡，从而表现广谱抑菌活性[16-18]。Hu 等[19]研究了山苍子油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌作用，研究表明，山苍子油破坏了MRSA细胞的细胞膜，导致其细胞生物大分子泄露从而达到抑菌效果。Wang 等[20]研究了山苍子油对灰霉病的抑制作用，也发现山苍子油能破坏灰霉菌的细胞膜，导致其细胞膜通透性受损从而达到抑菌效果。陈梓云等[21]关于山苍子油对用于小麦粉和玉米粉的防霉研究中发现，山苍子油具有很好的防霉效果。迄今尚未有山苍子油对猕猴桃溃疡病菌的抑菌作用的报道。

湖南农业大学植物保护学院在前期筛选猕猴桃溃疡病生防材料时，发现山苍子油对猕猴桃溃疡病具有较好的抑制作用，在此基础上，拟进一步评价山苍子油的生物活性，结合制剂开发评估其在田间应用中的防效，以期探究山苍子油及其制剂在猕猴桃溃疡病防治中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 H2050R高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），SW-CJ-2F超净工作台（江苏净化），6321PCR仪（Eppendorf AG），DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司），765/06413凝胶成像系统（BIO-RAD），mLS-3750灭菌锅（SANYO），TU-1810PLUS紫外分光光度器（上海精密仪器仪表有限公司），Dura12/24超纯水机[泽拉布仪器科技（上海）有限公司]，T25数显分散器（德国IKA）。

1.1.2 试剂 GelGreen染料（北京擎科生物技术有限公司），2000 dp DNA marker（北京擎科生物技术有限公司），2xTSINGKER Master Mix（北京擎科生物技术有限公司），TE缓冲液（博迈德生物有限公司），无水乙醇（阿拉丁试剂有限公司），山苍子油（江西省吉水县天成香料油厂），YUS-D935、YUS-D3020[竹本油脂（苏州）有限公司]，SK-33SC、SK-34SC、SK-935[星飞化工（上海）有限公司]，OP-4、EL-40（邢台市燕诚化学助剂有限公司），2%春雷霉素水剂（加收米）（日本北兴化学工业株式会社）。

1.1.3 供试病原菌 2021年3月15日于湖南省古丈县天桥村“红阳”猕猴桃种植基地采集具有猕猴桃溃疡病典型发病症状的流脓枝条，回实验室进分离纯化。

1.1.4 供试引物 参考J.Rees-George等[22]的文献合成两对特异性检测引物，由北京擎科生物技术有限公司合成。PsaF1：5'-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'，PsaR2：5'-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3'。扩增目的片段为细菌16S-23S rDNA ITS部分区域，目标片段大小为80 bp。Psa KN-F：5'-CACGATACATGGGCTTATGC-3'，Psa KN-R：5'-CTTTTCATCCACACACTCCG-3'。扩增片段位于外膜蛋白（omp P1）基因部分区域，目标片段大小为492 bp。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水定容至1 000 mL，NaOH调节pH值至7.4，然后分装到10个三角瓶中，用耐高温组培封口膜封口后高压灭菌锅灭菌30 min，冷却后贮藏备用。配制固体LB培养基，在以上配方中再加入18 g琼脂粉。

1.2.2 猕猴桃溃疡病病原菌的分离与纯化 将采集回来的带病枝条用无菌水冲洗后，用灭菌过的枝剪将枝条剪成2 mm×2 mm的方形组织小块，随后在超净工作台上将组织小块用75%酒精浸渍10 s后用无菌水清洗3次。将处理好的样品放入LB液体培养基中，封口后放入恒温振荡器中以18 ℃、180 r/min

的条件培养24 h。培养完成后，在无菌操作台上，使用接种环取已培养好的菌液，通过平板划线法分离和纯化菌落。挑选具有典型猕猴桃溃疡病菌菌落特征的单株菌落进行2～3次纯化后保存备用。

1.2.3 猕猴桃溃疡病病原菌的分子生物学鉴定 （1）DNA模板的制备。挑取已经纯化和培养好的单个菌落，并将其接种到LB液体培养基中。在恒温振荡器中以18 ℃、180 r/min的条件下培养24 h，以此做为PCR反应的DNA模板。

（2）基因序列的扩增。PCR反应体系：2xTSING

KER Master Mix 12.5 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，Template DNA 1.5 μL，双蒸H2O 10 μL。

扩增程序：94℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，72℃延伸6 min，35个循环，反应完成后4 ℃保存。

配制完成反应体系后将其震荡混匀并离心，放入PCR仪后，按照反应程序进行PCR反应。

（3）电泳检测。在PCR扩增反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将目标条带纯化并回收后，送往北京擎科生物技术有限公司进行序列测定。

（4）序列比对与系统发育树构建。使用DNAStar分析软件对原始序列进行处理后，在NCBI数据库中运用Blast工具软件进行比对分析，并从GenBank下载相似性较高的基因序列，利用MEGA5.2软件构建系统发育树，以此鉴定病原菌的种类。

1.2.4 山苍子油对猕猴桃溃疡病菌的抑菌作用初筛 采用平板抑制试验，先将分离出来的猕猴桃溃疡病菌株进行扩大培养，之后用无菌水将菌液稀释成在紫外分光光度计600 nm下吸光值0.1的菌悬液（当OD600=0.1时，猕猴桃溃疡病菌的浓度约为1×108 CFU/mL）[23]，即OD600=0.1的猕猴桃溃疡病菌菌液。将LB固体培养基加热融化后加入山苍子油（1.8 mg/L），充分搅拌，倒入平板板，风干备用。将猕猴桃溃疡病菌菌液10 μL进行涂布，密封后放入生化培养箱中以18 ℃的条件培养96 h后观察，以不添加山苍子油用相同方法培养的猕猴桃溃疡病菌为对照。

1.2.5 山苍子油EW（水乳剂）的制备与乳化剂筛选 （1）山苍子油EW的制备。采用转相法[24， 25]，按照配制山苍子油EW的浓度要求，先称取一定量的山苍子油，再加入总质量8%的乳化剂（油相），用去离子水（水相）定容到设定体积，于高速剪切乳化机上以16 000 r/min转速剪切乳化3 min，得到相应山苍子浓度的水乳剂成品。

（2）乳化剂的筛选。根据冯建国等[26]、Liu J 等[27]对农药水乳剂用乳化剂的应用研究，选用YUS-D935、SK-33SC、OP-4、YUS-D3020、EL-40、SK-34SC乳化单剂配制4%山苍子油EW，依次进行乳液稳定性、热贮稳定性、低温稳定性和分散性测试，每个样品进行3次重复试验，对当次项目测定合格的乳化剂再进行下一步测定，不合格的淘汰。筛选出合格的乳化剂后，再按质量比为1∶1复配组合乳化剂（组合乳化剂的加入量为总质量的8%），再按单剂筛选方法筛选出最佳的组合乳化剂复配方。各项性能测定的方法及标准如下：

乳液稳定性测定：按照《GB/T 1603—2001农药乳液稳定性测定方法》将待测样品以标准硬水稀释200倍，静置1 h后进行观察，测试样品达到上无浮油，下无沉淀，乳液无分层则判定为合格。

热贮稳定性测定：按照《GB/T 19136—2003 农药热贮稳定性测定方法》将待测样品密封后放入（54±2）℃恒温箱中，存放14 d后若无析水、析油或只有少量物质析出轻摇后可混合均匀，则判定为合格。

低温稳定性测定：按照《GB/T 19137—2003 农药低温稳定性测定方法》将待测样品密封后放入（0±2）℃冰箱中，7 d后观察，若无析水、析油则判定为合格。

分散性测定：将待测样品加入到标准硬水中，观察其在硬水中的分散情况，根据分散情况可分为以下四个等级：①样品加入后立即呈云雾状则为优；②样品加入后有颗粒下沉，但在下沉后能基本分散则为良；③样品加入后有颗粒下沉，在下沉后需要轻微摇晃才能分散则为一般；④样品加入后呈絮状或颗粒状下沉，需要强烈摇晃才能分散则为差[28]。待测样品达到良以上判定为合格。

选用乳化剂最优复配方配制25%山苍子油EW。

1.2.6 山苍子油EW对猕猴桃溃疡病菌毒力的室内测定 采用比浊法室内测定山苍子油EW对猕猴桃溃疡病菌的毒力。将25%山苍子油EW分别稀释125 000 倍、41 667 倍、25 000倍、17 857倍、13 889倍，配制5个浓度梯度山苍子油EW。每个梯度100 mL，然后加入OD600=0.1的猕猴桃溃疡病菌菌液100 μL，放入恒温振荡器中以18 ℃、180 r/min的条件培养24 h，以不添加山苍子油EW的猕猴桃溃疡病菌菌液培养为对照，每个处理做3个重复。然后使用紫外分光光度计在600 nm下测定菌液溶度，通过DPS数据处理系统计算毒力回归方程、EC50值及相关系数，按公式（1）计算抑制生长率。

1.2.7 田间防效试验 选取湖南省古丈县古阳镇天桥山村猕猴桃种植基地为试验地点。该种植基地海拔为500 m左右，猕猴桃种植面积为6.67 hm2，种植品种为“红阳”，树龄4 a，猕猴桃溃疡病的发病率为90%，因猕猴桃溃疡病死亡的植株率约50%，田间防治猕猴桃溃疡病的药剂主要有噻菌铜、氢氧化铜、四霉素。

试验设3个处理：处理Ⅰ，25%山苍子油EW的200倍液喷雾；处理Ⅱ，2%春雷霉素水剂（加收米）400倍液喷雾；CK，喷清水作为空白对照。每处理60株，每次喷药400 mL，树体均匀受药，共进行3次喷药，2021年10月26日第1次喷药，2021年11月18日第2次喷药，2022年3月2日第3次喷药。分别于2021年12月7日和2022年3月19日调查喷药后猕猴桃溃疡病新发生的情况，按照表1进行病情分级，按公式（2）计算发病率、公式（3）计算防治效果、公式（4）计算病情指数。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃溃疡病菌的分离与纯化结果

从感染猕猴桃溃疡病的枝条中分离出HG1、HG2、HG3、HG4、HG5、HG6和HG7共7株菌株（图1），呈现圆形、乳白色、全缘、微凸、表面光滑等特征，与王星[28]等在LB培养基上培养的猕猴桃溃疡病菌的菌落形态特征一致。

2.2 猕猴桃溃疡病菌分子生物学鉴定结果

将分离出的7株菌株编号后使用特异性引物PsaF1、PsaR2与Psa KN-F、Psa KN-R分别进行PCR扩增，再将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，发现其中HG6没有扩增出目的条带，HG1、HG2、HG3、HG4、HG5和HG7菌均得到一条约252 bp的片段和约500 bp左右片段（图2）。将出现目标条带的6份菌株送北京擎科生物技术有限公司测序，菌株的序列基本相同，通过NCIB的BLAST比对，构建系统发育树（图3），与猕猴桃溃疡病菌MT46321 9.1高度同源，确认为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syingae pv. actinidiae）。将分离纯化得到的病原菌的序列上传至NCBI上，得到菌株登录号为：MW829404.1

2.3 山苍子油对猕猴桃溃疡病菌的抑菌作用初筛结果

图4表明，对照组猕猴桃溃疡病菌长满培养皿，含有山苍子油的没有观察到猕猴桃溃疡病菌的菌落，表明山苍子油对猕猴桃溃疡病菌有明显抑制作用。

2.4山苍子油乳化剂的选择及复配方确定

如表2所示，筛选得到最佳的乳化剂组合为SK-33SC：YUS-D935=1∶1（质量比），该乳化剂组合所有测定指标均达到了合格的标准，在热贮稳定性测定中比其他单剂和组合稳定性更好，无析出物，在分散性测定中，样品滴入水中后立即呈云雾状分散，达到了优级标准。用该乳化剂配制25%山苍子油EW的具体配方中各成分的质量百分比为：山苍子油 25%、 溶剂乙酸仲丁酯 15%、乳化剂 SK-33SC 4%、乳化剂YUS-D935 4%、去离子水补足至 100%。

2.5 25%山苍子油EW的室内毒力测定结果

如表3所示，25%山苍子油EW的EC50值为8.581 mg/L，回归方程为y=-2.21+2.38x，相关系数为0.965；抑菌率随稀释倍数的降低而增加，以稀释13889倍的最高，为81.26%。

2.6 25%山苍子油EW对猕猴桃溃疡病的田间防效

2021年秋季防治效果如图5、表5所示，CK的植株叶面病斑较为明显，病情指数19.47，发病率高达96.33%；处理Ⅰ的植株叶面无病斑，病情指数3.37，发病率16.33%，防治效果高达82.69%；处理Ⅱ的植株叶面有少量的病斑，病情指数15.23，发病率75.17%，防治效果21.78%。秋季病斑主要发生在叶面，只有极少数枝干出现流脓现象，各处理未出现死树现象。2022年春季防效如表6所示，春季CK虽然发病率较秋季低21.5%，但溃疡病脓包较为明显，且植株死亡率达15%；处理Ⅰ的病情指数和发病率较CK、处理Ⅱ分别低49.54%、24.27%和58.28%、30.00%，防效较处理Ⅱ高38.66%，植株枝干无猕猴桃溃疡病脓包，且未死树，但较秋季仿效要低；处理Ⅱ的春季防效较秋季仿效高18.48%，但植株枝干带有猕猴桃溃疡病脓包，且出现植株死亡。

3 结论与讨论

采用平板划线分离法，对湘西地区的猕猴桃溃疡病菌进行分离与纯化，确定湘西地区的猕猴桃溃疡病菌的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；首次报告山苍子油对猕猴桃溃疡病菌的抑制作用，并通过筛选山苍子油乳化剂，制备了25%山苍子油EW，测定出制剂对猕猴桃溃疡病菌室内毒力；通过田间药效试验测试山苍子油EW的田间防效。田间试验结果表明，25%山苍子油EW 200倍稀释液对猕猴桃溃疡病有很好的防治效果，秋季防效达到82.69%，春季防效达到78.92%，且较2%春雷霉素水剂（加收米）以400倍液喷雾的秋季防效高60.91%、春季防效高38.30%，在防治猕猴桃溃疡病方面具有良好的应用潜力；至于春季发病率及严重程度的提高是因为春季雨水较多，病情比秋季严重[29]；春雷霉素水剂（加收米）春季防效的提高，是否与药效的持效性有关，尚有待研究。

到目前为止，铜制剂在控制猕猴桃细菌性溃疡病中被认为是最经典的方法，但高浓度的铜制剂不仅抑制植物发育，而且干扰光合作用等细胞活动，长期使用还会影响环境生态，如土壤污染、饮用水污染等问题。挖掘高抑菌活性生物源活性成分并开发环境友好的农用杀菌剂极具前景。但是，目前微生物农药如枯草芽孢杆菌等防治猕猴桃溃疡病的防效极不稳定，速效性差；抗生素类药剂如四霉素、春雷霉素、中生菌素等耐雨水冲刷能力不佳，且不能与碱性农药混用。因此，开发作用机制独特、生物活性强的生物来源药物应用于猕猴桃溃疡病防治值得研究者和产业界关注。

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（责任编辑：谢培庚）

收稿日期：2024-03-21

作者简介：颜志豪（1998—），男， 湖南永州市人，硕士研究生，主要从事农药制剂与加工研究。

通信作者：李晓刚