根肿菌侵染下菘蓝生物碱合成机制

赵淑丽 李国栋 张丽琴 赵明智 施建莲 刘家佳

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202304039

赵淑丽， 李国栋， 张丽琴， 等， 2024.

根肿菌侵染下菘蓝生物碱合成机制 ［Ｊ］.

广西植物， 44（5）： 981-997.

ZHAO SL， LI GD， ZHANG LQ， et al.， 2024.

Mechanism of alkaloid synthesis in Isatis indigotica infected by Plasmodiophora brassicae［J］.

Guihaia， 44（5）： 981-997.

摘  要：  为探究根肿菌胁迫对菘蓝生物碱及其合成关键酶基因表达的影响，该研究对根肿菌侵染后0、7、14、21 d的菘蓝进行病情形态分级、组织学观察、生理生化指标测定以及转录组学和代谢组学分析。结果表明：（1）接菌后0、7、14、21 d菘蓝根部分别发展为0级、1级、3级、5级的肿根，并且7 d是皮层入侵的关键时间点。（2）接种根肿菌14 d后，菘蓝叶内可溶性蛋白、丙二醛的含量，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶的活性与同时间对照组比较显著提高，并随着接菌时间的延长呈增加的趋势。（3）代谢组学一共检测到161种生物碱，其中吲哚类生物碱数量较多；与未接菌相比，菘蓝接菌后7、14、21 d分别存在16种、17种、39种差异代谢物且各组差异代谢物多富集在生物碱和氨基酸代谢通路。（4）转录组测序结果显示，与未接菌相比，菘蓝接菌后7、14、21 d分别存在2 439个、256个、6 437个差异表达基因，这3组共同富集到11个生物碱相关的代谢通路；与未接菌相比，接菌后7、14、21 d有9个基因（编码4种酶THS、TAT、YUCCA、ALDH）表达量均上升。该研究结果揭示了芸薹根肿菌与菘蓝之间的互作机制，探究了芸薹根肿菌对吲哚生物碱合成及其关键酶基因的影响，为后期菘蓝根肿病抗性基因及生物碱次生代谢途径的研究奠定了基础。

关键词： 板蓝根， 根肿菌， 抗氧化酶， 功能基因， 吲哚生物碱， 代谢组

中图分类号：  Q946

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2024）05-0981-17

收稿日期：  2023-08-22  接受日期： 2023-11-24

基金项目：  云南省应用基础研究项目（202101AU070121）； 云南省重大科技专项（202102AE090031）。

第一作者： 赵淑丽（1999—），硕士研究生，研究方向为民族药资源保护与开发利用，（E-mail）2764522605@qq.com。

*通信作者：  刘家佳，博士，助理研究员，从事药用植物代谢通路研究，（E-mail）441603928@qq.com。

Mechanism of alkaloid synthesis in Isatis indigotica

infected by Plasmodiophora brassicae

ZHAO Shuli1， LI Guodong1， ZHANG Liqin2， ZHAO Mingzhi3， SHI Jianlian3， LIU Jiajia1*

（ 1. Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China; 2. Institute of Horticultural Research， Yunnan Academy of

Agricultural Sciences， Kunming 650205， China; 3. Haiyuan College， Kunming Medical University， Kunming 650101， China ）

Abstract：  To explore expression level of alkaloid and its key synthetase gene in Isatis indigotica upon Plasmodiophora brassicae exposure. The grades of disease severity according to morphology were verified. Moreover， histological observation， physiological and biochemical parameters have been collected together with transcriptomic and metabolomic analysis in Isatis indigotica after infection for 0， 7， 14， 21 d. The results were as follows： （1） After inoculation for 0， 7， 14， 21 d with Plasmodiophora brassicae， Isatis indigotica showed club root grades in 0， 1， 3， and 5 respectively， notably， cortical invasion occurred on 7 d. （2） When Plasmodiophora  brassicae exposed lasting 14 d later， the contents of soluble protein and malondialdehyde， along with superoxide dismutase， peroxidase， polyphenol oxidase and catalase activities in Isatis indigotica increased significantly compared to control group at time depended manner. （3） A total of 161 alkaloids were detected in metabolomics， among those alkaloids， indoles were noticed as the most abundant form. There were 16， 17 and 39 discriminating metabolites had been spotted after infected with Plasmodiophora  brassicae for 7， 14， 21 d， the most discriminating metabolites enriched at alkaloid and amino acid metabolism pathways. （4） Transcriptome analysis showed that there were 2 439， 256 and 6 437 genes expression alteration for 7， 14， 21 d compared to control， those differentially expressed genes enriched at 11 alkaloids related metabolism pathways. Markedly， expression level of 9 genes （encoding for enzymes thebaine synthase， tyrosine aminotransferase， indole-3-pyruvate monooxygenase and aldehyde dehydrogenase） were increased after infection for 7， 14， 21 d. The results reveal the interaction between Plasmodiophora  brassicae and Isatis indigotica，

explored the effects of Plasmodiophora brassicae on indole alkaloid synthesis and its key enzyme genes， and lay a foundation for later research on resistance genes and alkaloid secondary metabolic pathways in Isatis indigotica.

Key words： Isatidis Radix， Plasmodiophora brassicae， antioxidant enzymes， functional gene， indole alkaloid， metabolome

菘蓝（Isatis indigotica），十字花科菘蓝属的二年生植物，全国各地均有栽培，具有很大的经济价值和药用价值，其干燥根、叶为清热解毒的代表药板蓝根和大青叶（Wong et al.， 2022）。菘蓝中的主要生物活性成分为生物碱，具有抗病毒、抗菌及免疫调节的药理作用，其中吲哚类生物碱的药理活性报道最多，已经证实靛蓝、靛玉红、表告依春、5-羟基吲哚、吲哚-3-甲醛和色胺酮具有抗病毒、抗肿瘤、白细胞抑制及抑菌活性（Sinha et al.， 2008；Chen et al.， 2021；杨立国等，2021）。《中华人民共和国药典》规定板蓝根和大青叶药材及其制剂质量控制的重要指标分别是表告依春和靛玉红（国家药典委员会，2020）。

十字花科根肿病俗称大根病，其病原为芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae），是一种土传病害，专门寄生在菘蓝等十字花科作物（白菜、油菜、萝卜、芥菜）的根部，通常先侵入根毛，再产生次级游动孢子并入侵皮层组织，致使皮层细胞增大，挤压变形，侵染后期细胞内会产生休眠孢子，在此过程中植株根部肿大呈瘤状且生长发育迟缓、凋萎下垂。根肿菌侵染也会诱导寄主抗性响应，如产生大量的氧自由基，促使膜脂过氧化，破坏细胞膜的结构，而过氧化氢酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等防御酶主要参与活性氧的消除，维持细胞膜稳定性（Qi et al.， 2020；Huang et al.， 2022；王公达等，2022）。秦六月（2021）研究表明抗病大白菜DH40R中的CAT、SOD、POD活性和可溶性蛋白含量在根肿菌侵染8 d时明显升高，强烈抵抗根肿菌侵染；朱红芳等（2015）研究表明在初期筛选抗根肿病的品种时，将可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛（malondialdehyde， MDA）作为主要指标；郭珍（2018）研究发现CAT与油菜抗病性相关，SOD、POD与油菜抗病性呈正相关。

目前，对十字花科植物感染根肿菌的相关研究主要还是集中在芸薹属植物，对拟南芥的研究较少，菘蓝感染根肿菌的防御机制以及体内代谢变化的研究几乎没有报道。因此，迫切需要探究菘蓝与根肿菌之间的互作机制，以及根肿菌对菘蓝有效成分积累的影响。本研究以接菌后0、7、14、21 d的菘蓝为研究对象，采用Illumina高通量测序技术和超高效液相色谱-串联质谱技术，通过病情形态分级、组织学观察、生理生化指标测定以及转录代谢分析，拟探讨以下问题：（1）根肿菌侵染菘蓝的动态过程；（2）菘蓝抗根肿病的生理防御机制；（3）根肿菌胁迫对菘蓝生物碱类化合物合成机制的影响。本研究为深入挖掘菘蓝抗根肿病功能基因及次生代谢物合成途径等分子研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1 材料

供试菌株和菘蓝品种：菌株采自昆明市盘龙区阿子营乡的大白菜发病根瘤，经云南省农业科学院鉴定为4号生理小种（Williams鉴定系统）。实验所需小叶菘蓝种子由云南省农业科学院园艺作物研究所的十字花科课题组张丽琴老师提供并鉴定。

试剂及仪器：台盼蓝溶液（SIGMA）、甲醛-醋酸-乙醇固定液（50%）；牛血清蛋白、核黄素、愈创木酚、2-硫代巴比妥酸，北京索莱宝科技有限公司；邻苯二酚、三氯乙酸溶液、L-甲硫氨酸，上海麦克林生化科技有限公司；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、乙二胺四乙酸EDTA，德国Biofroxx生物试剂；过氧化氢（30%），云南景锐科技有限公司。Nikon数码显微镜，血球计数板，育苗盘，普析TU-1810紫外可见分光光度计，超低温冷冻离心机，光照培养箱，台式鼓风干燥箱，电热恒温水浴锅，千分之一电子天平，托盘天平，冷冻冰箱等。

1.2 实验处理

将冷冻的大白菜发病根瘤置于室温解冻，采用杨佩文等（2002）的方法提取根肿菌休眠孢子，血球计数板测定根肿菌孢子悬浮液的浓度，稀释成5×107 CFU·mL-1 的病原菌菌液备用。小叶菘蓝于72孔育苗盘中栽培，1个穴播种3颗种子，待其长出2～3对真叶后间苗，注射法进行根肿菌（1×107 CFU·mL-1 的休眠孢子）接种，用10 mL 注射器吸取菌液，将菌液缓慢注射到实验苗根部，每株2 mL菌液。分别在接种根肿菌后0、7、14、21 d采集正常生长（BLG-CK1、BLG-CK2、BLG-CK3、BLG-CK4）和接种根肿菌（BLG-S1、BLG-S2、BLG-S3、BLG-S4）的小叶菘蓝根部（根及根茎）和叶子（Lan et al.， 2019），3个生物学重复，并液氮冷冻，-80 ℃ 储存。

1.3 方法

1.3.1 病情形态分级和组织学观察  病情分级参照农业部公益性行业科研专项（201003029）制定的标准（杨华等，2014）。接种根肿菌后根据病情形态分级每24 h观察根肿情况并取小叶菘蓝根部进行组织学观察，连续观察21 d。将小叶菘蓝根部洗干净，取地下1～2 cm于FAA固定液中至少固定24 h；再将组织从FAA固定液中取出并切成薄片；于台盼蓝染液中染色2 min，染色后用去离子水（ddH2O）洗去残留的染液，清洗2～3次；染上色的根组织薄片放在载玻片上进行显微观察。

1.3.2 生理指标的测定  小叶菘蓝叶片生理指标的测定主要参照高俊凤（2006）和王文龙（2014）的方法，具体如下：（1）硫代巴比妥酸显色法检测MDA；（2）考马斯亮蓝G-250染色法检测可溶性蛋白；（3）愈创木酚比色法检测POD；（4）氮蓝四唑光还原法检测SOD；（5）邻苯二酚法检测PPO；（6）紫外分光光度法检测CAT。

1.3.3 UPLC-MS/MS测定

1.3.3.1 样品制备  将小叶菘蓝的根及根茎放置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥后研磨；称取50 mg 的粉末，加入70% 甲醇（1.2 mL），30 min涡旋1次（每次30 s，共6次）；12 000 r·min-1，离心3 min后，0.22 μm微孔滤膜将上清液过滤在进样瓶中，用于后续实验。

1.3.3.2 色谱质谱条件  ExionLCTM AD超高效液相色谱（https：//sciex.com.cn/），Applied Biosystems 4500 QTRAP串联质谱（https：//sciex.com.cn/）。液相色谱条件：色谱柱为SB-C18（1.8 μm，2.1 mm × 100 mm，Agilent）；0.1%甲酸的超纯水（A）与0.1%甲酸乙腈（B）为流动相，流速为0.35 mL·min-1；洗脱梯度（B相比例）为0.00 min，5%，9.00 min内线性增加至95%，并维持在95% 1 min，10.00～11.10 min，95%～5%，11.10～14.00 min，5%；进样量4 μL；柱温为40 ℃。质谱条件：电喷雾离子源；电压为+5 500 / -4 500 V；温度为550 ℃；离子源气体 I、气体Ⅱ及气帘气分别设置为50、60、25 psi；碰撞诱导电离参数设置为高。

OPLS-DA模型中的VIP值结合差异倍数值fold change来筛选差异代谢物。筛选标准：符合VIP ≥ 1、fold change ≥ 1.5和fold change ≤ 0.67的代谢物具有显著差异。

1.3.4 RNA提取和文库构建  RNA提取与测序由武汉迈维代谢有限公司完成。采用Illumina的NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit试剂盒提取total RNA。琼脂糖凝胶电泳和Nano Photometer分光光度计检测RNA完整性和纯度。最终达标的样品用于构建小叶菘蓝cDNA文库。

1.3.5 转录组测序、分析及注释  利用Illumina对小叶菘蓝根及根茎转录组文库进行高通量测序。通过CASAVA碱基识别将原始的图像数据转化为原始数据（raw data），经数据评估、过滤除杂及冗余处理等质控获得高质量序列（clean reads），Trinity组装并层次聚类后得Unigene。使用DIAMOND BLASTX与HMMER软件将Unigene序列与Gene Ontology（GO）、TrEMBL、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Swiss-Prot、euKaryotic Ortholog Groups（KOG）、NR、Protein family（Pfam）数据库进行比对，得到基因功能信息。用DEGSeq R包鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），规定同时符合错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.05，|log2差异倍数（fold change，FC）|≥1的基因确定为差异表达的基因并对其进行功能富集分析。

1.3.6 qRT-PCR分析  植物RNA提取同1.3.4节。根据转录组数据结果中的FPKM值筛选13个差异基因，采用Monad试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板、菘蓝Actin基因（Qu et al.， 2019）为内参进行qRT-PCR实验。利用Primer-BLAST设计引物（表 1）以及ABI 7500 荧光定量PCR仪进行qRT-PCR分析。扩增程序：95 ℃，2 min预变性；95 ℃，5 s变性；60 ℃，30 s退火/延伸（40个循环）；熔解曲线为从65 ℃ 升至95 ℃，每升温0.5 ℃ 采集1次荧光信号。每个样品均设置3个重复，使用2-ΔΔCt法进行实时荧光定量PCR结果的计算。将实验结果数据表示为平均值±标准差，并采用Graphpad软件对各组数据进行T检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果与分析

2.1 病情形态分级和组织学观察

由图1和图2可知，接菌后0 d根部发育正常无肿瘤，病情指数为0级且组织学观察发现细胞排列整齐（图1：E；图2：A）；接菌后7 d根部开始出现肿大症状，病情指数为1级，组织学观察发现皮层细胞明显增大，挤压变形（图1：F；图2：C）；接菌后14 d主根肿块直径小于茎基部直径的2倍，病情指数为3级，同时次级游动孢子遍布皮层细胞并开始入侵维管柱（图1：G；图2：E）；接菌后21 d根部出现较大肿瘤，其直径是茎基部直径的2～3倍，判定病情指数为5级，同时次级游动孢子遍布皮层和维管柱（图1：H；图2：F）。这从表观到细胞层次展示了根肿菌侵染植株的整个发病过程，同时也说明了根肿菌人工接种的可行性。

2.2 生理生化指标测定

由图3可知，接菌处理的可溶性蛋白、MDA含量和防御酶SOD、POD、PPO、CAT的活性随接菌时间的延长呈不断上升的趋势；接菌后7～21 d，实验组的CAT、SOD活性均显著高于相应对照组（P<0.05）；接菌后14～21 d，实验组的可溶性蛋白、MDA含量以及POD、PPO活性均显著高于对照组（P<0.05）。这说明菘蓝为抵抗根肿菌侵染自身做出了防御反应。

2.3 代谢组分析

2.3.1 样品检测及OPLS-DA分析  本实验对7组样本［BLG-CK1（S1）、BLG-CK2、BLG-CK3、BLG-CK4、BLG-S2、BLG-S3、BLG-S4］进行代谢研究。基于检测平台和自建数据库共检测到161种生物碱，其他类生物碱数量最多，占总生物碱的53%，其次是吲哚类生物碱占总生物碱的32%（图4）。由图5可知，正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）结果显示各组样品均能得到明显分离，并且BLG-CK3和 BLG-S3的分离距离最大，BLG-CK4和 BLG-S4次之，说明接菌14 d时根肿菌对菘蓝代谢影响最大。

2.3.2 差异代谢物筛选  进一步对接菌后7、14、21 d的菘蓝差异代谢物进行分析，发现BLG-CK2 vs BLG-S2有16种差异代谢物，6个上调，10个下调；BLG-CK3 vs BLG-S3有17种差异代谢物，9个上调，8个下调；BLG-CK4 vs BLG-S4有39种差异代谢物，32个上调，7个下调；BLG-S2 vs BLG-S3有19个差异代谢物，3个上调，16个下调；BG-S2 vs BLG-S4有45个差异代谢物，19个上调，26个下调；BG-S3 vs BLG-S4有34个差异代谢物，14个上调，20个下调（表2）。由图6可知，将BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4这3组差异代谢物取交集后发现共有5个差异代谢物，分别为环芸薹宁、isatindosulfonic acid B、5，6-二羟基吲哚-5-O-β-葡萄糖苷、泛酰巯基乙胺和对香豆酰亚精胺，其中前3种为吲哚类生物碱。将BLG-S2 vs BLG-S3、BLG-S2 vs BLG-S4、BLG-S3 vs BLG-S4这3组差异代谢物取交集后发现共有2个差异代谢物，分别是吲哚类生物碱isatisindigoticanine B和喹啉类生物碱2-氧-3，4-二氢-1H-喹啉-3-羧酸。

2.3.3 差异代谢物KEGG富集分析  由图7可知，各组别富集在代谢通路（ko01100）上的差异代谢物最多且生物碱和氨基酸相关的代谢通路变化明显；BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4这3组都富集在托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成途径（ko00960）；除了BLG-CK3 vs BLG-S3，其他组都在色氨酸代谢途径（ko00380）上富集，色氨酸合成途径是吲哚类生物碱合成的前体途径。

2.4 RNA-seq 分析

2.4.1 转录组数据组装和质量分析  为进一步挖掘根肿菌胁迫下菘蓝生物碱积累机制，对菘蓝21个样本进行转录组测序和分析得到1 200 974 786条原始序列和1 171 808 210个高质量序列，共获得175.77 Gb的有效数据；各样本有效数据均达到7 Gb，Q20（Qphred值不低于20的碱基数占总碱基数的百分比）碱基百分比均在97%以上，Q30（Qphred值不低于30的碱基数占总碱基数的百分比）碱基百分比均在92%以上；GC含量（G和C占总碱基数量的百分比）为47.0%～47.69%。Trinity拼接得到83 775个Unigene，平均长度为1 708 bp，最长达到16 523 bp，最短为201 bp，N50为2 367 bp。Unigene长度分布图（图8）显示，51 799条（61.83%）Unigene长度超过1 000 bp，25 874条（30.89%）Unigene长度超过2 000 bp。这说明转录组数据质量较高，可进行后续分析。

2.4.2 Unigene的功能注释  用NR、TrEMBL、GO、Swiss-Prot、KOG、KEGG、Pfam共7个数据库进行Unigene注释，分别成功注释69 350（82.78%）、70 281（83.89%）、60 538（72.26%）、54 696（65.29%）、44 620（53.26%）、55 271（65.98%）、55 387（66.11%）个基因，至少在一个数据库注释成功的Unigene有72 965条（87.1%）。样本间基因表达水平的相关性分析表明样本在一组中具有较高的一致性，确保了后面分析结果的可靠性。

在本研究中，共有60 538条Unigene 得到了GO注释。总体分为3大类：一是分子功能，主要富集条目有催化活性（30 758条）和结合（36 084条）；二是细胞组分，细胞解剖实体Unigene数量最多（51 807条）；三是生物过程，Unigene富集较多的类别有细胞过程（40 504条）、刺激响应（18 474条）、代谢过程（32 229条）、生物调控（16 606条）（图9）。

由图10可知，本次共有25个不同功能且种类齐全的类群，包含大多数的生命活动。其中，10 102条被富集到一般功能预测，是KOG类群中Unigene数量最多的；其次是翻译后修饰、蛋白反转和伴侣，4 932条；注释到信号转导机制的较少，也有4 461个基因，其他功能类群的基因丰度也不尽相同。

2.4.3 差异表达基因的筛选与功能分析  菘蓝接菌后7、14、21 d与同时间对照组比较分别有2 439个、256个、6 437个差异表达基因，结果表明菘蓝在根肿菌侵染后基因表达发生显著变化。其中，21 d的DEGs最多，说明根肿菌侵染后期菘蓝基因表达发生剧烈变化；这3组共有17个差异表达基因，其中9个上调，8个下调。接菌后7、14、21 d的实验组随着接菌时间的延长，差异基因数目在不断增加，其对根肿菌的响应更加剧烈（表3）。

对DEGs进行GO富集分析，根据细胞组成、分子功能和生物代谢对基因进行分类，共有9 805个DEGs被富集到这3个GO类别中。细胞组成过程中细胞解剖实体的DEGs位居第一； 细胞过程、刺激响应和代谢过程是DEGs在生物过程中富集较多的3个功能；结合和催化活性是DEGs在分子功能中的主要功能（表4）。

由于菘蓝中的主要活性成分为生物碱，而氨基酸是生物碱合成的基础，因此主要分析氨基酸和生物碱相关的代谢通路。为更清楚地了解所关注的生物碱类化合物与差异基因在通路上是否存在相关性，对BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4这3组差异表达基因进行KEGG富集分析（表5）。由表5可知，3组共同富集在11个生物碱相关的代谢通路上，其中色氨酸代谢途径富集的差异表达基因数量较多。

2.5 生物碱合成途径相关基因挖掘

本研究重点对吲哚类生物碱合成途径及相关基因进行挖掘。由图11可知，分支酸可在邻氨基苯甲酸合酶（anthranilate synthase，AS）、色氨酸合成酶（trytophan synthase asubunit，TSA）等酶的反应下合成吲哚，最后经过一系列反应合成色氨酸。色氨酸脱羧酶（L-tryptophan decarboxylase，TDC）是至关重要的酶，色氨酸可在其催化下生成色胺，并在黄素单加氧酶（indole-3-pyruvate monooxygenase，YUCCA）的催化作用下生成吲哚-3-乙酸；色胺也可在细胞色素P450单加氧酶（tryptamine 5-hydroxylase， CYP71P1）、醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）和5-羟色胺-O-甲基转移酶（acetylserotonin-O-methyltransferase， ASMT）的催化下合成5-甲氧基吲哚-3-乙酸。

本研究从所有的DEGs中筛选到18个基因，分别编码吲哚生物碱合成途径的5种关键酶（AS、TSA、TDC、YUCCA、ALDH）（图12：A），另外18个基因编码异喹啉类生物碱合成途径的2种关键酶，即蒂巴因合成酶（thebaine synthase，THS）和酪氨酸氨基转移酶（tyrosine aminotransferase，TAT）（图12：B）。与未接菌相比，接菌后7、14、21 d基因表达量均上调的一共有9个DEGs：3个编码THS的基因（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3），2个编码TAT的基因（Cluster-31730.0、Cluster-28040.6），2个编码YUCCA的基因（Cluster-36192.0、Cluster-36192.1），2个编码ALDH的基因（Cluster-32381.0、Cluster-28395.0）。

2.6 差异表达基因的qRT-PCR验证

为验证转录组数据的准确性，选择THS（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3），AUX/IAA（Cluster-34981.0），GH3（Cluster-16885.9）， SAUR（Cluster-27535.0）， PYR/PYL（Cluster-37780.0），PP2C（Cluster-35278.2、Cluster-37953.0），ABF（Cluster-37916.2），B-ARR（Cluster-22704.8），TGA（Cluster-22719.0），AHK（Cluster-28287.0）进行qRT-PCR验证（图13：A）。结果表明，上述酶基因在BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4中的表达趋势与RNA-seq结果一致（P<0.05）（图13：B），证明测序结果真实可靠。

3  讨论与结论

3.1 根肿菌侵染对菘蓝根部的影响

Wei等（2021）研究表明，感染根肿菌的植株其根部会不断膨大，直至变成大小形状不一的肿瘤， 并且根部细胞会因为次级游动孢子的入侵而挤压变形、体积增大。通常植株根部的肿大程度能反映其病情指数，根部细胞的变化情况能反映根肿菌的整个侵染过程。本研究连续21 d对根肿菌侵染菘蓝的过程进行实时动态观察，发现接菌后0、7、14、21 d菘蓝病情指数不断增加，分别为0级、1级、3级、5级；组织学观察发现在接种后7～14 d根肿菌能快速侵染菘蓝根部细胞，为侵染高峰期，这与谢琪等（2022）的研究结果一致。而Wei等（2021）的研究在根肿菌侵染时间上与本研究结果有所出入，考虑到这可能与所研究的寄主和侵染条件不同有关。此外，本研究采取病情形态分级结合组织学观察的方法，有利于从整体上观察根肿菌侵染状况，不仅为深入研究其他专性寄生病原菌作参照，也为后期生化指标、转录组学和代谢组学取样时间提供了理论依据。

3.2 菘蓝响应根肿菌侵染生理生化指标的变化

根肿菌侵染下，菘蓝植株自身会做出一系列的应激反应，这与Wang等（2020）的研究结果一致。本研究通过对接菌后0、7、14、21 d菘蓝的生理生化指标进行测定，发现可溶性蛋白和丙二醛含量在根肿菌处理后14 d和21 d与未接菌相比含量均显著增加，说明根肿菌侵染后期，植物受到的伤害程度更严重；根肿菌处理下菘蓝抗氧化酶SOD、POD、CAT、PPO活性变化趋势均不断上升，说明菘蓝通过增加抗氧化酶活性来抵御根肿菌对植物的伤害；CAT、SOD活性在接菌后7 d开始存在明显差异，但POD、PPO活性于14 d出现显著的差异，说明POD和PPO发挥作用相比较于前两种防御酶SOD、CAT来说存在滞后性。这与郑翠明等（1999）的相关报道一致。

3.3 根肿菌侵染对菘蓝生物碱合成的影响

菘蓝作为我国的大宗药材，其吲哚类生物碱表告依春具有丰富的药理活性。长春花（Catharanthus roseus）（林颖等，2020）、罗芙木（Rauvolfi serpentina）（Dey et al.， 2022）、钩藤（Uncaria rhynchophylla）（刘扬等，2021）等植物已成为吲哚类生物碱合成研究的模式植物，菘蓝中吲哚生物碱代谢途径复杂多样，其中色氨酸代谢是吲哚类生物碱合成的前体途径（Huang et al.， 2016）。目前，关于菘蓝中吲哚生物碱的合成机制、关键酶、多种基因功能的研究鲜见报道，并且有研究表明逆境胁迫能影响活性成分生物碱的积累（唐晓清等，2016；Jazayeri et al.， 2022）。因此，有必要深入研究根肿菌胁迫下菘蓝吲哚类生物碱合成的分子机制。

代谢组学通过对接菌前后7、14、21 d菘蓝根次级代谢产物生物碱进行OPLS-DA分析，发现不管是接菌处理（接菌和不接菌），还是取样时间不同，代谢物都存在差异且次级代谢物以吲哚类生物碱居多。差异代谢物KEGG富集分析表明各组多富集在氨基酸代谢途径尤其是色氨酸代谢，说明根肿菌侵染影响生物碱类化合物合成。进一步对BLG-CK2 vs BLG-S2、BLG-CK3 vs BLG-S3、BLG-CK4 vs BLG-S4这3个组别的差异表达基因进行KEGG代谢通路富集分析，筛选出了11条与生物碱合成相关的代谢通路， 其中色氨酸合成相关的差异表达基因数量较多。在此基础上转录加代谢联合分析共挖掘到18个差异表达基因参与吲哚生物碱合成途径上游的5种关键酶AS、TSA、TDC、YUCCA、ALDH，其中YUCCA和ALDH这2个关键酶的位置上存在差异表达基因上调的情况且上调显著。本研究发现，与未接菌相比，接菌后YUCCA基因（Cluster-36192.0、Cluster-36192.1）表达量均升高，这与Cao等（2019）的研究结果一致，都呈现出对生物胁迫的耐受性；但随着根肿菌侵染时间的不断延长，YUCCA基因的表达量先升高再降低，这可能是植物自身对逆境胁迫做出的应激反应；ALDH（Cluster-32381.0、Cluster-28395.0）基因在接菌后相对比于未接菌，其表达量上调，这是因为醛脱氢酶基因家族可以氧化有毒醛类物质，降低脂质过氧化，提高植物对逆境的耐受性（Du et al.， 2022；Zhang et al.， 2023）。由于缺乏根肿菌胁迫下菘蓝的全基因组，无法对吲哚类生物碱合成通路中的全部基因进行注释分析，因此对下游完整的吲哚类生物碱合成通路研究造成困难。为此，后期可通过全基因测序和质谱分析进一步探索完整的吲哚生物碱合成通路。

另外， 我们还发现了编码2种关键酶的18个差异表达基因均在异喹啉生物碱合成通路中被注释。目前THS酶的相关报道较少，但已经确定是病程相关蛋白PR-10超家族成员之一（Ozber et al.， 2023）。本研究结果显示编码THS的3个差异表达基因（Cluster-24362.0、Cluster-36994.3、Cluster-36129.3 ）在根肿菌侵染后其表达量都会升高，并且在qRT-PCR验证中也具有相同的表达趋势，说明THS酶与抗根肿病密切相关，后期可着重分析THS酶的功能。酪氨酸是异喹啉生物碱合成的前体，其中酪氨酸氨基转移酶（TAT）能催化酪氨酸合成4-羟基苯丙酮酸，现已在拟南芥（Lopukhina et al.， 2001）、丹参（Huang et al.， 2008）、紫苏（吕晓玲等，2012）等植物成功分离克隆了TAT基因，并发现植物激素水杨酸和脱落酸处理后可在转录水平上诱导该基因的表达。本研究结果也发现编码TAT的基因Cluster-31730.0和Cluster-28040.6在根肿菌胁迫后表达量上升，说明TAT酶在胁迫中发挥重要作用。

qRT-PCR实验结果表明，在根肿菌胁迫下，3个时间点菘蓝实验组与对照组相比，THS（薛京，2020）、AUX/IAA（Luo et al.， 2018）、GH3（Lu et al.， 2022）、SAUR（Li et al.， 2022）、PYR/PYL（Kim et al.， 2020）、PP2C（Yu et al.， 2019）、ABF（陈乃钰等，2021）、B-ARR（Falconieri et al.， 2022）、TGA（Qi et al.， 2022）、AHK（Cerbantez-Bueno et al.， 2020）这些基因表达量都上调且随着根肿菌侵入时间的延长，同一基因其表达量不断降低，准确反映了根肿菌胁迫下大多数基因在菘蓝中的表达模式。

综上所述，对根肿菌侵染的菘蓝进行转录组测序和代谢组分析，极大地丰富了根肿菌胁迫下菘蓝的生物学信息，挖掘了参与吲哚类生物碱和

异喹啉类生物碱合成的关键基因，探讨了这些关键基因在应对逆境胁迫下的表达规律，为后续深入研究这些基因的功能、解析根肿菌胁迫下菘蓝生物碱的积累机制奠定基础。

参考文献：

CAO X， YANG H， SHANG C， et al.， 2019. The roles of auxin biosynthesis YUCCA gene family in plants  ［J］. Int J Mol Sci， 20（24）： 6343.

CERBANTEZ-BUENO VE， ZUIGA-MAYO VM， REYES-OLALDE JI， et al.， 2020. Redundant and non-redundant functions of the AHK cytokinin receptors during gynoecium development ［J］. Front Plant Sci， 11： 568277.

CHEN NY， ZHANG GX， ZHANG LS， et al.， 2021. The role of ABF transcription factors in response to abiotic stress in plant ［J］. J Plant Genet Resour， 22（4）： 930-938.  ［陈乃钰， 张国香， 张力爽， 等， 2021. ABF转录因子在植物响应非生物胁迫中的作用 ［J］. 植物遗传资源学报， 22（4）： 930-938.］

CHEN Q， LAN HY， PENG W， et al.， 2021. Isatis indigotica： a review of phytochemistry， pharmacological activities and clinical applications ［J］. J Pharm Pharmacol， 73（9）： 1137-1150.

Chinese Pharmacopoeia Committee， 2020. Pharmacopoeia of Peoples Republic of China： Part 1  ［M］. 2020 ed. Beijing： China Medical Science and Technology Press： 214-215.  ［国家药典委员会， 2020. 中华人民共和国药典： 一部 ［M］. 2020年版. 北京： 中国医药科技出版社： 214-215.］

DEY A， ROY D， MOHTURE VM， et al.， 2022. Biotechnological interventions and indole alkaloid production in Rauvolfia serpentina ［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 106（13/14/15/16）： 4867-4883.

DU HM， LIU C， JIN XW， et al.， 2022. Overexpression of the aldehyde dehydrogenase gene ZmALDH confers aluminum tolerance in Arabidopsis thaliana  ［J］. Int J Mol Sci， 23（1）： 477.

FALCONIERI GS， BERTINI L， BIZZARRI E， et al.， 2022. Plant defense： ARR11 response regulator as a potential player in Arabidopsis  ［J］. Front Plant Sci， 13： 995178.

GAO JF， 2006. Guidance on plant physiology test ［M］. Beijing： Higher Education Press： 142-218.  ［高俊凤， 2006. 植物生理学试验指导 ［M］. 北京： 高等教育出版社： 142-218.］

GUO Z， 2018. Main biochemical indexes and transcriptome analysis of rapeseed root disease resistance ［D］. Chongqing： Southwest Univeristy.  ［郭珍， 2018. 油菜抗根肿病品种主要生化指标及转录组分析 ［D］. 重庆： 西南大学.］

HUANG BB， YI B， DUAN YB， et al.， 2008. Characterization and expression profiling of tyrosine aminotransferase gene from Salvia miltiorrhiza （Dan-shen） in rosmarinic acid biosynthesis pathway  ［J］. Mol Biol Rep， 35： 601-612.

HUANG CP， LIAO JL， HUANG WJ， et al.， 2022. Salicylic acid protects sweet potato seedlings from drought stress by mediating abscisic acid-related gene expression and enhancing the antioxidant defense system  ［J］. Int J Mol Sci， 23（23）： 14819.

HUANG YX， TAN HX， GUO ZY， et al.， 2016. The biosynthesis and genetic engineering of bioactive indole alkaloids in plants  ［J］. J Plant Biol， 59（3）： 203-214.

JAZAYERI SM， POORALINAGHI M， TORRES-NAVARRETE Y， et al.， 2022. Alkaloid production and response to natural adverse conditions in Peganum harmala： in silico transcriptome analyses  ［J］. Biol Technol （Pozn）， 103（4）： 355-384.

KIM J， KIM D， CHEON CI， et al.， 2020. Modeling-based identification of a raptor-binding motif present in Arabidopsis ABA receptor PYL1  ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 533（4）： 1303-1308.

LAN M， LI GL， HU JF， et al.， 2019. iTRAQ-based quantitative analysis reveals proteomic changes in Chinese cabbage （Brassica rapa L.） in response to Plasmodiophora brassicae infection  ［J］. Sci Rep， 9（1）： 12058.

LI ZG， CHEN HW， LI QT， et al.， 2022. Three SAUR proteins SAUR76， SAUR77 and SAUR78 promote plant growth in Arabidopsis  ［J］. Sci Rep， 12（1）： 1994.

LIN Y， WANG YY， YU F， 2020. Bioinformatics analysis and prokaryotic expression of jasmonic acid-isoleucine synthase CrJAR1 from Catharanthus roseus ［J］. Guihaia， 40（8）： 1181-1187.  ［林颖， 王燕燕， 于放， 2020. 长春花茉莉酸-异亮氨酸合成酶CrJAR1生物信息学分析与原核表达 ［J］. 广西植物， 40（8）： 1181-1187.］

LIU Y， ZHANG N， LUO J， et al.， 2021. Chemical constituents of stems and leaves from Uncaria rhynchophylla in Guizhou and their antitumor activities ［J］. Guihaia， 41（7）： 1061-1069.  ［刘扬， 张妮， 罗俊， 等， 2021. 黔产钩藤茎、叶化学成分及抗肿瘤活性研究 ［J］. 广西植物， 41（7）： 1061-1069.］

LOPUKHINA A， DETTENBERG M， WEILER EW， et al.， 2001. Cloning and characterization of a coronatine-regulated tyrosine aminotransferase from Arabidopsis  ［J］. Plant Physiol， 126： 1678-1687.

LU SX， WANG P， NAI GJ， et al.， 2022 Insight into VvGH3 genes evolutional relationship from monocotyledons and dicotyledons reveals that VvGH3-9 negatively regulates the drought tolerance in transgenic Arabidopsis  ［J］. Plant Physiol Biochem， 172： 70-86.

LUO J， ZHOU JJ， ZHANG JZ， 2018. Aux/IAA gene family in plants： molecular structure， regulation， and function  ［J］. Int J Mol Sci， 19（1）： 259.

L XL， HAO L， WANG F， et al.， 2012. Molecular cloning and expression analysis of tyrosine aminotransferase gene fragment in Perilla frutescen ［J］. Chin Agric Sci Bull， 28（24）： 207-212.  ［吕晓玲， 郝磊， 王芳， 等， 2012. 紫苏酪氨酸氨基转移酶基因片段的克隆及表达分析 ［J］. 中国农学通报， 28（24）： 207-212.］

OZBER N， YU L， HAGEL JM， et al.， 2023. Strong feedback inhibition of key enzymes in the morphine biosynthetic pathway from opium poppy detectable in engineered yeast  ［J］. ACS Chem Biol， 18（2）： 419-430.

QI PP， HUANG ML， HU XH， et al.， 2022. A ralstonia solanacearum effector targets TGA transcription factors to subvert salicylic acid signaling  ［J］. Plant Cell， 34（5）： 1666-1683.

QI WL， WANG F， MA L， et al.， 2020 Physiological and biochemical mechanisms and cytology of cold tolerance in Brassica napus  ［J］. Front Plant Sci， 11： 1241.

QIN LY， 2021. Cytological， and physiological biochemical and transcriptomic analyses  of Chinese cabbage in response to Plasmodiophora brassicae infection ［D］. Zhengzhou： Zhengzhou University.  ［秦六月， 2021. 大白菜响应根肿菌侵染的细胞学、生理生化及转录组学研究 ［D］. 郑州： 郑州大学.］

QU RJ， MIAO YJ， CUI YJ， et al.， 2019. Selection of reference genes for the quantitative real-time PCR normalization of gene expression in Isatis indigotica Fortune  ［J］. BMC Mol Biol， 20（1）： 9.

SINHA D， TIWARI AK， SINGH S， et al.， 2008. Synthesis， characterization and biological activity of schiff base analogues of indole-3-carboxaldehyde  ［J］. Eur J Med Chen， 43（1）： 160-165.

TANG XQ， XIAO YH， ZHAO XL， et al.， 2016. Response of biomass and active components in roots and leaves of Isatis indigotica Fort. to nitrogen forms ［J］. J Nanjing Agric Univ， 39（1）： 70-77.  ［唐晓清， 肖云华， 赵雪玲， 等， 2016. 菘蓝根和叶的生物量与活性成分对氮素形态的响应 ［J］. 南京农业大学学报， 39（1）： 70-77.］

WANG DD， SUN TT， ZHAO SY， et al.， 2020. Physiological change alters endophytic bacteria community in clubroot of tumorous stem mustard infected by Plasmodiophora brassicae  ［J］. BMC Microbiol， 20（1）： 244.

WANG GD， CHU YX， XU Z， et al.， 2022. Stress physiology of lotus embryo under temperature stress ［J］. Guihaia， 42（12）： 2128-2137.  ［王公达， 褚云霞， 徐政， 等， 2022. 莲种胚在温度胁迫下的逆境生理研究 ［J］. 广西植物， 42（12）： 2128-2137.］

WANG WL， 2014. New plant physiology experiment guide ［M］. Beijing： Xinhua Publishing House： 83-146.  ［王文龙， 2014. 新编植物生理学实验指导 ［M］. 北京： 新华出版社： 83-146.］

WEI XC， ZHANG YY， ZHAO YY， et al.， 2021. Root transcriptome and metabolome profiling reveal key phytohormone-related genes and pathways involved clubroot resistance in Brassica rapa L.  ［J］. Front Plant Sci， 12： 759623.

WONG LW， GOH C， TAN J， 2022. A systemic review for ethnopharmacological studies on Isatis indigotica Fortune： bioactive compounds and their therapeutic insights  ［J］. Am J Chin Med， 50（1）： 161-207.

XIE Q， LIU YM， HAN FQ， et al.， 2022. Study on the infection process of Plasmodiophora brassicae in broccoli， tomato and capsicum ［J］. Chin Veg， 398（4）： 21-28.  ［谢琪， 刘玉梅， 韩风庆， 等， 2022. 青花菜、番茄与辣椒根肿菌侵染过程研究 ［J］. 中国蔬菜， 398（4）： 21-28.］

XUE J， 2020. Expression， purification and crystal structure analysis of key enzymes THS2 in the synthesis pathway of thebaine ［D］. Tianjin： Tianjin University Science and Technology.  ［薛京， 2020. 蒂巴因合成途径中关键酶THS2的表达纯化及晶体结构解析 ［D］. 天津： 天津科技大学.］

YANG H， REN ZH， HUANG L， et al.， 2014. Identification of main cruciferous cultivars in Hunan province against clubroot ［J］. Hunan Agric Sci， （2）： 5.  ［杨华， 任佐华， 黄露， 等， 2014. 湖南省十字花科蔬菜栽培品种抗根肿病鉴定 ［J］. 湖南农业科学， （2）： 5.］

YANG LG， WANG Q， SUDUNABUQI， et al.， 2021. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Isatis ［J］. Chin J Mod Appl Pharm， 38（16）： 2039-2048. ［杨立国， 王琪， 苏都那布其， 等， 2021. 菘蓝属植物化学成分及药理作用研究进展 ［J］. 中国现代应用药学， 38（16）： 2039-2048.］

YANG PW， LI JR， YANG QZ， et al.， 2002. Extracting and detecting Plasmodiophora brassicae resting spores ［J］. J Yunnan Agric Univ， 17 （3）： 301-302.  ［杨佩文， 李家瑞， 杨勤忠， 等， 2002. 十字花科蔬菜根肿病菌休眠孢子的分离与检测 ［J］. 云南农业大学学报， 17（3）： 301-302.］

YU XF， HAN JP， WANG EF， et al.， 2019. Genome-wide identification and homoeologous expression analysis of PP2C genes in wheat （Triticum aestivum L.）  ［J］. Front Genet， 10： 561.

ZHANG XM， ZHONG JW， CAO LA， et al.， 2023. Genome-wide characterization of aldehyde dehydrogenase gene family members in groundnut （Arachis hypogaea） and the analysis under saline-alkali stress  ［J］. Front Plant Sci， 14： 1097001.

ZHENG CM， TENG B， GAO FL， et al.， 1999. Studies on the changes of superoxide dismutase， peroxidase and polyphenol oxidase in seed coat of soybeans after infected with soybean mosaic virus ［J］. Sci Agric Sin， 32（1）： 99-101.  ［郑翠明， 滕冰， 高凤兰， 等， 1999. 感染SMV后大豆种皮超氧物歧化酶过氧化物酶和多酚氧化酶的变化 ［J］. 中国农业科学， 32（1）： 99-101.］

ZHU HF， LI XF， ZHU YY， et al.， 2015. Effect of root swelling disease on the growth， physiological and biochemical substances and reactive oxygen species metabolism of Chinese cabbage ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 35（12）： 2469-2476.  ［朱红芳， 李晓锋， 朱玉英， 等， 2015. 根肿病对不结球白菜的生长及生理生化物质和活性氧代谢的影响 ［J］. 西北植物学报， 35（12）： 2469-2476.］

（责任编辑  邓斯丽）