檀香NDH脱氢酶基因的克隆、定位与启动子分析

闫海锋 吕金凤 熊发前 丘立杭 周慧文 陈兴隆 马国华

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202303054

闫海锋， 吕金凤， 熊发前， 等， 2024.

檀香NDH脱氢酶基因的克隆、定位与启动子分析 ［Ｊ］.

广西植物， 44（5）： 951-960.

YAN HF， L JF， XIONG FQ， et al.， 2024.

Molecular cloning， location and promoter analysis of NDH dehydrogenase gene from Santalum album ［J］.

Guihaia， 44（5）： 951-960.

摘  要：  为研究檀香NDH脱氢酶基因的功能和调控机制，该文以檀香心材为材料，利用RACE技术克隆SaNDH6基因的全长序列，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析其组织和激素处理后的表达模式，在拟南芥原生质体观测其亚细胞定位，利用PlantCARE分析SaNDH6起始密码子ATG上游2 kb的启动子序列，同时运用PlantRegMap预测可能与其结合的转录因子。结果表明：（1）SaNDH6编码303个氨基酸，为疏水蛋白，亚细胞定位于叶绿体。（2）进化树分析表明，檀香SaNDH6与木本植物NDH6进化关系较近。（3）PlantCARE分析发现，SaNDH6启动子中除含有ACE、AE-box、Box 4、G-Box和GT1-motif等大量光响应元件外，同时还有茉莉酸甲酯（MeJA）反应元件CGTCA-motif和TGACG-motif，赤霉素（GA3）响应元件P-box，以及防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等。（4）PlantRegMap分析发现，有76个转录因子可能与SaNDH6启动子结合，其中ERF家族最多，达40个。（5）SaNDH6在檀香的根、心材、叶片和愈伤组织中均有表达，其中在叶片中的表达量较高；用1×10-4 mol·L-1的MeJA和GA3分别处理檀香愈伤组织后，与处理前（0 h）相比，SaNDH6的表达均在3 h后显著升高。综上结果表明，檀香SaNDH6为核基因编码的蛋白，受光和激素等诱导表达，SaNDH6可能参与檀香逆境胁迫反应的过程。

关键词： 檀香， 叶绿体， NDH脱氢酶， 亚细胞定位， 表达调控

中图分类号：  Q943

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2024）05-0951-10

收稿日期：  2023-07-27  接受日期： 2023-08-25

基金项目：  国家自然科学基金（32060358）； 广东省重点科技项目（2015B020231008）； 广西自然科学基金（2019GXNSFAA185005）。

第一作者： 闫海锋（1980—），博士，副研究员，主要从事林木分子生物学研究，（E-mail）gstsyhf@163.com。

*通信作者：  马国华，博士，研究员，主要从事植物生物技术研究，（E-mail）magh@scib.ac.cn。

Molecular cloning， location and promoter analysis of

NDH dehydrogenase gene from Santalum album

YAN Haifeng1，2，3， L Jinfeng4， XIONG Faqian1，2，3， QIU Lihang1，2，3，

ZHOU Huiwen1，2，3， CHEN Xinglong5， MA Guohua6*

（ 1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology

and Genetic Improvement， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning 530007， China; 3. Key Laboratory of Guangxi

Sugarcane Genetic Improvement， Nanning 530007， China； 4. Guangxi Forestry Group Guiqinlin Pulp Paper Co. Ltd.，

Nanning 530012， China; 5. Agriculture College of Guangxi University， Nanning 530004， China; 6. South

China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China ）

Abstract：  In order to investigate the function and regulation mechanism of NDH dehydrogenase gene in Santalum album， the technique of RACE was used to amplify the full-length sequence of SaNDH6 with heartwood as material. The technique of quantitative real-time fluorescence PCR （RT-qPCR） was employed to analyze its expression in different tissues and after hormone induction. The subcellular location was determined by Arabidopsis thaliana protoplast transient expression. 2 kb cis-acting element upstream of start codon ATG was analyzed by PlantCARE online service， and the transcription factors which could bind the cis-acting elements was predicted by PlantRegMap software. The results were as follows： （1） SaNDH6 encoded 303 amino acids. It was a hydrophobin and located in chloroplast. （2） The phylogenetic tree analysis indicated that SaNDH6 had a more closely evolutionary relationship with NDH6 from woody plants. （3） Plant care analysis showed that the promoter sequence of SaNDH6 contained a large number of light responsive cis-acting elements such as ACE， AE-box， Box 4， G-Box and GT1-motif. It also contained abscisic acid （ABA） responsive element ABRE， jasmonic acid methyl ester （MeJA） responsive elements CGTCA-motif and TGACG-motif， gibberellin （GA3） responsive elements P-box， ARE cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction， and TC-rich repeats element involved in defense and stress responsiveness. （4） The results of plantRegMap analysis showed that there were 76 transcription factors that could bind to the SaNDH6 promoter， and among which， ERF transcription factor was the most （up to 40 TFs）. （5） SaNDH6 can be expressed in the tissues of roots， heartwoods， calluses and leaves， but had a higher expression level in the tissue of leaves; under 1×10-4 mol·L-1 MeJA and GA3 treatments， the expression level of SaNDH6 were significantly elevated after 3 h when compared with 0 h， respectively. In conclusion， SaNDH6 was a nucleus gene encoding protein， its expression was induced by light and some hormones， and it  might be involved in against some defense and stress processes in S. album.

Key words： Santalum album， chloroplast， NDH dehydrogenase， subcellular location， expression regulation

光合作用中，从H2O到NADP+的线性电子传递可以同时产生ATP和NADPH，但产生的ATP/NADPH不足1.5，不能满足卡尔文循的需要，这些不足的ATP由围绕PSI的循环电子传递途径进行补偿（Yamori & Shikanai， 2016）。被子植物中，依赖于NDH复合体的电子传递是围绕PSI循环电子传递的途径之一，其在植物的光合、呼吸、生长以及在保护植物免受强光伤害和抵御低温等逆境胁迫中均发挥作用（Endo et al.， 1999; Yamori et al.， 2011; Yamori & Shikanai， 2016）。因此，NDH复合体的研究越来越受关注。Shinozaki等（1986）和Ohyama（1996）分别通过烟草（Nicotiana tabacum）和地钱（Marchantia polymorpha）的叶绿体基因组测序发现了11个叶绿体编码的NDH基因，虽然这些基因与线粒体NDH基因同源，但叶绿体NDH主要从铁氧化还原蛋白（Fd）接受电子（Ifuku et al.， 2011; Yamamoto et al.， 2011; Shikanai， 2016）。进一步研究表明，除以上11个基因外，许多叶绿体NDH复合体基因是由其核基因组编码的（Sirpio et al.， 2009; Yamori et al.， 2011; Shikanai， 2016）。目前，在拟南芥中共鉴定了30多个NDH复合体基因，总体可以分为5类（Armbruster et al.， 2013; Fan et al.， 2015; Peltier et al.， 2016）。SubA由7个基因组成，其中4个由叶绿体基因组编码（NdhH-NdhK），另外3个由核基因组编码（NdhM-NdhO），均与电子传递到辅酶Q有关（He et al.， 2015）；SubM的6个成员（NdhA-NdhG）均由叶绿体基因组编码，它们在膜中构成了复合体臂并参与电子在膜中的传递；SubB（PnsB1-PnsB5）和SubL（PnsL1-PnsL5）的成员均由核基因组编码且都是叶绿体NDH复合体所特有的组分，SubB可能与维持NDH复合体的稳定有关（Peng et al.， 2009; Takabayashi et al.， 2009），SubL可以维持NDH-PSI复合体的稳定性（Peltier et al.， 2016）；SubED（NdhS、 NdhV、 NdhT和 NdhU）也由核基因组编码，其均能与SubA相互作用形成Fd结合位点（Yamamoto et al.， 2011; Peltier et al.， 2016）。高等植物在进化过程中NDH与PSI形成了复合体，从而提高了电子传递效率并在逆境条件下有利于NDH复合体的结构保持稳定，拟南芥Lhca5和Lhca6在此复合体的形成中起连接作用，并且Lhca6还能够稳定NDH复合体的结构（Peng et al.， 2009）。最近Otani等（2018）研究发现，有更多捕光复合体I蛋白分子参与了NDH-PSI复合体的形成，这些蛋白分子包括Lhca1、2、3、4，它们通过不同组合形成2个复合体，从而连接NDH和PSI。目前对NDH复合体的结构已有较为深入的研究，但一些组成亚基，特别是与NDH-PSI复合体结合并不紧密的组分仍然知之甚少，同时对其功能和调控机制还需进一步探究（Fan et al.， 2015）。

檀香（Santalum album）是分布于热带和亚热带地区的半寄生性珍贵林木，其木材不仅质地坚韧优良，还含有芳香精油，被广泛应用于香料、香薰、雕刻和医药等方面，具有很高的经济价值（Baldovini et al.， 2011）。当前，关于檀香的研究主要集中在其精油的合成和调控等方面，对其光合特性的研究十分缺乏。NDH复合体是檀香光合作用时进行电子传递的重要组分，由哪些基因组成，这些基因的功能和调控如何，关于这些科学问题目前并不明确。本文以檀香木质部为材料，采用分子生物学相关技术方法，通过檀香SaNDH6基因的克隆、进化树、亚细胞定位、组织表达模式、启动子顺式作用元件和可能结合的转录因子分析，探讨SaNDH6在檀香NDH复合体中的具体定位和可能的作用，分析其表达调控模式和其在逆境胁迫中可能发挥的作用，为檀香NDH复合体在光合作用以及逆境胁迫中的功能研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1 植物材料和处理

檀香叶片、根和心材均取自中国科学院华南植物园檀香种植基地的7龄檀香树（至少选择3棵正常生长树木进行取材），液氮速冻后带回实验室-80 ℃保存。取檀香嫩枝为外植体进行愈伤组织诱导，诱导参照Singh等（2015）和Yan等（2018）的方法。在超净台称取等量檀香愈伤组织置于MS液体培养基中，在25 ℃、100 r·min-1条件下黑暗培养24 h，之后分别加入终浓度为1×10-4 mol·L-1的茉莉酸甲酯溶液（MeJA）和赤霉素溶液（GA3），分别在0、3、6 h取样，液氮速冻后置于-80 ℃保存以提取RNA。每处理均设置3次重复。

1.2 SaNDH6的克隆

采用提取木本植物RNA方法（Kolosova et al.， 2004）提取檀香心材总RNA，用NanoDrop ND-1000 分光光度计（Nanodrop Technologies， Wilmington， NC， USA）和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量和完整性。

采用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech Laboratories Inc.， CA， USA）扩增SaNDH6的全长序列，用巢式PCR进行RACE扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行回收，连接PMD18-T载体，转化大肠杆菌DH-5α，挑取阳性克隆到北京华大基因公司（深圳）测序。基因全长扩增（3′ RACE、5′ RACE和ORF）引物见表1。

1.3 SaNDH6的生物信息学分析

SaNDH6的理化性质预测用Expy Protparat （https：//web.expasy.org/cgibin/ Protparam.htmL），亚细胞定位预测利用 plant-mPlo（http：//www.csbio. sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/）。不同植物NDH亚基的氨基酸序列比对用DNAMAN软件，通过MEGA 6.0的邻位相连法（N-J法）建立不同植物NDH基因的系统进化树。

1.4 SaNDH6的亚细胞定位

檀香基因组序列从NCBI下载，下载序列号为GCA_002925775.1（Mahesh et al.， 2018），参照玉米、水稻和拟南芥基因组数据进行相应注释，然后提取SaNDH6基因的启动子序列，并用PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be /webtools /plantcare/html/）进行分析。启动子TF结合位点预测利用PlantRegMap： Plant Regulation Data and Analysis Platform @ CBI， PKU （ http：//plantregmap.cbi.pku.edu.cn/binding_site_prediction.php）进行分析。

扩增SaNDH6的ORF序列（去除终止密码子），利用In-fusion技术构建35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1亚细胞定位载体， 测序确认后按照Yoo 等（2007）的方法进行拟南芥原生质体转化，在22 ℃、弱光下培养12 h 后利用激光共聚焦扫描电镜（Zeiss， Jena， Germany）观察并拍照。

1.5 实时荧光定量PCR分析

用1.1所述的方法分别提取檀香叶片、心材、根和愈伤组织总RNA，用RNase free DNase I（TaKaRa， Japan）进行处理，以确保无DNA污染。用A260/A280在1.9 到2.1、A260/A230大于 2.0且电泳后条带完整的1 μg RNA进行反转录。获得的cDNA用无核酸酶的水稀释10倍后置于-20 ℃备用。

RT-qPCR用ABI 7500 Real-time system （ABI， Alameda， CA， USA）进行测定。反应试剂采用 SoAdvancedTM Universal SYBR Green Supermix detection system （Bio-Rad， Hercules， CA， USA）。反应体系：SYBR Green Supermix 5 μL，引物 （1×10-5 mol·L-1）各0.5 μL， cDNA 1 μL，加入ddH2O至总体系达到10 μL。反应条件为95 ℃预变性2 min， 95 ℃变性15 s，60 ℃退火 1 min，40 个循环。按照Yan等（2018）的方法选取相应内参基因，不同组织中利用SaFAB1A+SaPP2C，MeJA处理利用SaCSA+SaFbp3，GA3处理利用SaPP2C+ SaFbp2作为内参基因，以两个相应内参基因表达量的算术平均值作为内参基因的最终表达量值分别进行校正。每个样品均设置3次重复，最后用2-ΔΔCt方法分析定量数据。RT-qPCR所用引物见表1。

1.6 数据统计分析

用SPSS 19.0（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）进行数据统计分析。多重比较采用邓肯式新复极差法（P<0.05）。

2  结果与分析

2.1 SaNDH6的克隆

根据檀香转录组注释的NDH脱氢酶Unigene设计引物，3′ RACE扩增后得到一条528 bp的特异条带（图1：A），5′ RACE扩增后得到一条317 bp的特异条带（图1：B），经测序后均能与已有序列正确拼接，并且在3′端有Poly A序列，说明正确地得到了其3′和5′端序列。经NCBI ORF Finder分析并拼接后，通过RT-PCR扩增后得到了一条912 bp的目标条带（图1：C），测序后得到了目标序列，并命名为SaNDH6。

2.2 SaNDH6的生物信息学分析

SaNDH6编码303个氨基酸（图2），蛋白分子量为33.75 kDa，理论等电点为9.31，含有28个酸性氨基酸和45个碱性氨基酸，带电氨基酸共有76个，极性不带电氨基酸共有79个，并且含有160个疏水氨基酸，说明其为疏水蛋白。亚细胞定位预测表明其可能定位于叶绿体。

从NCBI下载不同植物NDH亚基的氨基酸序列，利用DNAMAN进行多重序列比对。由图3可知，檀香SaNDH6与桃（Prunus persica）PpNdh6的序列相似度为53.46%，与芝麻（Sesamum indicum）SiNdh6的相似度为52.60%，与木薯（Manihot esculenta）MeNdh6和白牧豆树（Prosopis alba）PaNdh6的相似度均为51.84%，与葡萄（Vitis vinifera）VvNdh6的序列相似性为51.30%，说明我们正确地克隆到了檀香NDH复合体6的基因。

利用MEGA 6.0对不同植物NDH亚基的氨基酸序列构建进化树，由图4可知，檀香SaNDH6与SiNdh6和VvNdh6聚为一类，这与多重序列比对结果较为一致；同时，我们发现SaNDH6与葡萄、甜樱桃（Prunus avium）、川桑（Morus notabilis）、毛果杨（Populus trichocarpa）、麻风树（Jatropha curcas）和橡胶树（Hevea brasiliensis）等木本植物NDH6的进化关系均较近。

2.3 SaNDH6的亚细胞定位

将檀香SaNDH6亚细胞定位载体瞬时转化到拟南芥原生质体，同时以转化YFP空载体为对照。结果发现，转化的35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1和YFP空载体均出现黄色荧光蛋白，说明转化过程可靠。35S： SaNDH6： pSAT6-EYFP-N1融合蛋白的黄色荧光主要分布在叶绿体上，说明SaNDH6蛋白定位于叶绿体（图5），与亚细胞定位预测结果一致。

2.4  SaNDH6的组织表达

由图6可知，SaNDH6在檀香的根、 心材、叶片和愈伤组织中均有表达，其中在叶片中的表达量较高，其次为愈伤组织，在其余两种组织中的表达量均相对较低。

2.5 SaNDH6的启动子分析

檀香基因组数据经过注释后，我们提取了SaNDH6基因起始密码子ATG上游2 000 bp的启动子序列。经过PlantCARE分析发现，其含有大量的光响应元件，如ACE、AE-box、Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、MRE、TCT-motif和chs-CMA1a，说明SaNDH6的表达主要受光的诱导。同时，还发现一些激素响应元件，如脱落酸（ABA）响应元件ABRE、MeJA响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif、赤霉素响应元件P-box，说明SaNDH6的表达可能也受这些激素的调控。此外，还发现一些逆境响应元件，如厌氧诱导元件ARE、防御和胁迫响应元件TC-rich repeats等，说明SaNDH6可能参与檀香的一些逆境胁迫反应过程（图7）。

2.6 可能结合SaNDH6的转录因子分析

通过PlantRegMap分析（图8）发现，有76个转录因子可能与SaNDH6启动子结合，其中ERF家族转录因子最多，共有40个；其次为B3类转录因子，共有13个；MIKC_MADS和AP2类转录因子分别有5个和4个；而FAR1和MYB类转录因子最少，分别只有1个。这说明SaNDH6基因的表达主要受到ERF和B3类转录因子的直接调控。

2.7 不同激素处理后SaNDH6的表达分析

SaNDH6启动子中分别含有激素MeJA和GA3的响应元件，预示着这两种激素可能对SaNDH6的表达有诱导作用。为证明这一猜想，我们用1×10-4 mol·L-1的MeJA和GA3分别处理檀香愈伤组织，SaNDH6表达结果（图9）显示，与0 h相比，MeJA和GA3处理3 h后SaNDH6的表达均显著升高，说明MeJA和GA3均可正向诱导SaNDH6的表达。

3  讨论与结论

3.1 SaNDH6在檀香NDH复合体中的定位

叶绿体NDH脱氢酶是多个亚基组成的内囊体膜蛋白复合物，其包括11个叶绿体基因组编码的亚基和至少19个核基因组编码的亚基，至少有16个基因参与其合成过程（Ifuku et al.， 2011; Yamori & Shikanai， 2016）。本研究檀香中克隆了SaNDH6，通过BLAST搜索发现其与多种植物的NDH6亚基具有很高的序列相似性，并且其与木本植物的NDH6进化关系较近。序列分析表明SaNDH6

为疏水蛋白，亚细胞定位显示其定位于叶绿体，说明SaNDH6通过定位在叶绿体的内囊体膜上行驶功能。SaNDH6在檀香叶片中的表达量较高，但除叶片之外，其在不含有叶绿体的心材、根和愈伤组织中均有表达，据此我们推测SaNDH6是核基因编码的蛋白。

3.2 SaNDH6表达的调控

转录调控在促进或者抑制基因表达中发挥关键的作用，其主要由基因的启动子和位于启动子中的顺式作用元件所控制（Zou et al.， 2011; Hernandez-Garcia & Finer， 2014）。目前，关于叶绿体NDH复合体表达调控的研究鲜有报道。我们通过分析SaNDH6起始密码子ATG上游2 kb的启动子序列后发现，SaNDH6启动子中含有大量的光响应元件，说明光对其表达起到主要的调控作用，与其主要参与光合作用的功能相一致。同时发现，

不同字母表示显著性差异（P<0.05）。下同。

Different letters indicate significant differences （P<0.05）. The same below.

SaNDH6的表达也受到GA3和JA等激素的正向调控。Romanowska等（1984）、Tsai和Arteca等（1985）研究表明，外施GA3可以提高一些植物的生长速率和光合效率，说明GA3可能通过调控SaNDH6的表达参与檀香的光合作用过程。JA除了特异性地调控植物在昆虫取食和死体营养性病原菌侵染的反应过程外（Wasternack， 2015），还参与植物的生长发育和抵御非生物胁迫等逆境反应过程（Qiu et al.， 2014; Per et al.， 2018）。目前，NDH复合体参与病原菌侵染等生物胁迫反应方面的研究很少，但其在抵御非生物胁迫方面已有大量报道（Yamori & Shikanai， 2016）。因此，我们推测JA可能主要通过调控SaNDH6的表达参与檀香对一些非生物胁迫的反应过程，但具体的作用和机制还需探究和验证。

3.3 SaNDH6在逆境胁迫中发挥作用

通过NDH的电子传递和依赖于PGR5/PGRL1的电子传递之间存在部分功能冗余，在正常生长环境下，NDH复合体的突变并不能产生明显的表型变化（Munekage et al.， 2004; Yamori & Shikanai， 2016）。但是深入研究表明，NDH复合体在植物抵御多种逆境胁迫中发挥作用。Hibino等（1996）发现，高盐可以特异地诱导耐盐蓝细菌（Aphanothece halophytica）循环电子传递蛋白的表达，增加依赖于NDH的电子传递， 从而使其能够适应高盐环境；Zhao等（2017）研究证明，在多种环境胁迫下，集胞藻NDH-1能够维持PSI结构的稳定；Li等（2004）等将烟草置于低温（4 ℃）和低光照强度（100 mol·m-2·s-1）环境中，发现ndhB突变体的最大光化学效率（Fv/Fm）和PS Ⅱ驱动的电子传递效率都显著低于野生型植株，推测低温和弱光环境中依赖于NDH的电子传递对光合器官有保护作用； Wang等（2006）研究了不同温度处理后野生型和NDH突变体ndhC-ndhK-ndhJ （DndhCKJ） 烟草植株活性氧积累的差异，发现NDH通过电子传递提高了CO2的同化作用，从而减少了高温胁迫引起活性氧的产生。综上研究表明，植物在强/弱光、高/低温、高盐和低湿等逆境下，依赖于NDH的电子传递在维持光合系统结构的稳定性、促进CO2的同化、避免内囊体基质的过度还原、减少H2O2的产生以及维持正常的光合速率等方面发挥作用。在本研究中，我们发现檀香SaNDH6启动子中也含有一些参与逆境响应的元件，如JA和ABA的响应元件、厌氧诱导元件、防御和胁迫响应元件等。其中，MeJA的响应原件最多，共有4个（TGACG-motif和 CGTCA-motif分别各有2个），其次为与干旱胁迫密切相关的反应原件，共有3个（ABRE 2个，MBS 1个）。结合前人研究结果我们推测SaNDH6除了主要进行光合作用外，还参与檀香的干旱胁迫等逆境反应过程。

综上所述，本研究克隆了檀香叶绿体NDH脱氢酶亚基基因SaNDH6，其编码303个氨基酸，定位于叶绿体，与拟南芥叶绿体NDH脱氢酶的核基因编码亚基具有较近的进化关系。SaNDH6启动子中含有大量光响应元件、一些激素响应元件和参与逆境胁迫反应的元件，ERF和B3类等转录因子可能直接结合该基因的启动子从而调控其表达，组织表达结果显示该基因在檀香的叶片中表达量较高，同时其表达可以被MeJA 和GA3显著诱导。

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（责任编辑  李  莉  王登惠）