梯度洗脱LC-ICP/MS法测定5种硒形态

摘 要：建立一种梯度洗脱液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）分析硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根5种硒形态。样品通过Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱，分别以流动相A 40 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）和流动相B 60 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）梯度洗脱5种硒形态，流速为1.0 mL·min-1，切换时间分别为3.0 min和6.4 min，ICP/MS检测，外标法定量。5种硒形态在8.5 min内检测完毕；0.5～200.0 μg·L-1相关系数r＞0.999，最低检测质量浓度为0.10～0.39 μg·L-1。相较于《生活饮用水标准检验方法 第 6 部分：金属和类金属指标》（GB/T 5750.6—2023）硒形态分析法，该方法将分析时间缩短了46.8%，5种形态峰分离度更好、灵敏度更高。

关键词：硒形态；液相色谱-电感耦合等离子体质谱法；梯度洗脱

Determination of 5 Selenium Species by Gradient Elution LC-ICP/MS

CHEN Siyi， TANG Qiong， HUANG Li， SHI Xiangdong， FAN Yunyan*

（Nanning Center for Disease Control and Prevention， Nanning 530023， China）

Abstract： A gradient elution liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma-mass spectrometry （ICP/MS） method was established for determination of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ）. 5 selenium species samples were separated using a Hamilton PRP-X100 anion exchange column， with mobile phase A 40 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） and mobile phase B 60 mmol·L-1 （NH4）2HPO4+5 mmol·L-1 C6H8O7·H2O （pH=4.6） at flow rate of 1.0 mL·min-1， and the mobile phase switching times were"3.0 min and 6.4 min， respectively， they were determined by ICP/MS and quantified with external standard calibration method. 5 selenium species were detected within 8.5 min. In the concentration range of 0.5～200.0 μg·L-1， the correlation coefficients （r） of the 5 selenium species were greater than 0.999. The limits of detection of the method were 0.10～0.39 μg·L-1. Compared with the method in GB/T 5750.6—2023， the analysis time of this method was shortened by 46.8 %， and the resolutions and sensitivities of 5 selenium species were better.

Keywords： selenium species; liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry; gradient elution

硒是人体的必需微量元素，与健康密切相关，在抗氧化、抗炎、增强免疫力、预防癌症等方面发挥着重要作用[1-2]。硒的安全浓度范围很小，缺硒会引发克山病、地方性心肌炎等疾病，但摄入过量又会增加Ⅱ型糖尿病风险，甚至导致硒中毒[3-4]。硒分为无机硒和有机硒形态，在土壤与环境中主要以无机硒形式存在，而在经生物体转换后的富硒食品中多以有机硒形式存在[5]。饮用水是人体摄入硒的重要来源之一，2023年10月1日实施的《生活饮用水标准检验方法 第6部分：金属和类金属指标》（GB/T 5750.6—2023）中，增加了亚硒酸根Se（Ⅳ）、硒酸根Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）5种硒形态的液相色谱-电感耦合等离子体质谱（Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，LC-ICP/MS）检测方法，是我国第一个同时定量分析5种硒形态的国家标准，为我国饮用水中硒形态的存在形式和存量检测提供了依据。但国标法分析时间较长，硒代蛋氨酸灵敏度不足，本研究拟用不同流动相梯度洗脱对该法进行优化，以缩短分析时间，降低检出限。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

按GB/T 5750.2—2023要求采集末梢水、江河水源水和瓶装纯净水，以及经过链蛋白酶消化的食品处理液。

磷酸氢二铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；亚硒酸根溶液标准物质GBW10032、硒酸根溶液标准物质GBW10033、硒代蛋氨酸溶液标准物质GBW10034、硒代胱氨酸溶液标准物质GBW10087、甲基硒代半胱氨酸溶液标准物质GBW10088（中国计量科学研究院）；实验用水均为超纯水。

LC300-ICPMS NexION5000G液相联用电感耦合等离子体质谱仪（美国铂金埃尔默股份有限公司）；Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱（美国哈密尔顿公司）；ADVANCED-I-12艾柯实验室超纯水机（成都艾柯水处理设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

称取适量的SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）标准物质，用水配制成1.0 mg·L-1的混合标准溶液，再用水逐级稀释至浓度为0.5～200.0 μg·L-1的混合标准溶液系列。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱：Hamilton PRP-X100阴离子交换色谱柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；分别以不同流动相、流速、洗脱时间分离50.0 μg·L-1的5种硒形态混合标准溶液，并以保留时间、峰面积、分离度等参数为指标优化色谱条件；进样体积：100 μL。

1.2.3 电感耦合等离子体质谱条件

用ICP/MS调谐液调谐优化仪器参数。射频功率：1 600 W；雾化器气流量：0.91 L·min-1；稀释气流量：0.15 L·min-1；补偿气流量：1.15 L·min-1；氦气碰撞气流量：3.5 L·min-1；检测质量数：78 amu；蠕动泵转速：60 r·min-1。

1.2.4 数据处理

采用Clarity软件对图谱进行鉴定分析，实验数据经Excel和GraphPad 8.0分析及制图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度磷酸氢二铵对不同硒形态分离的影响

按标准法以1.2 mL·min-1的流动相流速，比较40 mmol·L-1、50 mmol·L-1、60 mmol·L-1磷酸氢二铵对5种硒形态保留时间的影响，发现不同浓度的磷酸氢二铵仅对Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）2种无机硒形态的保留时间影响较大，随着浓度增加，其保留时间变短。当磷酸氢二铵浓度为40 mmol·L-1时，Se（Ⅵ）的保留时间为15.296 min；浓度为60 mmol·L-1时，Se（Ⅵ）的保留时间为8.877 min，分析时间整体缩短。当磷酸氢二铵浓度为60 mmol·L-1时，MeSeCys和Se（Ⅳ）的分离度只有1.416，未完全分离，浓度为40 mmol·L-1时前3个峰的分离度更好。综上，分离SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）选用40 mmol·L-1磷酸氢二铵作为流动相，分离SeMet、Se（Ⅵ）选用60 mmol·L-1磷酸氢二铵作为流动相。

2.2 不同浓度柠檬酸对不同硒形态分离的影响

在众多以Hamilton PRP-X100阴离子色谱柱为分析柱研究硒形态分离的研究中，常以磷酸氢二铵、柠檬酸为流动相，还未有研究使用两种盐作为流动相。本研究在40 mmol·L-1磷酸氢二铵（pH=6.0）的基础上加入不同浓度的柠檬酸（并检测加入柠檬酸后的pH值），以缩短Se（Ⅵ）的保留时间。结果显示，柠檬酸对Se（Ⅵ）保留时间影响较大，随着加入的柠檬酸浓度增加，其保留时间减小，见图1。以上试验中，5种硒形态的分离度均＞1.5，柠檬酸加入浓度为

5 mmol·L-1时，分析时间9 min与8 mmol·L-1柠檬酸时间相当，但分离度稍好（分离度＞2.0）。比较不同柠檬酸浓度分离峰的峰面积，结果显示，除Se（Ⅳ）外，4种硒形态峰面积随着柠檬酸浓度的增大而增大；在加入柠檬酸浓度≥5 mmol·L-1时，MeSeCys和SeMet峰面积显著增大（P＜0.05）；加入浓度为8 mmol·L-1时，峰面积与5 mmol·L-1无显著性差异，见图2。说明柠檬酸有促进色谱柱保留分离硒形态的作用，一定程度上增强了分离效果，进而降低了检出限，尤其是提高了MeSeCys和SeMet的灵敏度。为了减少进入ICP/MS的盐分，综合考虑选取40 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）作为分离SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）的流动相。

不同字母表示组间具有显著性差异，P＜0.05。

2.3 不同流动相流速对不同硒形态分离的影响

分别用1.2 mL·min-1、1.0 mL·min-1、0.8 mL·min-1的流动相流速分析5种硒形态，结果显示，随着流速的降低，5种形态的峰面积都有不同程度的增加；峰面积组间比较均具有显著性差异（P＜0.05）。说明流速为0.8 mL·min-1时，色谱柱的柱效最好，对5种形态的保留与分离效果最佳。从分析时间看，流速为1.2 mL·min-1时，总分析时间为9.0 min；流速为1.0 mL·min-1时，总分析时间为10.7 min；流速为0.8 mL·min-1时，总分析时间为13.4 min。虽然使用0.8 mL·min-1流动相分析效果最佳，但分析时间长，综合考虑选用1.0 mL·min-1流速进行分析。

2.4 梯度流动相切换时间

以40 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）为流动相A，1.0 mL·min-1的流速分析5种硒形态，在4.0 min已经分析完前3种形态，SeMet和Se（Ⅵ）的保留时间相隔较远，使用梯度分离减小Se（Ⅵ）的保留时间。为保证柱子平衡，基线平稳，梯度流动相只增加磷酸氢二铵的浓度，即使用

60 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）为流动相B。用流动相B分析5种硒形态，发现Se（Ⅵ）出现裂峰，因此Se（Ⅵ）由流动相A分离。经过验证，0～3 min使用流动相A，3.0～6.4 min使用流动相B，6.4 min以后再切换回流动相A至分析完毕，分离效果最好，分析时间为8.5 min，色谱图见图3（a）。国家标准使用40 mmol·L-1磷酸氢二铵（pH=6.0）为流动相，流速为1.2 mL·min-1，进行5种硒形态的色谱分离，分析时间为16 min，色谱图见图3（b）。相较于国家标准方法，本方法分析时间缩短了46.8%。

2.5 方法线性范围及检出限

对优化色谱条件后的方法进行方法学验证，结果显示，在0.5～200.0 μg·L-1，5种硒形态相关系数均＞0.999。以3倍基线噪声时的硒形态浓度为检出限，10倍基线噪声时的硒形态浓度为定量限，确定SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、Se（Ⅵ）的检出限分别为0.06 μg·L-1、0.07 μg·L-1、0.06 μg·L-1、0.21 μg·L-1、0.10 μg·L-1，定量限分别为0.20 μg·L-1、0.24 μg·L-1、0.22 μg·L-1、0.69 μg·L-1、0.32 μg·L-1，结果见表1。

2.6 回收率与精密度

对末梢水、江河水源水、瓶装纯净水以及经过链蛋白酶消化的食品处理液分别进行低、中、高3个浓度水平（5 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1）的加标回收实验，每个浓度水平制备6个平行样品，计算加标回收率和相对标准偏差。瓶装纯净水中5种硒形态的平均加标回收率为97.0%～103.0%，RSD为0.78%～3.97%；末梢水中5种硒形态的平均加标回收率为96.0%～104.2%，RSD为0.77%～5.48%；水源水中5种硒形态的平均加标回收率为92.0%～102.6%，RSD为0.47%～3.99%；经链蛋白酶消化后的食品处理液中5种硒形态的平均加标回收率为89.4%～104.3%，RSD为1.32%～6.85%；可见方法精密度和准确度均达到标准要求。

3 结论

本文对GB/T 5750.6—2023中10.5液相色谱-电感耦合等离子体质谱法检测5种硒形态的方法进行优化，样品通过Hamilton PRP-X100阴离子色谱交换柱，分别以流动相A 40 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）和流动相B 60 mmol·L-1磷酸氢二铵+5 mmol·L-1柠檬酸（pH=4.6）进行梯度洗脱5种硒形态，流速为1.0 mL·min-1，切换时间分别为3.0 min和6.4 min，ICP/MS检测，外标法定量。本方法分析时间仅为8.5 min，较国家标准法（16 min）缩短了近一半的时间，最低检测质量浓度（即定量限）降低了2/3，使用的流动相盐离子总量减少了41.3%，增强了仪器的稳定性和耐用性。本实验室用该法检测生活饮用水及食品消化液，精密度及准确度均满足要求。

参考文献

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[2]黄轶驰，田红旗.纳米硒制备方法、抗氧化作用机制及临床应用研究进展[J].山东医药，2021，61（6）：103-108.

[3]ALHARITHY M，ALAFIF N.Association of selenium intake and selenium concentrations with risk of type 2 diabetes in adults：a narrative review[J].Metabolites，2023，13（6）：767.

[4]GENCHI G，LAURIA G，CATALANO A，et al.Biological activity of selenium and its impact on human health[J].Int J Mol Sci，2023，24（3）：2633.

[5]ABEJÓN R.A bibliometric analysis of research on selenium in drinking water during the 1990-2021 period： treatment options for selenium removal[J].Environ Res Public Health.2022，19（10）：5834.

基金项目：广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题（Z20200530，Z20200394）；广西卫生应急技能培训中心2022年度开放课题项目（HESTCG20225）；南宁市科学研究与技术开发计划项目（ZC20223240）。

作者简介：陈思伊（1987—），女，广西南宁人，硕士，副主任技师。研究方向：食品及水质理化检测。

通信作者：范云燕（1981—），女，广西桂林人，硕士，主任技师。研究方向：食品及水质理化检测。E-mail：jiandan162@163.com。