UPLC-MS/MS法同时快速检测有机肥中55种抗菌药物

张柏铭 秦立得 王淑婷 刘迎春 孙晓亮 李雪萍 王玉东 王晓茵 赵思俊 曹旭敏 刘坤 王述柏 宋翠平

收稿日期：2022-11-14

基金项目：山东省家禽产业技术体系项目（SDAIT-11-14）

作者简介：张柏铭（2000-），男，山东烟台人，本科生，主要从事动物产品安全监测研究，（电话）18853559551（电子信箱）1820623270@qq.com；共同第一作者，秦立得（1989-），男，山东泰安人，助理研究员，硕士，主要从事动物产品安全监测研究，（电话）15712710612（电子信箱）825149813@qq.com；通信作者，宋翠平（1971-），女，山东潍坊人，正高级兽医师，博士，主要从事动物产品安全监测研究，（电话）13963915205（电子信箱）1575369253@qq.com。

摘要：建立了同时检测有机肥中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类3类55种抗菌药物残留的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）。将有机肥研磨、过筛制成试验样品后，使用HLB固相萃取柱净化，上样后依次用去离子水、5%乙腈水溶液淋洗，甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比7∶3，含5%氨水）洗脱，氮吹吹干，0.1%甲酸水/乙腈（体积比=9∶1）复溶；在多反应检测模式下进行测定，外标法定量。结果表明，4批有机肥中55种药物在1.0～100 μg/kg范围内线性关系良好（R2>0.990 0），该方法的检出限为2.0～7.5 μg/kg，定量限为5.0～25.0 μg/kg，各种药物的回收率为60.2%～118.7%，批内相对标准偏差（n=5）为0.5%～15.0%，批间相对标准偏差（n=20）为4.3%～24.1%。该方法简单可靠，净化效果好，适用于有机肥中磺胺类、喹诺酮类、大环内脂类药物的同时检测。

关键词：有机肥；超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）；快速检测；抗菌药物

中图分类号：S859.84         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0175-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.031            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous and rapid detection of 55 antibacterial drugs in organic fertilizer using

UPLC-MS/MS

ZHANG Bai-ming1，QIN Li-de1，2 ，WANG Shu-ting1，LIU Ying-chun3，SUN Xiao-liang1，LI Xue-ping4，WANG Yu-dong1，

WANG Xiao-yin1， ZHAO Si-jun1，CAO Xu-min1，LIU Kun1，WANG Shu-bai5， SONG Cui-ping1

（1. China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao  266032， Shandong，China；2. College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University，Jinzhong  030031， Shanxi，China；3. Qingdao Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Qingdao  266032， Shandong，China；

4.Qingdao Jiulian Group Co.，Ltd，Qingdao  266611， Shandong，China；5. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University， Qingdao  266032， Shandong，China）

Abstract： An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was established for the simultaneous detection of 55 types of antibacterial drugs， including sulfonamides， macrolides， and quinolones， in organic fertilizer.After grinding and sieving the organic fertilizer into experimental samples， they were purified using HLB solid-phase extraction column. After loading， the samples were sequentially washed with deionized water and 5% acetonitrile aqueous solution， eluted with methanol/ethyl acetate solution （volume ratio 7∶3， containing 5% ammonia）， blown dry with nitrogen， and re-dissolved in 0.1% formic acid water/acetonitrile （volume ratio 9∶1）；measurement was carried out in a multi reaction detection mode， with the external standard method for quantification. The results showed that among the four batches of organic fertilizers， 55 drugs had a good linear relationship （R2>0.990） within the range of 1.0～100 μg/kg，the detection limit of this method was 2.0～7.5 μg/kg，the quantitative limit was 5.0～25.0 μg/kg，the recovery rates of various drugs were 60.2%～118.7%，the relative standard deviation within the batch （n=5） was 0.5%～15.0%， and the relative standard deviation between batches （n=20） was 4.3%～24.1%. This method was simple and reliable， with a good purification effect， and was suitable for the simultaneous detection of sulfonamide， quinolone， and macrocyclic lipid drugs in organic fertilizer.

Key words： organic fertilizer； UPLC-MS/MS； rapid detection； antibacterial drugs

张柏铭，秦立得，王淑婷，等. UPLC-MS/MS法同时快速检测有机肥中55种抗菌药物［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：175-181．

中国每年生产肉蛋奶1.5亿t，伴随产生畜禽粪污约31亿t［1］。畜禽粪污是制造有机肥的重要原料，农田施用有机肥可改善土壤肥力，对形成种植业和养殖业良性循环具有重要意义。中国动物养殖环节大量使用抗菌药物，2019年用量为3.7万t，30%～90%抗菌药物代谢至体外并最终进入粪污［2］。常用的有机肥制作方法难以高效降解畜禽粪污中的抗菌药物，导致有机肥中普遍检测出抗菌药物残留［3-5］。抗菌药物随肥料进入环境，可增加细菌耐药性选择压力，促进抗菌药物抗性基因积累，导致致病菌耐药性增强，影响公共卫生安全［6-8］。

有机肥成分复杂，基质对检测结果影响较大，目前已有检测其中喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类等多类药残留的方法［9-13］。但在样品检测中发现，这些方法存在耗材成本较高、基质干扰严重、方法不稳定、检测药物种类较少等缺点。本试验采用乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液作为提取液，HLB固相萃取柱对有机肥样品进行前处理，运用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）进行检测，建立能同时检测有机肥中喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类等畜禽养殖环节常用抗菌药物残留的方法，该方法灵敏度高、准确度高，适用于大批量样品的检测，可为监测畜禽粪污中抗菌药物含量并评估风险提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Aglient 6470型高效液相色谱-串联质谱仪［配备分析软件，安捷伦科技（中国）有限公司］，5804R型台式高速冷冻离心机［艾本德（上海）国际贸易有限公司］，Milli-Q型超纯水仪［密理博仪器（上海）有限公司］，CP225D型电子天平［赛多利斯斯泰帝（上海）贸易有限公司］，UMV-2型多功能振荡器（日照亿岚仪器设备有限公司），KQ-500DE型超声波仪（昆山市超声仪器公司）。

1.2 主要试剂

色谱纯级乙腈、甲醇、甲酸，分析纯级乙酸、氨水等试剂均购自上海安谱实验科技股份有限公司；磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类3类55种药物标准品均购自上海安普实验科技股份有限公司和德国Dr.Ehrenstorfer公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）等试剂均购自国药集团化学试剂公司；去离子水为实验室自制。HLB 固相萃取柱（3 mL，60 mg）购自美国沃特世公司；0.22 μm滤膜等耗材购自天津市津腾科技有限公司。

1.3 标准溶液配制

准确称取磺胺二甲基异嘧啶标准品2.5 mg，用甲醇充分溶解后定容至25 mL，配制成浓度为 100 μg/mL的磺胺二甲基异嘧啶标准储备液，用同样的方法分别配制其余54种药物储备液，-20 ℃冷冻保存。从上述55种药物储备液中分别吸取250 μL溶液至25 mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，配制成各种药物浓度为1.0 μg/mL的混合标准工作液，-20 ℃冷冻保存备用。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取 有机肥经研磨，过1.7 mm试样筛，制成试验样品。将不含55种药物的有机肥作为空白样品。准确称取样品（2.00±0.02） g于50 mL离心管中，加入5 mL EDTA-Mcllvaine（pH=4.0）缓冲液，振荡混合均匀；加入20 mL乙腈/乙酸（体积比为9∶1），混合均匀后，超声波处理15 min，振荡15 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.4.2 样品净化 取2.5 mL上清液，置于45 ℃水浴氮吹仪中缓慢浓缩至液体体积小于0.5 mL，加入    5 mL EDTA-Mcllvaine缓冲液复溶，振荡1 min。HLB固相萃取柱用 3 mL甲醇、3 mL去离子水活化，将前一步复溶液全部过柱，依次用3 mL去离子水、  3 mL 5%乙腈水溶液淋洗。用3 mL甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比7∶3，含5%氨水）洗脱固相萃取柱，收集洗脱液，45 ℃水浴氮吹仪吹干。加入1 mL 0.1% 甲酸水/乙腈（体积比为9∶1）复溶液溶解残渣，涡旋20 s，超声波处理2 min，涡旋20 s，经0.22 μm滤膜过滤后装瓶上机检测。

1.5 测定条件

1.5.1 液相色谱条件 色谱柱为BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温35 ℃，流动相A为乙腈，流动相B为 0.1%甲酸溶液，流速为0.3 mL/min，进样体积为5.0 μL，梯度洗脱条件如表1所示。

1.5.2质谱条件 离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式（ESI+），检测方式为多反应检测（MRM）；载气温度为250 ℃，载气气流为7 L/min，鞘气温度为325 ℃，鞘气流速为11 L/min。55种药物的质谱参数如表2所示。

1.6 线性范围和基质匹配标准曲线的绘制

有机肥空白样品经过“1.4”前处理方法提取、净化后，添加不同体积的混合标准工作液，配制成药物浓度分别为 1.0、1.5、2.0、5.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的系列基质匹配标准工作液并上机分析。以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准曲线，计算回归方程和相关系数。

1.7 回收率、检出限和定量限

向2.00 g空白有机肥样品中添加不同体积的混合标准工作液，按“1.4”前处理对样品进行处理，上机检测。综合试验数据，当特征离子色谱峰信噪比S/N≥10时，对应的样品抗菌药物浓度为定量限（LOQ）；S/N≥3时，对应的样品抗菌药物浓度为检出限（LOD）。

在4批有机肥样品（每批样品5个重复）中分别添加适量混合标准工作液，使其成为药物浓度为25 μg/kg的阳性样品，测定55种药物的回收率，并计算批内相对标准偏差（RSD）和批间相对标准偏差（RSD）。

1.8 实际样品的检测

采用本试验建立的方法对山东省4家有机肥场采集的4份有机肥样品进行检测。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 提取方法优化 参考相关文献和标准的提取方法［9-13］，对比甲醇、乙腈、乙酸乙酯、EDTA-Mcllvaine缓冲液等不同提取液的提取效果。试验发现，使用甲醇、乙酸乙酯作为提取液时，会提取到大量杂质并难以净化；使用乙腈作为提取液时，提取到的杂质较少，药物回收率较高；使用EDTA-Mcllvaine缓冲液有助于喹诺酮类药物的提取。因此，本研究采用乙腈-EDTA-Mcllvaine缓冲液作为提取液，并对比了乙腈与EDTA-Mcllvaine缓冲液不同混合比例的提取效果。结果表明，EDTA-Mcllvaine缓冲液与乙腈的体积比为1∶4时，提取效果最佳（图1）。研究发现，在提取液中加入10%乙酸有助于提升提取效果，最优的提取液配比为EDTA-Mcllvaine缓冲液∶乙腈（10%乙酸）=1∶4（体积比）。此外，超声波处理有助于大环内酯类和喹诺酮类药物的提取［14］，本试验中提取体系超声波处理时间为15 min。

2.1.2 净化方法优化 对淋洗液进行优化，比对5%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液、5%乙腈水溶液、10%乙腈水溶液的淋洗效果。结果表明，10%乙腈水溶液、10%甲醇水溶液作为淋洗液时，降低了部分抗菌药物的回收率；5%乙腈水溶液去除杂质的效果较好，回收率较高。因此本研究选用5%乙腈水溶液作为淋洗液（图2）。

1为5%甲醇水溶液；2为10%甲醇水溶液；3为5%乙腈水溶液；4为10%乙腈水溶液

2.1.3 洗脱液优化 对固相萃取柱上保留的目标药物进行洗脱，含氨水的甲醇能够较好地洗脱目标药物，但洗脱的杂质较多；乙酸乙酯洗脱的杂质较少，但不能有效洗脱大部分药物。试验对比了不同比例乙酸乙酯和甲醇混合洗脱液对目标药物的洗脱效果，并优化了洗脱液中氨水的浓度。结果表明，70%甲醇/乙酸乙酯（体积比7∶3，含5%氨水）作为洗脱液时洗脱效果最佳（图3）。

1为5%氨化甲醇溶液（体积比为5∶95）；2为50%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为1∶1）；3为50%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为1∶1，含2%氨水）；4为50%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为1∶1，含5%氨水）；5为70%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为7∶3）；6为70%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为7∶3，含2%氨水）；7为70%甲醇/乙酸乙酯溶液（体积比为7∶3，含5%氨水）

2.2 线性范围和基质匹配标准曲线

以标准溶液质量浓度（ng/mL）为横坐标，以离子峰面积为纵坐标，制作基质匹配标准曲线。目标药物在1～100 μg/kg的浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.990 0，如表3所示。

2.3 回收率、检出限、定量限 、批内相对标准偏差和批间相对标准偏差

由表4可知，该方法的检出限为2.0～7.5 μg/kg，定量限为5.0～25.0 μg/kg；4批有机肥样品中55种药物的回收率为60.2%～118.7%；批内相对标准偏差（n=5）为0.5%～15.0%，批间相对标准偏差（n=20）为4.3%～24.1%。

2.4 实际样品检测结果

使用本检测方法对山东省采集的4份有机肥进行测定，结果显示，1份样品中未检测出55种药物残留，其余3份均有药物残留检出，其中1份样品中检测出恩诺沙星残留，残留浓度为120.0 μg/kg；1份样品中检测出恩诺沙星、环丙沙星和替米考星药物残留，残留浓度分别为173.4、16.3、51.6 μg/kg；1份样品中检测出恩诺沙星、环丙沙星和达氟沙星药物残留，残留浓度分别为112.0、49.0、18.7 μg/kg。

3 小结

本研究优化了提取液、提取方法、淋洗液、洗脱液等前处理步骤，建立了能同时检测有机肥中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类3类55种抗菌药物残留的UPLC-MS/MS方法。与文献报道方法和国标方法相比，该方法的净化效果较好，使用的耗材成本较低，检测灵敏度和重复性满足检测需求，可实现对有机肥中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类3类55种抗菌药物的快速检测。

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