超声波-盐析辅助蒸馏提取黑胡椒精油方法优化及活性分析

谭子祎 曾佳如 李萌

摘要：采用超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏法提取黑胡椒（Piper nigrum L.）精油，利用响应面法确定了最佳的液料比、超声时间、NaCl浓度等提取参数。结果表明，超声波辅助蒸馏法提取黑胡椒精油的最佳条件参数为液料比17∶1、超声时间13 min、NaCl浓度2.4%。在此条件下黑胡椒精油的得率为1.79%。对使用此方法获得的黑胡椒精油进行了抗氧化和抑菌活性检测，结果表明提取物具有一定的抗氧化能力，且对ABTS的清除能力远强于对DPPH的清除能力。同时，提取物对金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌均具有较强的生长抑制功能。

关键词：黑胡椒（Piper nigrum L.）；精油；超声波；水蒸气蒸馏；抗氧化；抑菌

中图分类号：TQ654.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0162-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.029            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of ultrasonic-assisted salting-out assisted extraction of essential oil

from Piper nigrum L. and its activity analysis

TAN Zi-yi， ZENG Jia-ru， LI Meng

（College of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha  410004， China）

Abstract： The ultrasonic-assisted salting-out assisted steam distillation method was used to extract essential oil from Piper nigrum L.. Response surface methodology was used to determine the optimal extraction parameters such as liquid-solid ratio， ultrasonic time and NaCl concentration. The results showed that the optimal extraction condition of essential oil from Piper nigrum L. by ultrasonic-assisted distillation method was the liquid-solid ratio of 17∶1， ultrasonic time of 13 min， and NaCl concentration of 2.4%. Under this condition， the extraction yield of Piper nigrum L. essential oil was 1.79%. The extracts obtained by this method were tested for antioxidant and antibacterial activities. The results showed that Piper nigrum L. essential oil had a certain antioxidant capacity， and its scavenging ability on ABTS was much stronger than that on DPPH. The extract also showed strong growth inhibition against both Staphylococcus aureus and Pseudomonas solanacearum.

Key words： Piper nigrum L.； essential oils； ultrasound； steam distillation； antioxidant； bacteriostatic

收稿日期：2022-08-15

基金项目：湖南省教育厅重点研究项目（20A521）；湖南省自然科学基金项目（2021JJ31144）；中南林业科技大学校级研究生创新项目

（2022CX02068）

作者简介：谭子祎（1998-），女，湖南邵阳人，硕士，主要从事生物资源转化与利用研究工作，（电话）17369323060（电子信箱）995909067@qq.com；共同第一作者，曾佳如（2000-），女，湖南长沙人，本科，研究方向为生物工程，（电话）18307388377（电子信箱）563838217@qq.com；

通信作者，李 萌（1980-），男，湖北荆门人，副教授，博士，主要从事生物工程研究工作，（电话）13319516033（电子信箱）

limeng0422@foxmail.com。

谭子祎，曾佳如，李 萌. 超声波-盐析辅助蒸馏提取黑胡椒精油方法优化及活性分析［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：162-167．

黑胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）常绿热带藤本植物，又名古月、黑川及白川。黑胡椒风味辛辣，是国际市场重要的大宗调味品，被誉为“香料之王”［1］。据2020年版《中华人民共和国药典》记载，胡椒具有散寒和消痰的功效，可用于治疗因胃寒引起的呕吐、腹泻以及食欲不振、多痰及腹痛［2］。

黑胡椒粒中精油含量为1%～3%，其活性成分主要包括萜烯类物质［3］，如胡椒碱、3-蒈烯、石竹烯等，这些成分具有一定的抗氧化［4］和抑菌［5］活性，作为天然防腐剂和抗氧化剂有巨大的应用潜力，可应用于食品工业中。传统的胡椒精油萃取方法有水蒸气蒸馏［6-8］、溶剂萃取［9］、同时蒸馏萃取［10］等。但目前的工艺收率偏低，操作繁琐，且溶剂残留对精油品质有负面影响。因此，如何提高精油得率和降低有机溶剂残留量成为了亟待解决的问题，开发高效、简洁、绿色环保的萃取工艺具有至关重要的意义。近年来，对植物精油提取的应用研究十分活跃，各种新的提取方法层出不穷，如微波辅助蒸馏［11］、超声辅助蒸馏［12，13］、酶辅助水蒸气蒸馏［14］、盐析辅助蒸馏［15-18］等。席小辉等［15］使用盐析辅助水蒸气蒸馏法提取肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）精油，最大得率可达13.27%，与水蒸气蒸馏法相比，得率提高了3.42%。对盐析辅助水蒸气蒸馏法提取的肉豆蔻精油理化性质、化学组成及热力学性质进行测定后，发现新方法对肉豆蔻精油品质无影响。本研究尝试将超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏法应用于黑胡椒精油的提取，优化提取过程中的相关参数，提高黑胡椒精油的提取效率。同时对本方法获得的提取物进行抗氧化和抑菌活性测定，为全面开发利用黑胡椒精油提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

材料与试剂：黑胡椒（越南产）；氯化钠（NaCl），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析纯，福州飞净生物科技有限公司；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯；青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum 335855）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 186335），购自北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。

仪器与设备：GR110DA型高压灭菌锅，广州合众生物科技股份有限公司；101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1D型超净工作台，苏州净化设备有限公司；ZHWY-100B型摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；DH-420型细菌培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；Cytation 5型多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黑胡椒精油的提取 参考2020版《中华人民共和国药典》通则2204挥发油测定法［2］和哈立洋等［19］、张圆圆等［20］的方法从黑胡椒中提取精油。取黑胡椒颗粒在55 ℃烘箱中干燥，粉碎，过40目筛。准确称取20.00 g黑胡椒粉末于圆底烧瓶中，添加NaCl溶液后进行超声处理。使用挥发油提取器，水蒸气蒸馏2 h，上层精油常温下采集，用无水硫酸钠吸干水分得到最终提取物，计算得率。提取物密封后保存于4 ℃。

黑胡椒精油得率=[提取精油质量胡椒粉末质量×100%]   （1）

1.2.2 单因素试验 采用“1.2.1”中的提取方法，维持NaCl浓度6%、液料比10∶1不变，分别研究超声时间为0、15、30、45、60 min时对黑胡椒精油得率的影响；维持超声时间30 min、液料比10∶1不变，分别研究NaCl浓度0、3%、6%、9%、12%时对黑胡椒精油得率的影响；维持超声时间30 min、NaCl浓度6%不变，分别研究液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1时对黑胡椒精油得率的影响。考察各试验因素对黑胡椒精油得率的影响，进而确认响应面分析的试验因素及水平。

1.2.3 响应面优化分析 为获得黑胡椒精油的最佳提取条件，基于Box-Behnken试验设计原理，以提取的黑胡椒精油得率（Y）为响应值，设计关于超声时间（A）、NaCl浓度（B）和液料比（C）的三因素三水平响应面优化试验，响应面试验因素及水平见表1。

1.2.4 黑胡椒精油抗氧化活性测定

1）DPPH自由基清除能力测定。清除DPPH自由基的能力测定参照Compton等［21］的方法，略有改动。在96孔板中加入198 μL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，再加入所需浓度的待测样品2 μL，静置反应   30 min，反应全程遮光处理，检测样品在517 nm处的吸光度。以维生素C（0.5 mg/mL）作为阳性对照，无水乙醇作为空白对照。

DPPH清除率=[（1-A1A0）×100%]                      （2）

式中，A0代表空白对照吸光度；A1代表所测样品溶液吸光度。

2）ABTS自由基清除能力测定。用Fu等［22］的方法测定黑胡椒精油对ABTS自由基的清除能力。将0.4 mL ABTS溶液（7.4 mmol/L）与0.4 mL 过硫酸钾溶液（2.6 mmol/L）混合，在黑暗条件下反应12 h，加适量无水乙醇稀释后，于734 nm处检测吸光度，使其吸光度在0.68～0.72。在96孔板中加入98 μL上述ABTS工作液，加入所需浓度的待测样品2 μL，静置反应6 min，反应全程遮光处理，检测吸收度。以维生素C（0.5 mg/mL）作为阳性对照，无水乙醇作为空白对照。

ABTS清除率=[（1-A2A0）×100%]   （3）

式中，A0代表空白对照吸光度；A2代表所测样品溶液吸光度。

1.2.5 黑胡椒精油抗菌活性研究

1）抑菌圈的测定。采用琼脂打孔法［23］。将2 mL菌悬液（经稀释平板计数法测得浓度约为6.65×106 CFU/mL）加入已灭菌且温度适宜（40～50 ℃）的      200 mL LB琼脂培养基中，摇晃均匀。在无菌操作台进行倒平板并等待凝固后，用1 mL枪头（直径为8 mm）均匀打孔，每板3～5孔。将精油样品加入琼脂孔中，每一小孔加20 μL，放入37 ℃培养箱中，恒温培养24 h。以不添加提取物的溶剂作为空白对照。在培养完成后，对抑菌圈进行观察，并记录抑菌圈大小，用交叉法测量抑菌圈直径。

2）最小抑菌浓度（MIC）的测定。参考试管倍比稀释法［24］测定最小抑菌浓度。黑胡椒精油浓度梯度设为100、50、25、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 μg/mL和空白。在不同浓度的精油样品中加入已校正浓度的菌液0.05 mL，混匀，37 ℃恒温培养24 h。培养结束后，比较试验组与对照组浑浊度，取液体相对澄清且未见细菌生长的最低浓度记为MIC值。

1.3 数据分析

所有数据均通过3个生物学重复测定得出。采用SPSS 25软件进行单因素方差统计分析，采用Design-Expert 10.0.1软件优化黑胡椒精油提取的相关因素作出响应面，采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 黑胡椒精油提取单因素影响分析

2.1.1 超声时间对黑胡椒精油得率的影响 由图1可知，在超声时间小于15 min时，黑胡椒精油得率逐渐升高，表明超声可能有加快黑胡椒精油在溶剂界面上的扩散速度的作用［25］，此时黑胡椒精油的得率最高。随着时间的延长，提取所得的黑胡椒精油得率逐渐下降，可能是在超声处理过程中产生的热量和空穴效应等都会一定程度上破坏黑胡椒精油结构，导致得率下降［13］。因此，选择0、15、30 min作为进一步试验超声时间的水平。

2.1.2 NaCl浓度对黑胡椒精油得率的影响 由图2可知，在蒸馏过程中，随着溶液中NaCl浓度的增加，黑胡椒精油得率也在逐渐增加。当NaCl浓度为3%时，获得的黑胡椒精油得率最高。随着处理浓度加大，提取所得的黑胡椒精油得率逐渐下降。可能是由于无机盐可通过盐析促进水分与挥发性物质分离，无机盐浓度过高易使溶液有爆沸的趋势，从而造成黑胡椒中挥发物流失［18］。因此将进一步试验NaCl浓度的水平确定为0、3%、6%。

2.1.3 液料比对黑胡椒精油得率的影响 由图3可知，在液料比逐渐增大的情况下，精油得率的变化趋势是先增加后降低。当液料比为15∶1时，得率最高，达到1.56%。当液料比过小也就是黑胡椒粉末中去离子水过少时，粉末局部受热，挥发油难以释放，从而可能导致得率降低。当液料比逐渐增大时，渗透进细胞的水分也随之增加，细胞在压力作用下易破裂，使黑胡椒精油得率有所上升。但当液料比过大时，精油在水中的溶解度变大，导致部分精油损失在介质中，而且液面过厚可能影响超声波的吸收。因此，确定进一步试验液料比的水平为10∶1、15∶1、20∶1。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面优化试验结果 基于单因素试验，以超声时间（A）、NaCl浓度（B）、液料比（C）3个因素作为自变量，以黑胡椒精油得率（Y）为响应值，设计三因素三水平响应面试验，各组试验结果如表2所示。

2.2.2 响应面回归模型的建立与分析 通过Design Expert 10.0.1软件对表2数据进行分析拟合，得到黑胡椒精油得率（Y）关于超声时间（A）、NaCl浓度（B）和液料比（C）的二次回归方程为：

Y=0.73+8.00×10-3A+0.11B+0.09C-4.44×10-4AB+6.67×10-5AC-3.50×10-3BC-2.94×10-5A2-8.75×10-3B2-2.35×10-3C2。

由方差分析（表3）可得，P=0.003 4<0.01，说明该回归模型极显著，且失拟项P=0.055 6>0.05不显著，表明该模型可用于预测黑胡椒精油提取情况。回归方程中极显著项有一次项液料比（C）及二次项A2、B2和C2；交互项BC也是显著的，这些都说明响应面优化法中所选择的3个因素对黑胡椒精油得率均有一定影响。3个因素对提取的黑胡椒精油得率的影响显著程度排序为液料比（C） > 超声时间（A） > NaCl浓度（B）。

2.2.3 响应面自变量间交互作用分析 利用Origin 2018软件将试验结果绘制响应面，评价所拟合的响应面形状。超声时间（A）、NaCl浓度（B）和液料比（C）三者交互作用对响应值黑胡椒精油提取得率Y的影响可从各响应曲面图（图4）直观看出。因子AC和BC的交互作用曲线陡峭，且可以明显找出图像中对应的最优区域，表明NaCl浓度与液料比（图4b）的交互作用对最终精油得率的影响最显著，超声时间与液料比（图4a）、超声时间与NaCl浓度（图4c）间交互作用对黑胡椒精油得率影响较小。

2.2.4 最佳工艺的确定及验证 经Design Expert软件分析预测，最佳提取条件为超声时间12.738 min、NaCl浓度2.394%和液料比17.188∶1，该条件下黑胡椒精油提取得率达1.89%。考虑到实际操作的便捷性，将优化后的参数修正为超声时间13 min、NaCl浓度2.4%和液料比17∶1。根据改进的试验条件提取精油来验证，实际得到的黑胡椒精油得率为1.79%，与理论结果的相对误差为5.29%，与回归模型基本一致。通过对比试验（表4）发现，基于超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏的精油得率较水蒸气蒸馏法有明显提高。与之类似的还有，利用超声波-微波协同辅助萃取白胡椒精油，得率为3.80%，显著高于水蒸气蒸馏法所得（3.10%）［13］。利用超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏法提取葛缕子（Carum carvi L.）精油，可将得率提高1.24%［26］。

表4 不同提取方法对精油得率的影响

[提取方法        精油得率//%   水蒸气蒸馏     1.28±0.03       超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏        1.79±0.09       ]

2.3 黑胡椒精油的抗氧化活性分析

对使用本方法提取获得的黑胡椒精油进行抗氧化活性分析（图5），结果表明，提取物对DPPH自由基和ABTS自由基都具有一定的清除能力。随着黑胡椒精油浓度的增加，DPPH及ABTS自由基清除率均逐渐上升，黑胡椒精油对ABTS自由基有非常显著的清除效果，在2.50 mg/mL时清除率已超过50%，未稀释的黑胡椒精油原液对ABTS自由基的清除能力可与维生素C相当，但对DPPH自由基的清除能力较低。

2.4 黑胡椒精油的抑菌能力分析

抑菌能力结果（图6）表明，黑胡椒精油对金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌的抑菌圈直径分别为14.7 mm和11.5 mm，均表现出中度敏感。

黑胡椒精油对金黄色葡萄球菌和青枯假单胞菌的最小抑菌浓度分别为1.562 5、12.500 0 μg/mL。抑菌圈和最小抑菌浓度测定结果均表明，黑胡椒精油对不同菌种具有不同的抑菌活性。与青枯假单胞菌相比，在相同条件下黑胡椒精油对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。

3 小结

本研究经单因素试验和响应面分析，建立了一种超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏法提取黑胡椒精油的方法，主要结论如下。

1）经响应面优化分析，基于超声波-盐析辅助水蒸气蒸馏法，黑胡椒精油的最佳提取条件为液料比17∶1、超声时间13 min、NaCl浓度2.4%，此时黑胡椒精油的得率为1.79%，比水蒸气蒸馏法提高了0.51个百分点。

2）黑胡椒精油对DPPH和ABTS均具有清除能力，对ABTS自由基清除效果十分显著，在2.50 mg/mL时清除率已超过50%，对ABTS的清除能力远强于对DPPH的清除能力。

3）黑胡椒精油对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（青枯假单胞菌）均有一定的抑菌效果，抑菌圈直径分别为14.7 mm和11.5 mm，表现出中度敏感。

本研究为黑胡椒提取精油提供了新的研究思路，同时也为全面开发利用黑胡椒相关产品提供了研究依据。

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