连翘总黄酮提取工艺优化及抗炎活性研究

2024-06-25延永靳颜颜张亦琳程敏周伟

湖北农业科学 2024年5期

延永靳颜颜张亦琳程敏周伟

收稿日期：2023-09-13

基金项目：陕西省重点研发项目（2024NC-YBXM-065）；陕西省教育厅2023年度服务地方专项科学研究计划项目（产业化培育项目23JC026）；商洛市科技计划项目（2022-Z0019）；陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院2022年度开放基金项目（23HKY033）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（S202311396049）

作者简介：延永（1988-），男，陕西绥德人，讲师，硕士，主要从事功能植物分子开发利用研究，（电话）0914-2363187（电子信箱）yananan@yeah.net；通信作者，程敏（1978-），女，陕西商洛人，教授，博士，主要从事中药制剂与药效学相关研究，（电话）0914-2363187（电子信箱）exitxiaobai@163.com。

延永，靳颜颜，张亦琳，等. 连翘总黄酮提取工艺优化及抗炎活性研究［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：156-161．

摘要：通过单因素试验和响应面试验设计，评价浸泡时间、料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间对连翘（Forsythia suspensa）总黄酮提取率的影响，建立数学模型，得出二次回归方程，预测连翘总黄酮提取的最佳工艺条件，并对新工艺提取的连翘总黄酮进行小鼠耳廓急性炎症肿胀抑制效果评价，测试连翘总黄酮提取物的抗炎活性。结果表明，最佳工艺条件为料液比1∶20、浸泡时间30 min、提取温度58 ℃、乙醇浓度60%、提取时间79 min。经验证，新工艺的平均提取率为14.54%。新工艺提取的连翘总黄酮提取液处理二甲苯急性致炎的小鼠耳廓的肿胀值为（15.61±2.73）mg，低于生理盐水处理后的肿胀值（17.21±2.65）mg，体外抗炎试验表明连翘总黄酮提取物可抑制小白鼠耳廓的炎症肿胀。引入浸泡环节的连翘总黄酮提取工艺具有提取率较高、稳定可靠的特点，新工艺提取的连翘总黄酮具有一定的抗炎效果。

关键词：连翘（Forsythia suspensa）；总黄酮；提取工艺；抗炎

中图分类号：R284.2 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0156-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.028 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on optimization of extraction process and anti-inflammatory activity of total flavonoids from Forsythia suspensa

YAN Yong1，JIN Yan-yan1，ZHANG Yi-lin1，CHENG Min1，2，ZHOU Wei3

（1.School of Biomedicine and Food Engineering， Shangluo University， Shangluo 726000， Shaanxi， China；2.Shaanxi Qinling Characteristic Biological Resources Industry Technology Research Institute， Shangluo 726000， Shaanxi， China；3.Shaanxi Xiangju Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Shangluo 726000， Shaanxi， China）

Abstract： The effects of soaking time， solid-liquid ratio， ethanol concentration， extraction temperature and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Forsythia suspensa were evaluated by single factor experiment and response surface experiment design， and a mathematical model was built， which could be used for calculating the quadratic regression equation and predicting the optimal process of extracting total flavonoids from Forsythia suspensa. The inhibition effect of acute inflammatory swelling of mouse auricle with the total flavonoids of Forsythia suspensa extracted by the new process was evaluated， and the anti-inflammatory activity of the total flavonoids of Forsythia suspensa was tested. The results showed that the optimal process condition was solid-liquid ratio of 1∶20， soaking time of 30 min， extraction temperature of 58 ℃， ethanol concentration of 60%， and extraction time of 79 min. It had been verified that the average extraction rate of the new process was 14.54%. The total flavonoids extract of Forsythia suspensa extracted by the new process had a swelling value of （15.61±2.73） mg of the mouse auricle treated with xylene acute to inflammation， which was lower than the swelling value （17.21±2.65） mg after normal saline treatment. The anti-inflammatory in vitro showed that the extract of total flavonoids from Forsythia suspensa could inhibit inflammatory swelling of the mouse auricle. The extraction process of total flavonoids from Forsythia suspensa with the introduction of soaking process had the characteristics of high extraction rate， stability and reliability， and the Forsythia suspensa total flavonoids extracted by the new process had anti-inflammatory effects.

Key words： Forsythia suspensa； total flavonoids； extraction process； anti-inflammatory

连翘（Forsythia suspensa）是木樨科连翘属植物，是国家三级药用价值保护植物，果实可入药，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种生物活性［1-3］，临床上常用作清热去火、退肿消结的药物［4］，在护肤品［5］和食品产业［6，7］中也有应用价值。连翘中富含黄酮类、生物碱类、挥发油类等物质［8］，其中，黄酮类化合物是连翘具备独特生物活性的重要物质。目前，从连翘叶中提取黄酮的方式有超声波辅助提取［9，10］、微波加热辅助提取［11］、超临界流体提取［12］、纤维素酶提取［13］等，由于这些方法对设备要求高，提取规模不易过大，导致应用范围相对有限。溶剂加热提取法具有工艺简便、设备要求不高和放大规模稳定的优势，在工业生产中应用广泛［14］。常用的溶剂有醇、醚、水等，文献报道，乙醇与水的混合溶剂在提取植物中黄酮类化合物时具有较好的效果［15］。但在常规提取工艺中，较少考虑溶剂浸泡对总黄酮溶出的影响，实际上溶剂浸泡对总黄酮的提取有较大的影响［10］。因此，研究包含溶剂浸泡且高效、稳定的连翘总黄酮提取工艺具有重要的意义。

本研究在连翘总黄酮的传统提取工艺基础上，增加溶剂浸泡环节，将溶剂浸泡时间与提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比5个因素纳入工艺优化过程，通过单因素试验和响应面试验优化，希望开发出连翘总黄酮提取的新工艺，有效提升连翘总黄酮提取效率，为研究连翘黄酮提取工艺提供了全新的着力点。并对新工艺提取的连翘总黄酮进行小鼠耳廓急性炎症肿胀抑制的体外抗炎研究，测试连翘总黄酮提取物的抗炎活性，为促进连翘总黄酮开发与利用提供理论基础，丰富了连翘总黄酮提取物的应用范围。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

连翘，采摘于商洛市洛南县，经商洛学院生物医药与食品工程学院张亦琳副教授鉴定为连翘Hypericum perforatum Linn.的成熟果实；芦丁，中国药品生物制品检定所；无水乙醇（AR），天津市大茂化学试剂厂；NaOH（AR）、Al（NO3）3（AR）、NaNO2（AR），天津市科密欧化学试剂有限公司；阿司匹林（国药准字H63020201），青海制药厂有限公司。

1.2 试验仪器

HK-02A型粉碎机，广州旭朗机械设备有限公司；HH-6型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；UV-755B型紫外可见分光光度计，上海分析仪器总厂。

1.3 试验方法

1.3.1 连翘总黄酮提取连翘晾晒后，置于65 ℃的恒温干燥箱中烘干，粉碎，过60目筛。称取2.0 g连翘细粉于250 mL圆底烧瓶中，加入设定体积的设定浓度的乙醇溶液，在室温下浸泡设定的时间后，将体系置于设定温度条件下提取一定时间，冷却后，将体系转移至离心管，3 000 r/min离心10 min，所得上清液为连翘总黄酮提取原液。

1.3.2 芦丁标准曲线绘制芦丁标准曲线绘制方法参考文献［16］。

1.3.3 总黄酮提取率测定提取液中总黄酮提取率的测定方法参考文献［16］。

1.3.4 连翘总黄酮提取单因素试验基础工艺条件：称取2.0 g连翘细粉（过60目筛）于250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL 60%乙醇溶液室温浸泡30 min，在60 ℃条件下提取90 min，冷却后，将体系转移至离心管，3 000 r/min离心10 min，所得上清液为连翘总黄酮提取液。

单因素工艺条件：将基础工艺条件中的浸泡时间分别调整为0、15、30、45、60 min，考察浸泡时间对总黄酮提取率的影响。调整乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇浓度对连翘总黄酮提取率的影响。调整连翘提取的料液比为1∶15、 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，考察料液比对连翘总黄酮提取率的影响。调整提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃，考察提取温度对连翘总黄酮提取率的影响。调整提取时间分别为70、80、90、100、110 min，考察提取时间对连翘总黄酮提取率的影响。

1.3.5 连翘总黄酮提取的响应面试验设计优化采用Design expert8.0.6软件中的Box-Behnken设计方案，将提取温度（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）3个因素纳入响应面试验设计进行优化，以总黄酮提取率（Y）为响应值，建立数学模型，预测连翘总黄酮的最优提取工艺条件。其响应面试验设计的因素和水平如表1所示。

1.3.6 验证试验以响应面试验设计得出的连翘总黄酮提取工艺为验证对象，平行试验3次，计算平均值，检查响应面试验优化结果的准确性、稳定性。

1.3.7 连翘总黄酮提取率抗炎作用研究试验参考文献［17］，选取体重19～22 g的健康白鼠15只，随机分成3组，每组5只。每只动物右耳廓内外两面均匀涂抹二甲苯0.1 mL致炎0.5 h，左耳不加处理，各组每只动物右耳廓内外两面分别均匀涂抹0.1 mL各组受试物样品（生理盐水组、连翘提取物组、阿司匹林组）。给予受试物1 h后，小白鼠颈椎脱臼处死，剪下两耳廓，用生理盐水洗去右耳廓受试物样品，擦净，重叠两耳廓，用内径8 mm的打孔器在同一部位凿取两圆耳片，分别称重，计算肿胀值（右耳片与左耳片的重量差）。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

测量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL芦丁对照品的吸光度，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线（图1），模拟回归方程为y=1.525x-0.082，R2=0.998 3。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 浸泡时间对连翘总黄酮提取率的影响由图2可知，增加溶剂浸泡环节，总黄酮的提取率有明显的提升，表明增加溶剂浸泡有利于连翘总黄酮溶出，当浸泡时间达30 min时，连翘总黄酮的提取率达到最大，继续增加浸泡时间对总黄酮提取率增加的影响不大，因此，选择浸泡时间为30 min作为响应面的提取工艺条件，不进行响应面分析。

2.2.2 乙醇浓度对连翘总黄酮提取率的影响由图3可知，乙醇浓度由40%提高至60%时，连翘总黄酮提取率也相应提高，但涨幅不大，乙醇浓度提高至60%时，连翘总黄酮提取率最高，达13.60%。继续提高乙醇的浓度，连翘总黄酮得率出现降低趋势，同时提取液色泽变深。其原因可能为乙醇浓度升高使溶液极性相对降低，有利于极性较低的物质溶出，不利于连翘总黄酮提取。根据连翘总黄酮提取率的高低选择乙醇浓度为50%、60%、70%进行响应面试验优化。

2.2.3 料液比对连翘总黄酮提取率的影响由图4可知，料液比从1∶15到1∶20时，总黄酮的提取率有明显的上升，继续增大溶剂体积，总黄酮的提取率变化不大。因此，选择1∶20作为响应面的提取工艺条件，不进行响应面试验分析。

2.2.4 提取温度对连翘总黄酮提取率的影响由图5可知，当提取温度为40 ℃时，提取率为11.39%，随着提取温度升高，连翘总黄酮提取率也逐渐增加，可能的原因是温度升高使分子运动更加剧烈，分子扩散加强有利于黄酮类分子的溶出。当提取温度达60 ℃时，提取率达13.87%。继续增加提取温度，连翘总黄酮提取率反而降低，可能是由于温度过高使连翘总黄酮结构发生变化，同时更多的其他物质溶出速率增加，使总黄酮的提取率相对降低。根据连翘总黄酮的提取率高低选择提取温度为50、60、70 ℃进行响应面试验优化。

2.2.5 提取时间对连翘总黄酮提取率的影响由图6可知，当提取时间由70 min增大到80 min时，连翘总黄酮提取率提高至13.81%，继续延长提取时间，连翘总黄酮的提取率逐渐降低，可能是长时间较高温度的煎煮不利于总黄酮在体系中存在。根据连翘总黄酮的提取率高低选择提取时间为70、80、90 min进行响应面试验优化。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 响应面试验设计及试验结果响应面试验设计方案与试验结果如表2所示。利用该试验设计模拟出数学模型，可得出如下回归方程：总黄酮的提取率（Y）= -189.022 5 + 1.900 3A + 2.242 0B + 2.062 1C-0.010 0AB+0.000 8AC-0.003 9BC-0.011 8A2-0.011 3 B2-0.011 8C2。

利用该模型对连翘总黄酮的提取工艺条件进行预测，得出连翘总黄酮的提取工艺为提取温度57.87 ℃、乙醇浓度59.94%、提取时间79.03 min，该工艺预计连翘总黄酮的提取率可达14.74%。

2.3.2 响应面试验方差分析由表3可知，响应面模型显著（P<0.000 1），且通过P值可知变量A、B、AB、BC、A2、B2、C2对连翘总黄酮提取的影响非常显著，说明试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的影响，交互作用对连翘总黄酮的提取影响也比较大。失拟项P=0.241 3>0.05，说明该模型拟合程度良好，CV=1.57%，说明试验精度良好。变量A、B、C的F值分别为48.34、13.51、8.79，通过比较各因素的F值的大小，判断出连翘中总黄酮提取率影响最大的因素为提取温度（A），其次是乙醇浓度（B），影响最小的为提取时间（C）。

2.3.3 响应面交互作用分析图7是各因素交互作用对连翘总黄酮提取率影响的响应面图。响应面上曲面倾斜程度越大，说明对应因素对连翘总黄酮提取的影响越大，在所选择的因素中，提取温度（A）对应的坡度最大，乙醇浓度（B）次之。响应面在底部的投影是该响应面相应的等高线，椭圆的线间疏密程度反映两个变量之间的交互作用程度，椭圆形和线间的距离越密集，表示二者直接的交互作用越强，椭圆形和线间的距离越疏松，则表示二者直接的交互作用微弱。由图7可知，提取温度（A）、乙醇浓度（B）和提取时间（C）三者之间均有交互作用，与方差分析结论一致。

2.4 验证试验

为了便于操作，将模拟模型给出的最佳提取工艺调整为提取温度58 ℃、乙醇浓度60%、提取时间79 min。平行3次验证试验的连翘总黄酮的提取率分别为14.65%、14.22%、14.75%，平均值为14.54%，与预测值基本一致。这说明该模型预测的工艺比较稳定、可靠，可作为连翘总黄酮提取的工艺。

2.5 体外抗炎作用试验结果

如表4所示，生理盐水处理组小鼠耳廓肿胀平均值为（17.21±2.65）mg，阿司匹林处理组的小鼠耳廓肿胀平均值为（10.21±3.68）mg，连翘总黄酮提取液处理组的小鼠耳廓肿胀平均值为（15.61±2.73）mg。试验表明，连翘总黄酮提取液处理组能使小白鼠急性炎症肿胀耳廓重量减轻，说明连翘提取物可抑制小白鼠耳廓的炎症肿胀，具有一定的抗炎效果，但与阿司匹林相比，效果上的差距比较明显。

3 讨论与结论

连翘是应用广泛的资源药用植物，通常以煎煮提取有效成分用于临床，中药的提取环节是非常复杂的过程，好的工艺能有效提高中药制剂的质量水平，利于药效的发挥。本研究在传统的溶剂加热提取工艺基础上，增加溶剂浸泡环节，单因素试验和响应面试验证明溶剂浸泡有利于连翘总黄酮的提取，并预测出连翘总黄酮提取的最佳工艺条件为料液比1∶20、浸泡时间30 min、提取温度58 ℃、乙醇浓度60%、提取时间79 min。经验证，新工艺总黄酮的平均提取率为14.54%，具有提取率较高、稳定可靠的特点。体外抗炎试验表明，连翘提取物可抑制小白鼠耳廓的炎症肿胀，具有一定的抗炎效果，采用连翘总黄酮提取液处理二甲苯急性致炎的小鼠耳廓的肿胀值为（15.61±2.73）mg，低于生理盐水处理后的肿胀值（17.21±2.65）mg。连翘总黄酮提取的新工艺及体外抗炎试验为连翘的开发和利用开辟了新的研究路径，为促进连翘标准制定提供了理论和技术支持，对推动中药现代化进程具有重要意义。

市售的连翘均为经过晾晒和干燥后的干药材，黄酮以结晶、无定型沉淀形式存在于药物细胞内［18］。而直接煎煮会使药材表面所含的蛋白质凝固［19］，不利于黄酮类化合物的渗出，导致提取率低。在提取前先进行溶剂浸泡，药材会变得膨胀疏松，有利于药物细胞内有效成分的溶出［20，21］。本研究对连翘总黄酮的提取工艺进行了优化，由单因素试验结果可以看出，增加溶剂的浸泡环节，促进了总黄酮的溶出，但对溶剂浸泡影响提取效率的因素研究还不够深入，如浸泡过程中体系温度、搅拌速度、溶剂用量等因素对提取的影响。在后续的研究工作中，可以将溶剂浸泡作为提取工艺优化的关键环节进行筛选。

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