基于瘦素介导的PI3K/AKT通路探讨二甲双胍对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤的作用机制

李彩艳 王东枝 张冰 苏学勇 王东姝

摘要 目的： 探究二甲双胍对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤的作用及其对瘦素介导的磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路的影响。 方法： 无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠85只，随机选取12只作为假手术组，其余73只进行模型制备，其中1只造模失败，剩余72只随机分为模型组、瘦素组、瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍组、二甲双胍＋瘦素组、二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组，每组12只。测定大鼠动脉血氧分压（PaO 2），计算氧合指数（OI）；测定各组大鼠血清瘦素、支气管肺泡灌洗液肿瘤坏死因子.α（TNF.α）、白细胞介素.1β（IL.1β）、C反应蛋白（CRP）水平；计算大鼠右肺湿质量/干质量；观察大鼠左肺组织病理；测定肺组织PI3K/AKT通路蛋白水平。 结果：  与假手术组比较，模型组大鼠肺部损伤加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、 CRP水平，右肺湿质量/干质量，大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）。与模型组比较，瘦素组大鼠 肺部损伤加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺湿质量/干质量，大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT 升高（ P ＜0.05）；二甲双胍组大鼠肺部损伤减轻，PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺湿质量/干质量，大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）。与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋瘦素组大鼠肺部 损伤减轻，PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺湿质量/干质量，大鼠 肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）。与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠肺部损伤加重，PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05），血清瘦素、TNF.α、IL.1β、CRP水平，右肺湿质量/干质量，大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）。 结论： 二甲双胍对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤有保护作用，可能是通过抑制瘦素介导的PI3K/AKT通路实现的。

关键词  脑卒中相关性肺炎；肺损伤；瘦素；二甲双胍；磷脂酰肌醇3.激酶/蛋白激酶B通路

doi：  10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.011

Effect of Metformin on Lung Injury in Rats with Stroke.related Pneumonia Based on Leptin.mediated PI3K/AKT Pathway

LI Caiyan， WANG Dongzhi， ZHANG Bing， SU Xueyong， WANG Dongshu

Second People′s Hospital of Hengshui City， Hengshui 053000， Hebei， China， E.mail： ldjckw@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of metformin on lung injury in rats with stroke.related pneumonia and its effect on leptin.mediated phosphatidylinositol 3.kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT） pathway.  Methods： A total of 85 male SD rats without specific pathogen（SPF） were randomly divided into sham operation group，model group，leptin group，leptin＋PI3K/AKT inhibitor group，metformin group，metformin＋leptin group，metformin＋PI3K/AKT activator group，with 12 rats in each group，and 1 rat failed to be modeled.Arterial partial oxygen pressure（PaO 2） was measured and oxygenation index（OI） was calculated.The levels of serum leptin，tumor necrosis factor.α（TNF.α），interleukin.1β（IL.1β） and C.reactive protein（CRP） in bronchoalveolar lavage fluid were determined in each group.The wet/dry mass of the right lung was calculated.The left lung tissue pathology was observed.PI3K/AKT pathway protein levels were determined in lung tissue.  Results： Compared with sham operation group，the lung injury of model group aggravated，the levels of PaO 2 and OI decreased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet/dry mass of right lung，the p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT of lung tissue increased（ P ＜0.05）.Compared with model group，the lung injury of rats in leptin group were aggravated，the levels of PaO 2 and OI decreased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet mass/dry mass of right lung，the p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT in lung tissue of rats increased（ P ＜0.05）.Compared with leptin group，the lung injury of rats in leptin＋PI3K/AKT inhibitor group and metformin＋leptin group reduced，the levels of PaO 2 and OI increased（ P ＜0.05），the levels of serum leptin，TNF.α，IL.1β，and CRP，the wet/dry mass of right lung decreased，p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT decreased in lung tissue of rats（ P ＜0.05）.Compared with metformin group，metformin＋PI3K/AKT activator group increased lung injury，PaO 2 and OI levels decreased（ P ＜0.05），serum leptin，TNF.α，IL.1β and CRP levels，wet/dry mass of right lung，p.PI3K/PI3K and p.AKT/AKT increased in lung tissue of rats（ P ＜0.05）.  Conclusion： Metformin has a protective effect on lung injury in rats with stroke.related pneumonia，which may be achieved by inhibiting leptin.mediated PI3K/AKT pathway.

Keywords  stroke.related pneumonia; lung injury;  leptin; metformin; phosphatidylinositol 3.kinase/protein kinase B pathway

脑卒中相关性肺炎的发生是脑卒中病人预后不良的重要因素，增加脑卒中的治疗难度，加重病人及家庭的经济负担，且病人极难通过治疗受益。因此，探寻治疗有效药物对保护病人肺功能、神经功能成为研究热点  ［1］ 。瘦素是由脂肪组织分泌的激素，可参与内分泌调节、创伤修复、免疫调节  ［2.3］ 。刘志敏等  ［4］ 研究显示，慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期病人血清瘦素水平与病人肺功能、营养状况密切相关；李俊等  ［5］ 研究显示，瘦素在肥胖成年人哮喘发病中发挥作用；瘦素可激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路 在儿童变应性鼻炎中发挥免疫调节作用  ［6］ ，且PI3K/AKT 通路在肺炎的发病机制中至关重要  ［7］ 。二甲双胍是治疗2型糖尿病的常用药物，对脑卒中具有一定的保护作用  ［8］ ，且二甲双胍可治疗2型糖尿病并发肺炎，可有效降低血清炎性因子水平，减轻氧化应激反应，缩短肺炎持续时间，降低重症转化率  ［9］ 。此外，二甲双胍对矽肺大鼠肺炎与肺纤维化均有干预作用  ［10］ ，可降低重症新型冠状病毒肺炎病死率  ［11］ 。本研究将基于瘦素介导的PI3K/AKT通路展开二甲双胍对脑卒中相关性肺炎肺损伤作用的研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠85只，体质量200～260 g，购于吉林大学，许可号：SYXK（吉）2021.0003）。外源性重组瘦素

购自美国sigma公司；LY294002（S1105）、740 Y.P（S7865）购自selleck公 司；血清瘦素、肿瘤坏死因子.α（TNF.α）、白细胞介素.1β （IL.1β）、C反应蛋白（CRP）酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒购自上海酶联生物；苏木精.伊红（HE）染 色试剂盒购自上海碧云天公司；磷酸化的PI3K  （p.PI3K）、PI3K、磷酸化的AKT（p.AKT）、AKT、甘油醛.3. 磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、羊抗兔二抗均购自abcam公司。血气分析仪（Premier3500）购自上海玉研科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠造模及分组

取73只SD大鼠进行脑卒中相关性肺炎模型制备。首先使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定，颈中线开1 cm切口，分离颈总动脉，用棉线制备1 cm颈总动脉线环，将切口缝合，将大鼠移至立体定位仪，俯卧位沿枕骨下背中造1 cm切口，在大鼠第1颈椎横突翼小孔插入注射器针头，损伤椎动脉（至鲜血溢出），止血，缝合切口，术后注射青霉素防感染。24 h后在颈部缺口处再次打开，夹闭双侧颈动脉，15 min后打开恢复血流。另选取12只大鼠仅暴露颈椎与总颈动脉，作为假手术组。造模成功标志为造模48 h后大鼠进食减少，眼球浑浊，呼吸不畅，可见肺杂音  ［12］ 。造模成功大鼠72只，造模成功率为98.63%（72/73）。将成功造模大鼠随机分为模型组、瘦素组、瘦素＋PI3K/AKT 抑制剂组、二甲双胍组、二甲双胍＋瘦素组、二甲双胍＋ PI3K/AKT激活剂组。瘦素组大鼠给予50 μg/kg外源性重组瘦素腹腔注射  ［13］ ；瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组大鼠除给予50 μg/kg外源性重组瘦素腹腔注射外，尾静脉注射0.3 mg/kg的LY294002  ［14］ ；二甲双胍组大鼠给予400 mg/kg二甲双胍灌胃  ［10］ ；二甲双胍＋瘦素组大鼠给予400 mg/kg二甲双胍灌胃，50 μg/kg外源性重组瘦素腹腔注射；二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠给予400 mg/kg二甲双胍灌胃，50 mg/kg 740 Y.P尾静脉注射  ［15］ ；模型组与假手术组给予等量生理盐水灌胃。

1.2.2 大鼠动脉血氧分压（PaO 2）测定

采集大鼠右侧股动脉血2 mL，血气分析仪分析大PaO 2，计算氧合指数（OI）。

1.2.3 ELISA法检测大鼠血清瘦素水平

采集大鼠股静脉血1 mL，离心后获得上清液，通过ELISA试剂盒检测大鼠血清瘦素水平。

1.2.4 ELISA法测定支气管肺泡灌洗液炎性因子水平

末次给药后，对所有大鼠左肺行支气管肺泡灌洗，共洗涤5次，收集肺泡灌洗液，3 000 r/min离心15 min，获得上清液，通过试剂盒检测TNF.α、IL.1β、CRP水平。

1.2.5 大鼠肺组织湿质量/干质量

处死大鼠，取右肺下叶滤纸擦拭至表面干燥，称重，视为湿质量；烘干后再次称质量，视为干质量，计算大鼠右肺湿质量/干质量比值。

1.2.6 HE染色观测大鼠肺组织病理改变

取大鼠左肺，分为两部分，一部分常规制备肺部石蜡切片，通过HE试剂盒进行染色，封片后显微镜下观察各组大鼠肺组织病理变化；另一部分进行蛋白免疫印迹（Western Blot）实验。

1.2.7 Western Blot法测定肺组织PI3K/AKT通路蛋白水平

取大鼠部分肺部组织，匀浆，12 000 r/min离心15 min，取上清液，经十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS.PAGE）电泳，将一定量蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，封闭，加一抗p.PI3K（1：1 000）、PI3K（1∶1 000）、p.AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、 GAPDH（内参，1∶5 000），孵育过夜，加入二抗（1∶5 000）， 电化学发光试剂（ECL）显色液显色，分析p.PI3K、PI3K、p.AKT、AKT蛋白表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（ x  ± s ）表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK. q 检验。以 P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察

假手术组大鼠皮毛水滑，精神状态较好，饮水、饮食正常，体质量增长正常，有活力；模型组大鼠皮毛干枯灰色，眼睛浑浊，进食减少，饮水增多，口鼻眼分泌物增多，呼吸频率高，出现肺啰音；瘦素组大鼠较模型组症状更为明显；瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组较瘦素组症状缓解；二甲双胍组较模型组症状改善；二甲双胍＋瘦素组较瘦素组症状改善；二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组较二甲双胍组症状改善显著。

2.2 各组大鼠PaO 2、OI比较

与假手术组比较，模型组大鼠PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05）；与模型组比较，瘦素组大鼠PaO 2、OI水平降低，二甲双胍组大鼠PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05）； 与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋ 瘦素组大鼠PaO 2、OI水平升高（ P ＜0.05）；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠PaO 2、OI水平降低（ P ＜0.05）。详见表1。

2.3 各组大鼠血清瘦素比较

与假手术组比较，模型组大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，瘦素组大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05），二甲双胍组大鼠血清瘦素降低（ P ＜0.05）；与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋瘦素组大鼠血清瘦素降低（ P ＜0.05）；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠血清瘦素升高（ P ＜0.05）。详见表2。

2.4 各组大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平比较

与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，瘦素组大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平升高（ P ＜0.05），二甲双 胍组大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP水平降低（ P ＜0.05）； 与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋瘦素组大鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP降低（ P ＜0.05）；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大 鼠血清TNF.α、IL.1β、CRP升高（ P ＜0.05）。详见表3。 2.5 各组大鼠右肺湿质量/干质量比较

与假手术组比较，模型组大鼠右肺湿质量/干质量升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，瘦素组大鼠右肺湿质量/干质量升高（ P ＜0.05），二甲双胍组大鼠右肺湿质量/干质量降低（ P ＜0.05）；与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋瘦素组大鼠右肺湿质量/干质量降低（ P ＜0.05）；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠右肺湿质量/干质量升高（ P ＜0.05）。详见表4。

2.6 各组大鼠肺组织病理

假手术组大鼠肺部切片肺泡结构完整，排列整齐，无炎性细胞浸润；模型组大鼠肺组织切片有血管扩张，肺泡腔内有炎性细胞浸润，肺泡壁变厚；与模型组比较，瘦素组大鼠肺组织肺泡腔更为狭窄，炎性细胞浸润更明显，二甲双胍组病理减轻；与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组、二甲双胍＋瘦素组大鼠肺部病理减轻；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组大鼠肺部病理加重。详见图1。

2.7 各组大鼠肺组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达

与假手术组比较，模型组大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、 p.AKT/AKT升高（ P ＜0.05）；与模型组比较，瘦 素组大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT升高（ P ＜  0.05），二甲双胍组大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT降低（ P ＜0.05）；与瘦素组比较，瘦素＋PI3K/AKT 抑制剂组、 二甲双胍＋瘦素组大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT  降低（ P ＜0.05）；与二甲双胍组比较，二甲双胍＋ PI3K/AKT 激活剂组大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT 升高（ P ＜0.05）。详见图2、表5。

（A为假手术组；B为模型组；C为瘦素组；D为瘦素＋PI3K/AKT抑制剂组；E为二甲双胍组；F为二甲双胍＋瘦素组；G为二甲双胍＋PI3K/AKT激活剂组）

3 讨 论

脑卒中相关性肺炎是指未行机械通气的脑卒中病人在发病7 d内出现的肺炎，此肺炎的出现与脑卒中病人机体功能障碍相关，肺炎的炎症反应会进一步加剧脑卒中后脑损伤，且会引发脓毒症等严重并发症，是造成脑卒中病人预后不良的重要原因，增加病人治疗难度，缩短病人生存期。因此，减轻肺损伤是治疗脑卒中相关性肺炎的重点。

本研究构建脑卒中相关性肺炎大鼠模型，造模48 h 后造模大鼠出现进食减少，眼球浑浊，呼吸不畅的现象，且可闻及肺杂音，表明大鼠出现明显肺部损伤，造模型成功；此外，HE染色证实大鼠肺组织血管扩张，肺泡腔内有炎性细胞浸润，肺泡壁变厚，PaO 2、OI水平降低，血清TNF.α、IL.1β、CRP升高，从多方面再次验证造模成功。瘦素在动物组织与血清中含量成正比，由脂肪组织产生，可作用于中枢神经细胞受体调控机体新陈代谢  ［16］ 。瘦素除在脂肪代谢中发挥调节作用外，也是一种应急类激素，出现感染后，瘦素应激性增加，感染期产生的TNF.α、IL.6等会刺激脂肪组织释放瘦素  ［17］ 。Rebello等  ［18］ 研究显示，肥胖人群新型冠状病毒肺部感染病人的高死亡率与循环瘦素介导的免疫有关；陶梅梅等  ［19］ 研究发现，老年细菌性肺炎病人血清瘦素与肺炎的严重程度相关。在本研究模型大鼠血清瘦素水平升高，提示瘦素与脑卒中相关性肺炎的发生 有关。瘦素可参与对PI3K/AKT通路的调控，而PI3K/AKT 激活在脑卒中相关性肺炎中发挥促进作用  ［20］ 。本研究瘦素处理模型大鼠后，发现大鼠肺部损伤、炎症水平进一步加重，且PI3K/AKT通路被激活，此作用可被PI3K/AKT抑制剂削弱，提示瘦素可介导PI3K/AKT通路活化，可加重脑卒中相关性肺炎的肺部损伤。

二甲双胍是常见的高效降糖药物，常应用在神经保护、抗炎症方面有应用  ［21］ 。研究显示，二甲双胍可降低2型糖尿病并发肺炎病人的乳酸和CRP水平  ［22］ ；二甲双胍可通过激活线粒体活性氧物，介导对军团菌肺炎的保护作用  ［23］ ；二甲双胍可降低矽肺大鼠肺纤维化  ［10］ 。二甲双胍在脑卒中相关性肺炎的肺损伤中是否发挥作用仍未可知。在本研究中，二甲双胍可降低模型大鼠肺组织p.PI3K/PI3K、p.AKT/AKT水平，抑制炎症反应，减轻肺损伤，提示二甲双胍在脑卒中相关性肺炎中发挥的作用可能与其他类型肺炎的作 用一致，均可减轻肺损伤，且其作用机制可能与PI3K/AKT 通路有关。为验证二甲双胍能否作用于PI3K/AKT通路发挥作用，本研究在二甲双胍基础上加入PI3K激活剂，发现激活剂可减轻二甲双胍加重的肺炎的肺保护 作用。此外，与瘦素激活的肺炎组比较，二甲双胍可减 轻瘦素加重的肺损伤情况，并可降低瘦素诱导的PI3K/AKT  激活。以上结果均提示二甲双胍对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤具有干预作用，且可能是通过抑制PI3K/AKT 通路实现的。

综上所述，二甲双胍可发挥对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤的保护作用，可能是通过抑制瘦素介导的PI3K/AKT通路实现的。但二甲双胍对脑卒中相关性肺炎大鼠肺损伤的保护作用，也可能涉及其他信号通路，尚需深入研究。

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（收稿日期：2022.05.17）

（本文编辑 邹丽）