糖尿病周围神经病变发病机制研究的新进展

胡炎森 汤 玮 邹俊杰 陈向芳

随着人们生活方式的改变和科学技术的发展,我国糖尿病的发病率显著增高[1],糖尿病病程的延长,可引发一系列大血管和微血管并发症,糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是最常见的慢性并发症之一,大约20%的1型糖尿病患者和20%的2型糖尿病患者在初次诊断后的20年内发生DPN[2]。糖尿病神经病变的患病率约为50%[3],而DPN患病率约为29%～49%[4],采用神经传导测定法诊断的DPN患病率为60%～75%[5]。DPN是一种对称性、长度依赖性的远端多发性神经病变,常表现为四肢末梢的麻木、疼痛和感觉丧失,其促进了糖尿病足的发生,严重者可进展为下肢坏疽而导致截肢[6]。DPN早期的临床表现常较隐匿,易被忽略,待临床明确诊断时,往往已处于不可逆阶段[7]。因此,明确DPN的发病机制对DPN的早期诊断及治疗尤为重要。DPN的发病机制与高糖参与的异常代谢密切相关,但更深入的发病机制尚不清楚。近年来,随着对DPN研究的不断深入,发现糖脂异常代谢引起的神经细胞受损、胰岛素介导的PI3K/蛋白激酶B(AKT)信号通路减弱、内质网应激诱导的神经细胞凋亡、施万细胞(Schwann cells, SC)的能量代谢受损、血糖波动介导的神经生长因子(nerve growth factor, NGF)-酪氨酸激酶A(TrkA)信号通路减弱,以及CD4+T细胞、小胶质细胞和巨噬细胞介导的神经细胞损伤在DPN的发生、发展中扮演重要角色。本文拟从这几个方面的研究进展进行综述。

1 糖脂异常代谢引起的神经细胞受损

1.1 晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGE)引发NF-κb、酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录活化子抑制剂(JAK/STAK)信号通路的激活 高糖环境下葡萄糖和蛋白质、脂质、核酸发生不可逆性非酶反应,形成AGE。晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycosylation end products,RAGE)在内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞中均有表达。Papachristou等[8]研究结果显示,糖尿病患者皮肤中AGE含量与DPN的严重程度呈正相关。 Juranek等[9]研究发现,AGE与RAGE相结合后,引发RAGE的细胞内结构域与细胞骨架调节蛋白(diaphanous related formin 1,DIAPH1)相结合,并激活NF-κb、JAK/STAK信号通路,增加IL-1β、IL-6和TNF表达,导致炎症反应、氧化应激反应发生,并通过增加半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3等凋亡信号的表达,诱导神经细胞凋亡[10]。DIAPH1参与肌动蛋白结构的修饰和微管蛋白动力的调节,神经系统中DIAPH1在肌动蛋白纤维形成、神经元的迁移及维持细胞骨架的正常功能中起着关键作用[11]。AGE-RAGE-DIAPH1信号通路的激活,诱发轴突炎症并影响轴突的运输功能,从而导致DPN的发生、发展。

1.2 甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)诱导的级联反应 MG是糖酵解途径的中间产物,是一种高活性的二羰基化合物,被视为AGE前体[12]。MG的代谢主要通过乙二醛酶系统,周围神经中乙二醛酶1的活性较低,故MG易在周围神经中积聚。Düll等[13]研究发现,将MG注射至健康受试者的神经纤维中,MG通过激活瞬时受体电位阳离子通道A1(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)诱发疼痛。MG激活TRPA1还可抑制胰岛β细胞的分泌,通过修饰胰岛素,降低微RNA(microRNA,miR)-190a和miR-214的表达,抑制PI3K/AKT信号通路,降低胰岛素的敏感性[14]。上述研究的结果均提示,通过注射MG可诱发疼痛,而未注射MG的无疼痛表现,表明高浓度MG是DPN发生的危险因素[15]。

1.3 脂质过氧化物激活的Toll样受体 (Toll-like receptor,TLR)-4信号通路 胰岛素促进脂肪细胞合成脂肪酸和α-磷酸甘油;胰岛素可通过抑制激素敏感性脂肪酶的活性,抑制脂肪分解。因此,糖尿病患者可引起脂肪代谢紊乱,脂肪分解加强、合成减弱,游离脂肪酸水平升高。

在高浓度长链脂肪酸中培养的SC会发生线粒体转运障碍和氧化应激,并导致SC凋亡[16]。Nowicki等[17]研究发现,游离脂质与活性氧自由基或过氧化物可反应生成脂质过氧化物,而脂质过氧化物对背根神经节和血管内皮细胞具有损伤作用,其机制可能与脂质过氧化物通过TLR-4激活下游通路有关。TLR是非特异性免疫系统中的模式识别受体,其被激活可引起免疫反应来阻止感染扩散,是机体抵御病原体的第一道防线。TLR-4主要存在于哺乳动物中,脂质过氧化物与TLR-4的结合可引起下游NF-κb、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的激活[18],进一步增加IL-1β、IL-6、IL-8、TNF表达,导致中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的募集诱发炎症反应,并增加Caspase-3等凋亡信号的表达[17]。Pang等[19]的研究结果显示,给予糖尿病大鼠静脉注射miR-214-3p,抑制了TLR-4激活,TNF和IL-1β表达减少,局部炎症反应减轻,神经细胞凋亡减少,改善了神经症状。上述研究结果表明,TLR-4信号通路的激活,通过增加局部炎症和诱导神经细胞凋亡进而诱发DPN。

2 胰岛素介导的PI3K/AKT信号通路减弱

胰岛素不仅具有降糖作用,还能促进机体生长和细胞增殖分裂。胰岛素的化学结构类似于胰岛素样生长因子1 (insulin like growth factors 1, IGF-1),通过激活PI3K/AKT、MAPK信号通路,激活下游分子和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表达,抑制促凋亡蛋白Bad表达,从而促进神经元轴突生长并维持正常感觉[20]。糖尿病患者胰岛素受体的数量及亲和力均下降,PI3K/AKT活化受阻,引起下游通路异常。SC表达胰岛素和IGF-1受体,这些受体的耗竭会引起SC和轴突受损,导致周围神经病变发生。胰岛素作用于神经细胞的机制还可能涉及线粒体,Aghanoori等[21]研究显示,与对照组(未注射胰岛素)相比,实验组糖尿病大鼠接受微量胰岛素注射,两组空腹血糖水平或HbA1c未改变,实验组大鼠热痛觉明显缓解,并减少了表皮下神经纤维的丢失,感觉神经元的线粒体复合物Ⅱ、Ⅳ及细胞色素C氧化酶的功能均得以恢复。Calcutt等[22]的研究结果提示,在足量胰岛素营养支持下,高血糖不足以诱发神经病变。上述研究结果表明,胰岛素介导PI3K/AKT信号通路下调,减弱了其营养支持作用,进而诱发DPN。

3 内质网应激诱导的神经细胞凋亡

内质网是细胞质内完成新生肽链折叠和组装、蛋白质加工及修饰等任务的细胞器。糖尿病患者存在内质网应激[23]而启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。UPR为对抗内质网应激,引起内质网上3个跨膜蛋白的激活,并激活以下3条传导通路:①激活蛋白激酶R样真核起始因子2A激酶(PKR-like eukaryotic initiation factor 2A kinase, PERK)-真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)-活化转录因子(activating transcription factor, ATF)4信号通路,具体为PERK的激活,引起eIF2α发生磷酸化,诱导ATF4的表达,抑制蛋白质的翻译;②激活肌醇需要酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α),剪切X-盒结合蛋白-1(X box-binding protein-1,XBP-1),促进内质网错误折叠蛋白的降解;③激活ATF6,引起内质网伴侣蛋白、XBP-1的表达。以上3条通路的激活,起到减少蛋白质合成、促进蛋白质降解、增强蛋白质折叠能力的作用,以缓解内质网应激反应[24]。

Yao等[25]研究结果显示,与对照组(未注射药物)相比,实验组DPN大鼠通过鞘内注射IRE1α-siRNA(IRE1α的抑制剂)至坐骨神经内,其表皮神经纤维密度较前增加了0.75倍,且感觉和运动神经传导速度明显增快;进一步分析发现,IRE1α-siRNA缓解内质网应激反应,并抑制JNK信号通路的激活和C/EBP同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)的表达,而JNK信号通路的激活可上调促凋亡基因Bax的表达,CHOP可下调抗凋亡基因 Bcl-2、上调促凋亡基因 Bax的表达,触发Caspase-3的激活,导致细胞凋亡。由此可见,IRE1α-siRNA通过缓解内质网应激反应,抑制JNK信号通路和CHOP的表达,从而下调神经细胞的凋亡信号,缓解DPN症状。ATF3是反映内质网应激的标志物。Kan等[26]研究结果显示,与DPN组小鼠相比,ATF3敲除的糖尿病小鼠表皮神经纤维密度虽减少,但未出现热过敏和机械过敏等表现,行超微结构检查发现ATF3敲除的糖尿病小鼠内质网应激水平显著低于DPN组;进一步分析结果显示,ATF3通过上调内质网应激水平,诱导小胶质细胞活化,导致TNFα和IL-6表达增加,引起神经系统的损伤。上述研究结果均提示,内质网应激可引起神经系统的损伤而诱发DPN。

4 SC的能量代谢受损

SC是包裹在周围神经轴突上的神经胶质细胞,其能表达神经营养因子,产生细胞外基质,具有维持神经元存活、修复受损神经元和营养轴突等重要功能。在DPN的发展过程中,SC扮演着重要作用。

Hao等[27]研究发现,在糖尿病小鼠模型中,受多元醇途径影响的SC中积累了大量山梨醇,减少了SC表面IGF-1的表达,引起SC去分化,并导致周围神经脱髓鞘,减慢神经传导速度。多元醇途径还可减少SC分泌的NGF、神经营养因子-3、睫状神经营养因子-19,导致对神经营养作用减弱,进一步引起神经纤维的损伤[28]。SC为轴突提供无氧氧化的产物,即SC主要通过无氧氧化的方式给自身提供能量,无氧氧化的产物即乳酸,输出到轴突为其提供能量[29]。高糖条件可使无氧氧化的产物过载,轴突内超负荷的乳酸导致酸中毒及线粒体功能障碍,进而增加活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的形成,并引起线粒体的损伤。SC还具有高度活跃的脂质代谢,高糖条件下体内脂肪酸β氧化增加,生成的脂酰辅酶A通过转换为脂酰肉碱而进入三羧酸循环。然而,在底物过载的情况下,脂酰辅酶A不能重新进入循环,无法进一步转化的脂酰肉碱在SC中积聚,并从SC穿梭至轴突,且过量的脂酰肉碱对神经纤维具有毒性。脂酰肉碱通过触发细胞外钙离子(Ca2+)进入轴突,细胞质内Ca2+进入线粒体,分别引起轴突线粒体转运障碍和诱导线粒体凋亡[30]。

由此表明,SC不止是轴突的绝缘体,更是维持轴突结构和功能的关键细胞,并为轴突提供所需的能量。糖尿病患者的SC与轴突之间的正常“生物能量交流”被破坏,从SC的去分化、分泌的NGF减少,到轴突中乳酸、脂酰肉碱的积聚,导致营养支持减弱、轴突pH值变化、线粒体凋亡,最终导致神经纤维的损伤,从而诱发DPN。

5 血糖波动介导的NGF-TrkA信号通路减弱

临床上常将HbA1c作为判断糖尿病患者血糖控制是否达标的标准指标,但 HbA1c并不能充分反映血糖控制情况。连续血糖监测可直观地观测到糖尿病患者的血糖达到目标范围时间(time in range,TIR)。TIR是指24 h内血糖为3.9～10.0 mmol/L范围内时间所占的比例,可作为评价短期血糖控制效果的关键指标[31]。

临床上一般认为,血糖水平剧烈波动较持续高血糖的危害更大。Yang等[32]研究结果显示,血糖水平剧烈波动的糖尿病大鼠的超氧化物歧化酶水平降低,丙二醛、IL-1β、IL-6、TNF水平增高,诱发神经元细胞氧化应激和炎症反应,引起周围神经损伤。Yan等[33]进一步研究发现,在体外细胞培养实验中血糖水平剧烈波动减少了神经细胞NGF的分泌,并降低TrkA水平,而NGF与TrkA的结合,可启动下游PI3K/AKT信号通路,促进神经元的存活信号,抑制凋亡信号,起到保护神经元的作用;此外,血糖水平剧烈波动减少了NGF分泌并降低TrkA水平,进而增加Bax和Caspase-3等凋亡信号的表达,诱导神经元损伤和细胞凋亡。Mayeda等[34]研究结果显示,TIR<70%组2型糖尿病患者的DPN发病率是TIR≥70%组的1.72倍,提示DPN的发病率与TIR呈负相关。Li等[35]研究中,根据TIR将糖尿病患者分为TIR低组(TIR≤53%)、TIR中间组(TIR为53%～77%)和TIR高组(TIR≥77%),TIR高组的神经传导速度及振幅均显著高于TIR低组及TIR中间组;提示TIR越高,周围神经功能越好。上述研究结果均表明,TIR独立于HbA1c,成为DPN发生、发展的危险因素。

6 CD4+T细胞、小胶质细胞和巨噬细胞介导的神经细胞损伤

在DPN的发生、发展过程中,免疫机制不容忽视。在高糖影响下,血-神经屏障遭到破坏,中枢神经系统的免疫耐受被打破,同时髓鞘蛋白糖基化后其抗原性发生改变,被单核-巨噬细胞和神经胶质细胞识别,引导机体产生抗体[36]。Janahi等[37]研究结果显示,DPN组的抗核抗体阳性率是对照组的50倍,进一步分析显示抗核抗体的存在与DPN的症状评分呈正相关。激活的免疫细胞分泌TNF-α,可引起神经纤维脱髓鞘,并刺激单核细胞和内皮细胞分泌炎症因子,引起神经损伤。Mu等[38]研究结果显示,DPN组患者血清TNF-α水平显著高于无DPN的糖尿病患者,TNF-α水平升高的糖尿病患者发生DPN的风险是正常TNF-α组患者的2.594倍。Wu等[39]研究结果显示,实验组DPN小鼠注射miR-590-3p(一种可抑制T细胞浸润的miRNA)后,与对照组(未注射miR-590-3pDPN)DPN小鼠相比,神经病理性疼痛得以缓解;进一步研究结果显示,miR-590-3p通过抑制CD4+T细胞在周围神经系统中浸润,减少CD4+T细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子,进而减轻CD4+T细胞对神经系统的损伤。Zhang等[40]研究结果显示,高糖还可激活小胶质细胞,产生ROX、一氧化氮、过氧亚硝酸盐、前列腺素等促炎细胞因子,参与DPN的神经病理性疼痛的发生。大鼠全身或脊髓注射氟胞嘧啶或米诺环素(一种胶质细胞抑制剂)后,可抑制其体内IL-1β和TNF-α的表达,并减轻热过敏和机械过敏反应。与此同时,高糖环境中巨噬细胞的极化发生改变,从 M1型到M2型极化下降[41],而M1型巨噬细胞可释放IL-1β、TNF-α等炎症因子,诱发SC损伤。Tian等[42]研究结果显示,糖尿病小鼠注射CU-CPT22(一种可诱导巨噬细胞向M2型极化的药物)后,神经性疼痛症状缓解,IL-1β、TNF-α水平较注射前降低。上述研究结果提示,淋巴细胞、小胶质细胞及巨噬细胞介导的免疫机制可能是DPN发生的重要因素。

综上所述,DPN主要由糖脂异常代谢引起,其代谢产物AGE、MG、脂质过氧化物激活的异常通路,诱导神经系统的氧化应激和炎症反应,导致神经细胞损伤。同时,胰岛素介导的营养支持作用减弱、内质网应激诱导的神经细胞凋亡、SC的能量代谢受损、血糖波动介导的NGF-TrkA信号通路减弱,以及CD4+T细胞、小胶质细胞和巨噬细胞介导的神经细胞损伤也参与DPN的发生和发展。从既往的动物模型及临床试验来看,以任一发病机制为目标的治疗方案都未取得预期的治疗效果,因此从多角度、多层面深入研究DPN 的发病机制,将为DPN早期筛查和治疗提供新的思路。