自然杀伤细胞在流感中的作用机制研究进展*

张 研,李 刚,张 茜△,哈小琴,吴 涛

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院血液科,兰州 730050;2.甘肃中医药大学第一临床医学院,兰州 730000;3.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院检验科,兰州 730050)

流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病,主要临床表现为高热和寒战、头痛、全身无力、肌肉和关节严重疼痛,以及呼吸道症状(咽痛、干咳和咳嗽等),严重危害人类健康安全[1]。据统计,全球每年因流感导致重症300万～500万例,死亡29万～65万例[2]。流感病毒属于正黏病毒科,是一种多节段的单股负链RNA病毒,感染潜伏期为18～72 h[3],分为甲、乙、丙、丁型流感病毒4种类型,其中甲型流感病毒(influenza A virus,IVA)变异性最强。IVA具有高度传染性,传播速度快,每年都会引起全球大流行。据报道,甲型H1N1流感病毒有感染免疫力低下宿主的倾向,此类人群被感染后会出现严重的临床表现和相关并发症,导致死亡率升高[4]。目前主要通过接种疫苗和抗病毒治疗两种措施防治流感[5]。而病毒突变或重组会改变其生物学特性,降低疫苗的效力,增加人群被频繁感染的可能性,导致免疫力低下人群的重症率、死亡率升高。目前仍未研制出能对抗不断变异的流感病毒的通用疫苗,因此,研制能够直接攻击病毒感染靶细胞的药物或通用疫苗成为科学界亟须解决的问题。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)在非致敏状态下迅速进入免疫应答状态发挥抗病毒作用,并在1～4 h识别感染靶细胞发挥杀伤作用,还具有双向免疫调节作用和记忆效应,基于以上特点,NK细胞有望成为流感的治疗性药物或疫苗。本文就NK细胞及其免疫激活在甲型流感中的作用进行简要综述。

1 NK细胞与IVA

流感对各年龄段人群均有影响,重症流感患者多由IVA感染引起。儿童是重症流感的高危人群,尤其低龄儿童因免疫系统不够健全极易受病毒攻击。儿童感染流感病毒可导致肺炎、脑病、脑炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌损伤及中耳炎等并发症,重症患儿可迅速进展为脓毒性休克、多脏器功能衰竭而死亡。NK细胞是固有淋巴样细胞(innate lymphoid cells,ILC1s)的一部分,是类似于细胞毒性T淋巴细胞的效应细胞。它通过抑制增殖、迁移和定植到远处组织来发挥天然细胞毒性,杀伤免疫逃逸的感染细胞[6],并在非致敏状态下迅速进入免疫应答,快速识别、杀伤免疫逃逸的靶细胞,其上述特性为早期预防IVA提供了理论基础。近年来,使用NK细胞治疗肿瘤及感染性疾病成为临床研究热点,为获得浓度更高的NK细胞用于临床治疗,学者们从诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和脐带血干细胞中分化NK细胞。从外周血单个核细胞产生的iPSC中提取的NK细胞,其抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)更强,目前NK细胞回输对部分肿瘤、感染性疾病的治疗有效性已得到证实,现结合国内外文献总结回输NK细胞防治IVA的研究进展,为其药用或疫苗研发提供理论依据。

1.1 NK细胞与免疫系统

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,分为适应性免疫系统和先天免疫系统,均具有识别和清除外来病原体及肿瘤的功能。适应性免疫主要由T淋巴细胞、B淋巴细胞组成,分别含有大量的T淋巴细胞和B淋巴细胞受体,可以对体内的抗原做出特异性反应。先天免疫系统包括吞噬细胞、NK细胞、树突状细胞,在病毒感染、肿瘤进展的极早阶段可快速而有效地发挥抗病毒、抗肿瘤作用。NK细胞是重要的效应淋巴细胞,其中外周血NK细胞是富含颗粒的大淋巴样细胞,因此又称为“大颗粒淋巴细胞”,其抗病毒和抗肿瘤活性最为突出[7]。NK细胞不仅产生γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)通过ADCC作用直接杀死靶细胞控制感染,还可以迅速检测到被感染细胞,在非致敏情况下裂解靶细胞。当NK细胞被靶细胞激活时,与靶细胞形成突触,裂解颗粒在微管上运输,最后汇聚到突触后膜[8]。来自突触的信号导致裂解颗粒(颗粒酶、颗粒溶素)极化并与细胞质膜对接融合,在突触后膜释放,从而发挥抗病毒作用[9-10]。穿孔素为NK细胞含有的细胞毒性关键效应物,穿孔素与靶细胞质膜融合形成渗透裂解孔,通过孔转移并激活半胱天冬酶,导致靶细胞凋亡,并且单个颗粒酶的释放也可以杀死靶细胞。此外,溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)又称为CD107a,可通过脱颗粒作用杀死其他靶细胞[10]。此外,NK细胞还通过激活其他几种免疫细胞,如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞间接发挥细胞毒性作用。

流感病毒属于单链RNA病毒,缺乏病毒RNA聚合酶校对,极易发生突变[11]。自然选择有利于病毒传播特征的演化[12],经过不断演化,流感病毒传播能力、免疫逃逸能力明显增强。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现较早,在体外1 h、体内4 h即可表现出杀伤作用。NK细胞分为CD56dim、CD56bright、CD56neg 3个亚群,其中CD56dim NK细胞群对受感染细胞的连续杀伤作用尤为突出,能够早期识别、清除病毒感染的细胞。因此,回输NK细胞有助于降低儿童、老年人、免疫力低下及患有严重基础疾病人群合并IVA的重症率、病死率,为疾病的早期预防提供依据。

合并基础性疾病的儿童IVA感染后死亡率增高,尤其应关注<2岁的低龄儿童[13]。由于免疫系统紊乱导致人体90%的疾病发生、发展甚至患者死亡。NK细胞的双重免疫调节作用可维持免疫系统平衡,同时识别异常细胞和正常细胞,减少对机体的损害,减少细胞因子风暴的发生,降低急危重症病死率[14]。NK细胞对于防治病毒感染均有良好的效果,尤其对于急危重症病例可以考虑使用NK细胞回输治疗。

NK细胞与适应性免疫系统在长期的免疫反应中发挥协同作用。虽然NK细胞被归类为固有免疫细胞,但近年来越来越多的研究表明,NK细胞能像适应性免疫细胞(T、B淋巴细胞)一样,具有免疫记忆、长期存活并介导再次免疫应答的作用[15]。其记忆效应可以通过白细胞介素(interleukin,IL)-12、IL-15和IL-18的短暂刺激来实现。在脂质体(liposome,LPS)体内给药诱导的内毒素血症模型中发现全身炎症驱动记忆样NK细胞的形成,这些NK细胞在体内存活数周,再次受到抗原刺激后产生更多的IFN-γ使免疫效应增强[16]。NK细胞不仅对炎性细胞、巨细胞病毒、猿免疫缺陷病毒、寨卡病毒等病毒感染具有记忆效应,对多种不同亚型的流感病毒(包括H1N1、H3N2、B型)也会产生记忆样应答,表明NK细胞对多种不同流感病毒亚型具有广泛的免疫记忆,可促进流感疫苗实现交叉保护,这成为NK细胞疫苗研发的优势所在[17-18]。

1.2 NK细胞与呼吸系统

流感是一种急性病毒性呼吸道感染传染病。作为内部环境和外部环境之间的连接,呼吸道成为IVA最主要、最先攻击的部位。因人群流感疫苗接种率较低,出现合并感染的风险较高[19]。流感病毒感染会导致过度炎症和组织损伤,触发NK细胞的激活并归巢到受影响的组织[20]。从小鼠实验模型证明,NK细胞归巢到感染部位对早期炎症反应和病毒遏制起到十分重要的作用[21]。一项研究以1 125例IVA感染儿童为研究对象,结果发现:儿童IVA与其他病原体的共检出率高,与腺病毒、肺炎支原体、细菌共检出时可能导致病情加重,与其他两种及以上病原体共检出时易发生重型流感[22]。合并感染导致机体免疫反应过度引起严重呼吸窘迫综合征、低氧血症及呼吸衰竭等。呼吸系统的第一道防线是固有免疫,当IVA入侵宿主呼吸道后NK细胞作为急性反应的效应器,迅速杀死感染靶细胞,并在激活后迅速产生IFN-γ介导细胞免疫,而且NK细胞对正常细胞有保护作用。基于以上特性,NK细胞回输治疗双重感染的急危重症患者是一种行之有效的选择。

1.3 NK细胞与消化系统

甲型H1N1流感的常见表现与季节性流感相似,常见症状包括发热、咳嗽、头痛、肌肉酸痛、乏力等,有时会出现呕吐、腹泻、食欲减退等消化道症状,部分患者病情出现突然恶化。流感病毒感染者免疫力低下,易再次被其他病毒感染。研究显示,免疫系统较弱的人群更容易感染诺如病毒[23],该病毒感染是胃肠炎和严重腹泻疾病的主要原因,可导致严重脱水危及生命[24]。诺如病毒利用M细胞穿过肠道上皮屏障,感染肠黏膜上皮细胞。虽然诺如病毒感染引起的症状会迅速消失,但在很长一段时间内依然可以在粪便中检出病毒[25]。无症状感染者携带的病毒体内清除时间可长达60 d,与有临床症状的人群持续时间相同,免疫功能低下的患者可能需要数月甚至数年[26]。IVA感染延长了诺如病毒感染恢复期,部分患者感染后会出现肠易激综合征(postinfectious irritable bowel syndrome,PI-IBS)和炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)等并发症。在一项关于胃肠道感染后PI-IBS中医证型与辅助性T淋巴细胞(helper T lymphocyte,Th)1/Th2漂移的相关性研究中显示,PI-IBS患者肠黏膜内炎症持续存在与Th1/Th2漂移存在一定关系[27]。Th1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-12,主要参与细胞免疫,抵抗细胞内病原体感染;Th2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,通过刺激B淋巴细胞成熟,参与体液免疫。黏膜持续的免疫激活状态引起Th1/Th2漂移,进而导致持续的肠道功能紊乱。当机体发生感染时,Th1/Th2表达失衡向Th1或Th2漂移,而NK细胞可以维持Th1/Th2细胞稳态。IL-2、IL-12、IFN-α等炎性细胞因子可明显提高NK的杀伤活性[28]。激活的NK细胞合成并释放免疫调节细胞因子维持免疫系统稳定,进而发挥免疫监视、抗病毒等作用。总之,基于以上阐述,NK细胞有助于改善病情,减少病毒感染后的胃肠道症状。

1.4 NK细胞与循环系统

流感常在冬季高发,患有心脏基础疾病者和65岁以上老人是其高危易感人群[29]。流感疫苗接种是预防流感感染及其并发症最有效的方法[30]。一项关于重庆市1 804名65岁以上老年人的问卷调查显示,仅有46.90%的老年人愿意接种流感疫苗[31]。疫苗接种率低使流感重症率和死亡率升高。流感可导致心血管系统急慢性损伤,引起呼吸功能障碍、循环系统衰竭、肝损伤、肾损伤、多器官衰竭甚至死亡。其中感染性心肌炎最常见,感染介导的Th1/Th2漂移引发“细胞因子风暴”,进而导致暴发性心肌炎的发生[32]。病毒感染引起的心肌损伤会增加原有心脏基础疾病的治疗难度。流感病毒感染合并心脏基础疾病极易发展为菌血症、败血症、脓毒血症、感染性休克,出现循环系统衰竭甚至死亡[33-34]。健康人群Th1/Th2处于动态平衡,当受到病原体刺激时,Th1/Th2平衡失调并向Th1或Th2漂移。Th1上调释放促炎细胞因子,Th2下调引起免疫功能紊乱,进而促进败血症、脓毒血症的发生、发展,引起循环系统衰竭[35-39]。可见,Th1/Th2平衡是免疫调节的关键[16],而NK细胞能够调节Th1/Th2比例,改变机体免疫活性,纠正免疫调节功能紊乱状态,减少感染性休克的发生。

2 NK细胞制备面临的挑战

NK细胞对多种病原体的防御至关重要,其主要来源于外周血、脐带血、胚胎,目前临床使用的NK细胞主要来源于外周血[40]。因外周血来源的NK细胞仅占外周血淋巴细胞的15%,生产大量NK细胞是当前面临的一个关键挑战[41]。脐带血因NK细胞比例较高,可作为外周血的替代,但存在采样量较小、每单位总数较低、细胞毒性低的缺点[42]。近年来研究发现,iPSC来源的NK细胞具有原料易获得、高扩增、高分化能力等优势,这为大量培养NK细胞应用于临床带来了希望[43]。但是,NK细胞制备工艺复杂,不同工艺生产的NK细胞纯度、活性存在差异,并且会出现相关表型缺失和功能降低的现象,使其疗效各异,也就使得NK细胞产品进入临床存在一定的限制性。因此,目前大多数NK细胞制剂的研发仍处于细胞实验及动物实验阶段。

3 小结与展望

尽管NK细胞产品逐渐进入临床,但仍然存在一定的限制。首先,回输NK细胞的增殖活性没有T淋巴细胞强,导致其清除受病毒感染细胞的能力降低,只有注入更多的NK细胞才可以提升治疗效果。其次,大多数NK细胞制剂仍处于临床前研究阶段[44]。但NK细胞有其优势,其中最大优势是长期冷冻保存不会影响细胞功能及杀伤作用;此外,在体内存留时间短不会因免疫源性而引起副作用[45]。考虑病毒变异株不断出现导致疫苗的效力被削弱,充分利用NK细胞的临床潜力研制出防治流感的新型药物或疫苗十分必要,但同时仍存在着诸多挑战。