长链非编码RNA烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1在肺癌发生发展中的作用研究进展

熊常州，韩坤余，刘 宁，马 帅，牛华涛

(1.成都中医药大学临床医学院,四川 成都 610075;2.云南中医药大学第一临床医学院,云南 昆明 650021;3.云南省肿瘤医院神经外科,云南 昆明 650118)

原发性肺癌(以下简称肺癌)是目前全球致死率最高的恶性肿瘤,可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)2大类,其中NSCLC约占80%～85%,包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等组织学亚型,其余为SCLC[1]。2020年全球约2 206 771例新发肺癌患者(占癌症发病总数的11.4%),1 796 144例死亡患者(占癌症死亡总数的18.0%)[2]。肺癌也是我国近30 a来发病率增长最快的恶性肿瘤[1],同时也是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤[3]。尽管手术、放射治疗、化学治疗、分子靶向治疗和免疫治疗等在肺癌的治疗中取得了一定进展,但其预后仍不容乐观。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)为无明显蛋白质编码能力的转录子,长度超过200个核苷酸[4-5],参与调控基因表达、细胞周期、细胞凋亡、染色质重塑和表观遗传修饰等生理过程[6]。lncRNA在肺癌的发生发展中占据着重要地位,也是肺癌的重要治疗靶点。有研究表明,lncRNA UCC可以特异性地结合miR-143-3p,在NSCLC细胞中充当miR-143-3p的“海绵”,通过吸收miR-143-3p诱导SBY-BOX转录因子5(SRY-related high mobility group box 5,SOX5)的表达,在NSCLC中促进上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),进而在体外和体内诱导NSCLC细胞的增殖和迁移[7]。烟酰胺核苷酸转氢酶-反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1,NNT-AS1)作为近年来新发现的lncRNA分子,其表达与NSCLC的EMT、增殖、迁移及侵袭有关[8],并能够通过miR-1236-3p/自噬相关基因7(autophagy-related gene 7,ATG7)轴影响NSCLC细胞对顺铂的敏感性[9],或为肺癌的治疗提供了新靶点及预后标志物。本文就lncRNA NNT-AS1在肺癌发生发展中的作用研究进展进行综述。

1 LncRNA NNT-AS1简介

随着高通量测序技术的发展,lncRNA被发现是包含一类异质的基因间转录子、增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)及与其他基因重叠的有义或反义转录子[10],其作用引起了越来越多学者的关注。LncRNA的功能主要包括在顺式中调控局部染色质或基因表达;其次是在反式中离开转录位点调控染色质状态和基因表达,影响核结构和组织,与蛋白质和(或)其他 RNA 分子相互作用[11]。研究发现,多种lncRNA与恶性肿瘤密切相关,其肿瘤特异性及在循环体液(血浆和尿液)中的稳定性为肿瘤的诊断、治疗及预后提供了新的基础[12]。

NNT-AS1作为近年来新发现的lncRNA分子,主要分布在细胞质中,位于5p12染色体区域中,有3个外显子。研究发现,NNT-AS1失调与肿瘤之间存在潜在的相关性,在肺癌[13-14]、结肠癌[15]、胃癌[16]、肝癌[17]、胆管癌[18]等多种恶性肿瘤中均呈异常表达。NNT-AS1可以通过诱导肿瘤细胞增殖、侵袭和转移以及抑制细胞凋亡等机制对恶性肿瘤起促进作用。一项荟萃分析发现,NNT-AS1的高表达与肿瘤患者不良的生存结局显著相关,建议将其作为肿瘤进展中的预后标志物[19]。

2 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的致癌机制

EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,其在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移和多种纤维化疾病中发挥着重要作用[20]。E-钙黏素蛋白是上皮标志物,波形蛋白、N-钙黏素蛋白、蜗牛家族转录抑制子2是间充质标志物,它们均是恶性肿瘤EMT过程中至关重要的几种蛋白。NNT-AS1的高表达可以导致E-钙黏素蛋白水平显著降低,N-钙黏素蛋白和波形蛋白水平显著升高,进而促进肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭及EMT[21-22]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路是促进肿瘤血管形成、肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞侵袭和转移的重要信号通路,NNT-AS1可以通过活化MAPK/ERK信号通路,促使Ras作用因子(Ras interaction/interference 1,Rin1)、波形蛋白表达水平、ERK1/2活化程度升高及E-钙黏素蛋白表达水平下降来促进肿瘤的发生[15]。陈晓等[23]研究发现,NNT-AS1在肺癌组织、细胞中均呈高表达,通过在A549和95D细胞中敲低NNT-AS1可以抑制肺癌细胞增殖和集落形成能力,促进癌细胞凋亡。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在许多恶性肿瘤中充当致癌基因,在肺癌等实体肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用[24-26]。NNT-AS1还可以通过调节miR-22-3p和YAP1介导的ERK途径促进NSCLC进展。敲低NNT-AS1可以显著提高E-钙黏素蛋白水平,降低N-钙黏素蛋白和波形蛋白水平,进而阻碍NSCLC进展[8]。以上研究结果均提示,NNT-AS1作为一种致癌因子可促进肺癌的发生及发展。

3 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的作用

3.1 LncRNA NNT-AS1在肺癌中的作用信号通路

LncRNA NNT-AS1通过miR-3666/E2F2、miR-22-3p/YAP1、miR-22/FOXM1、miR-1236-3p/ATG7、miR-129-5p、MAPK/Slug等多个信号通路参与肺癌的发生和发展。

miR-3666/E2F2信号通路:E2F2 3′UTR-WT(E2F2)作为致癌基因,通过充当miRlet-7a或miR-99a32,33的靶点来促进肺癌的发展。研究证实,相对于正常组织,肺癌组织中NNT-AS1的表达增加,miR-3666在肺癌组织和细胞中呈低表达,E2F2的表达会随着miR-3666表达的降低而增强,NNT-AS1通过在肺癌细胞中“海绵化”miR-3666调节E2F2的表达,从而参与肺癌的发展[27]。

miR-22-3p/YAP1信号通路:HE等[8]研究发现,NSCLC细胞中NNT-AS1呈高表达,miR-22-3p在NSCLC细胞中的表达明显降低,NNT-AS1通过“海绵化”miR-22-3p、调节YAP1和YAP1介导的ERK通路促进NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。

miR-22/FOXM1信号通路:通过实验证实,在肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)组织和细胞系中NNT-AS1和叉头框蛋白M1(forkhead box protein M1,FOXM1)的表达升高,但miR-22的表达水平下降。NNT-AS1通过“海绵化”miR-22诱导LUSC细胞凋亡,miR-22过表达可通过靶向FOXM1抑制LUSC细胞转移,NNT-AS1可以通过“海绵化”miR-22间接调节FOXM1的表达,从而影响LUSC的发生发展[13]。

miR-1236-3p/ATG7信号通路:研究发现,在肺癌细胞中NNT-AS1和自噬相关基因7(autophagy associated gene 7,ATG7)均呈高表达,miR-1236-3p呈低表达[9]。NNT-AS1能够靶向肺癌顺铂耐药细胞中miR-1236-3p,ATG7的表达与肺癌组织中的miR-1236-3p水平呈负相关,ATG7在顺铂耐药肺癌细胞中由miR-1236-3p和NNT-AS1共同调控,NNT-AS1/miR-1236-3p/ATG7轴可以参与调控肺癌细胞对顺铂的耐药性。

miR-129-5p信号通路: miR-129-5p在肺癌组织中的表达与NNT-AS1的表达呈负相关,miR-129-5p可以与NNT-AS1的3′-UTR位点结合,NNT-AS1可以通过“海绵化”肺癌中的miR-129-5p,作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)发挥促进肺癌细胞增殖和侵袭的作用,而miR-129-5p抑制剂可以改善NNT-AS1下调引起的肺癌细胞增殖和侵袭[14]。

MAPK/Slug信号通路:CAI等[28]研究发现,与非耐药肺癌组织相比,耐药NSCLC组织中NNT-AS1的表达上调,而在敲低NNT-AS1后,耐药细胞的增殖能力明显受到抑制,耐药细胞的集落数随着顺铂浓度的增加而降低,其机制为NNT-AS1可以通过调控MAPK/Slug信号通路介导NSCLC细胞的顺铂耐药性。

3.2 LncRNA NNT-AS1参与肺癌的增殖、转移

LncRNA的异常表达在NSCLC的进展和转移中起关键作用,其作为ceRNA,可与miRNA相互作用、与靶蛋白结合、参与不同信号通路的转导,通过影响EMT的进展和癌症干细胞(cancer stem cell,CSC)的性质来发挥其调控NSCLC转移的功能[29]。NNT-AS1作为一种新发现的致癌性lncRNA,其表达与肺癌患者肿瘤分期和淋巴结转移有关[14],NNT-AS1可以通过“海绵化”NSCLC中的miR-129-5p、miR-3666、miR-22调控YAP1、FOXM1、ERK等靶点或通路促进肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT[27、8、13]。

陈晓等[23]通过集落形成实验在NNT-AS1敲低的A549细胞中观察到约62个集落,对照组A549细胞中观察到约135个集落;细胞增殖实验中,在A549细胞NNT-AS1被敲低的第4天,A549细胞的增殖率分别降低了8%和16%。该研究在95D细胞中也观察到了同样的结果。说明敲低NNT-AS1可以抑制A549和95D细胞的增殖及集落形成能力,NNT-AS1表达水平与肿瘤大小和TNM分期相关。

3.3 LncRNA NNT-AS1与肺癌细胞的顺铂耐药性

顺铂是治疗实体肿瘤最常用的化学治疗药物之一,但其易产生耐药性而导致化学治疗失败,是导致肿瘤复发和进展的重要原因[30]。NNT-AS1参与调控肺癌细胞对顺铂的耐药性,WANG等[9]研究发现,对顺铂耐药的肺癌组织和细胞中NNT-AS1呈高表达水平,敲低NNT-AS1可增强肺癌细胞对顺铂的敏感性,这表明NNT-AS1在肺癌细胞中的高表达可能会影响肺癌细胞的耐药性。其机制可能为:NNT-AS1通过“海绵化”miR-1236-3p来调控顺铂耐药肺癌细胞中ATG7的表达,进而影响肺癌细胞的顺铂耐药性。CAI等[28]研究得出了类似的结果,但NNT-AS1影响肺癌细胞耐药的机制及靶点有所不同,该研究发现,敲低NNT-AS1可以通过抑制MAPK/Slug信号通路影响NSCLC细胞的顺铂耐药性。MAPK/Slug信号通路是促进NSCLC细胞顺铂耐药性的重要通路,在肿瘤化学治疗耐药中起着重要作用[31]。MAPK、Slug广泛参与癌细胞周期进程、细胞凋亡、细胞迁移/侵袭[32-33],Slug可以抑制E-钙黏素蛋白表达,增加波形蛋白表达,诱导NSCLC的EMT,随着Slug表达的增加,肺癌组织的恶性程度和转移率增加[34]。

3.4 LncRNA NNT-AS1与肺癌预后

NNT-AS1的表达水平与肿瘤患者的预后相关,多项研究表明,NNT-AS1的高表达是胃癌[16]、结直肠癌[15]、肝细胞癌[17]等肿瘤预后不良的重要因素。NNT-AS1的表达与总生存期、无病生存期(disease free survival,DFS)呈负相关,与肿瘤分期、淋巴结转移及浸润深度等临床病理特征呈正相关,而与其他临床特征(包括年龄和性别)无相关性,且NNT-AS1的高表达与不良的生存结局显著相关,可以作为肿瘤预后的潜在标志物[19]。

在肺癌的研究中也得到了同样的结论,较高的NNT-AS1表达与肺癌患者预后不良密切相关,WANG等[9]研究发现,高表达的NNT-AS1和ATG7以及低水平的miR-1236-3p在肺癌细胞对顺铂耐药性的发生和进展中发挥了关键作用。因此,敲低NNT-AS1可以促进细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移、侵袭,增加耐药细胞的敏感性,NNT-AS1在肺癌治疗中可能提供靶标和预后标志物。

4 结论

目前的研究表明,lncRNA NNT-AS1的异常表达是肺癌独立的预后标志物,NNT-AS1在肺癌中呈高表达,并通过miR-3666/E2F2、miR-22-3p/YAP1、miR-22/FOXM1、miR-1236-3p/ATG7、miR-129-5p、MAPK/Slug等信号通路调节复杂的ceRNA网络,从而在肺癌的发生发展中发挥重要作用。NNT-AS1通过多个信号通路参与肺癌细胞的凋亡、增殖、迁移、侵袭。此外,NNT-AS1还参与介导肺癌细胞的顺铂耐药性,敲低NNT-AS1可以增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。

NNT-AS1作为新发现的lncRNA,在肺癌中的作用研究取得了一定进展,但仍有很多不足,如目前研究较少,且多数研究样本量小;调控NNT-AS1的上游分子机制尚不明确;NNT-AS1表达的临界值尚无统一共识;关于NNT-AS1表达水平与预后结局的关系(如总生存期、无进展生存期、DFS)的数据较少等,这些问题仍需要后续的研究来解决。总之,NNT-AS1的高表达与肺癌的不良生存结局和较差的临床病理特征显著相关,这可能为肺癌提供新的治疗靶点及预后标志物,并为克服肺癌的顺铂耐药性提供了新的思路。