响应面法优选穿心莲多糖大孔树脂脱色工艺及其抗氧化活性研究

杨紫焰 李自霖 张翠香 黄丽金 陈贵元 李雪英

摘要 為了明确大孔树脂脱除穿心莲多糖中色素的工艺参数，研究大孔树脂添加量、脱色时间以及脱色温度对穿心莲多糖脱色效果的影响，采用响应面法优选大孔树脂脱除穿心莲多糖色素的工艺，并探究穿心莲多糖的体外抗氧化活性。结果表明，穿心莲多糖大孔树脂最佳脱色工艺为大孔树脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脱色温度50 ℃，脱色2.0 h，脱色1次。基于该工艺条件，穿心莲多糖色素去除率可达81.35%，多糖保留率73.16%，穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的加权综合评分77.25，表明该穿心莲多糖大孔树脂脱色工艺稳定，可用于穿心莲多糖中色素脱除的生产实际。抗氧化试验结果表明，穿心莲多糖对·OH自由基有较好的清除作用，其具有一定的抗氧化活性。

关键词 穿心莲多糖；大孔树脂；响应面法；脱色工艺；抗氧化活性

中图分类号 TS201.1；S567.219   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2024）10-0089-07

Optimization of macroporous resin for removing polysaccharide pigment from Andrographis paniculata by response surface method and its antioxidant activity

YANG Ziyan1    LI Ziling1    ZHANG Cuixiang1    HUANG Lijin1    CHEN Guiyuan1    LI Xueying1， 2

（1College of Basic Medicine， Dali University， Dali 671000， China;

2College of Agriculture and Biological Sciences， Dali University， Dali 671003， China）

Abstract In order to clarify the process parameters of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， the effects of resin dosage， decolorization time， and decolorization temperature on the decolorization effect of Andrographis paniculata polysaccharides were studied. The response surface methodology was used to optimize the process of using macroporous resin to remove pigments from Andrographis paniculata polysaccharides， and the antioxidant activity of Andrographis paniculata polysaccharides was investigated. The results showed that the optimal decolorization process for the polysaccharide macroporous resin of Andrographis paniculata was as follows： the amount of macroporous resin added was 3.0 g/100 mL of polysaccharide solution， decolorization temperature was 50 ℃， decolorization time was 2.0 hours， and decolorization was once. Based on this process condition， the removal rate of pigment from Andrographis paniculata polysaccharide could reach 81.35%， the retention rate of polysaccharides was 73.16%， and the weighted score of Andrographis paniculata polysaccharides pigment removal rate and polysaccharide retention rate was 77.25， which indicated that the macroporous resin decolorization process of Andrographis paniculata polysaccharides was stable and feasible which could be used for the actual production of pigment removal from Andrographis paniculata polysaccharides. The results of antioxidant experiments indicated that the polysaccharides of Andrographis paniculata had a good scavenging effect on ·OH free radicals， indicating that the polysaccharides of Andrographis paniculata had certain antioxidant activity.

Keywords  Andrographis paniculata polysaccharide; macroporous resin; response surface method; decolorization process; antioxidant activity

穿心莲（Andrographis paniculata）又名苦胆草，为爵床科一年生植物，全草皆可入药，主要分布在湿热地区。穿心莲性寒味苦，具有一定的清热、消肿和解毒等功效[1]。穿心莲根茎叶中均含有内酯、皂苷、黄酮、多酚和多糖等生物活性分子[2]。关于穿心莲多糖的提取方面的研究已有相关报道[3-4]。多糖大多为水溶性大分子，常以水作为媒介进行提取，因此在提取多糖的时候，往往也会把水溶性色素物质提取出来。色素物质与多糖混在一起可能会对多糖的分离纯化、结构鉴定及其活性等产生影响[5]。因此，去除多糖中的色素物质是多糖分离纯化、结构研究和活性分析的重要环节，多糖脱色工作的开展对多糖结构和功能的研究意义重大。常用的多糖脱色方法有双氧水氧化脱色法、活性碳吸附脱色法和大孔树脂吸附脱色法，不同的脱色方法可能会对多糖的脱色效果、活性和结构产生影响[6-8]。双氧水的氧化性强，脱色条件较为严苛，可能会影响多糖的活性[9]。活性碳吸附脱色法操作简单，但是吸附特异性较差，吸附色素的同时也会吸附多糖，造成多糖的损失，且对大分子色素物质的吸附效果不佳[10]。大孔树脂脱色法具有操作简单、脱色条件温和、重复性好且对多糖的结构及活性影响较小等优点[11-12]，是当前多糖脱色较为常用的方法。采用双氧水氧化法和活性碳吸附法脱除苦胆草多糖中的色素的研究已有报道[13-14]，采用大孔树脂作为脱色剂脱除穿心莲（苦胆草）多糖中色素物质的研究尚未见报道。因此，本研究以FL-1型大孔树脂作为脱色剂，考察脱色时间、大孔树脂添加量和脱色温度3个单因素对穿心莲多糖中的色素物质脱除效果的影响，采用响应面法优选穿心莲多糖大孔树脂脱色工艺，探究脱色后的穿心莲多糖的体外抗氧化活性，为穿心莲多糖的开发研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

穿心莲茎部干料购自云南大理某药房，为爵床科穿心莲属植物穿心莲的干燥地上部分，粉碎成60目粉末；葡萄糖标准品购自中国食品药品检定研究院（批号：110833－201506）；FL-1型大孔树脂购于上海一基实业有限公司；抗坏血酸（Vc）购于Sigma公司；水杨酸购于上海试剂一厂；其他试剂均为国产分析纯（AR），购于国药试剂公司。

1.2 试验仪器

试验所用仪器有XPR204S/AC电子天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；水浴恒温振荡器（上海郓曹电子科技有限公司）；XD-52水浴旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）；TS-100C型振荡摇床（上海天呈实验仪器制造有限公司）；UV-5100型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；KH22R型冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；LGJ-10型真空冷冻干燥机（深圳市三莉科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 穿心莲多糖的提取  穿心莲多糖的提取方法参照文献[3]，多糖提取液经真空浓缩，采用Sevage法脱蛋白至280 nm 波长处无明显吸收峰，蒸馏水稀释无水乙醇使其最终浓度为85%，沉淀多糖12.0 h，回收乙醇，分别用丙酮、乙醚洗涤穿心莲多糖沉淀物1次，真空冷冻干燥，得穿心莲多糖粗品。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制  将葡萄糖标准品于105 ℃烘干至恒重，称取100.0 mg，溶解于去离子水中，并定容至1 000 mL。参考文献[15]的方法制作葡萄糖标线，得线性回归方程：Y=0.012 1X+0.076 9，线性拟和系数R2=0.998 9，提示在葡萄糖质量浓度（X）为0～0.06 mg/mL时，与吸光度（Y）的线性关系较好，可用于多糖质量浓度的测定。

1.3.3 穿心莲多糖色素去除率的测定  称取0.5 g穿心莲多糖干粉溶解于100 mL去离子水中。待充分溶解后，4 000 r/min冷冻离心5 min，收集上清液，取2 mL多糖上清液全波长扫描，在540 nm波长处穿心莲多糖有最大吸收峰，所以选择540 nm波长检测穿心莲多糖溶液的吸光度，多糖的色素去除率计算公式如下。

式（1）中，R为穿心莲多糖色素去除率，%；A1为色素去除前穿心莲多糖溶液的吸光度；A2为色素去除后穿心莲多糖溶液的吸光度。

1.3.4 穿心莲多糖保留率的测定  参照文献[16]的方法测定穿心莲多糖的质量浓度。按式（2）计算穿心莲多糖的保留率。

式（2）中，K为穿心莲多糖的保留率，%；C1为穿心莲多糖色素去除后的多糖质量浓度，mg/mL；C0为穿心莲多糖色素去除前的多糖质量浓度，mg/mL。

1.3.5 穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分  参照文献[17]的方法，选取色素去除率和多糖保留率的加权评分评价大孔树脂对穿心莲多糖的脱色效果，设定穿心莲多糖的保留率（K）和穿心莲多糖色素去除率（R）两个指标的加权值各占50%，色素去除率和多糖保留率两者加权的综合评分（M）计算公式如下。

式（3）中，M为穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的綜合评分，分；R为穿心莲多糖色素去除率，%；Rmax为穿心莲多糖色素去除率的最大值，%；K为穿心莲多糖的保留率，%；Kmax为穿心莲多糖保留率的最大值，%。

1.3.6 大孔树脂的活化处理  参照文献[18]的方法活化FL-1型大孔树脂，用5%的盐酸和5%的NaOH溶液分别浸泡树脂6.0 h，去离子水洗涤树脂至pH值呈中性，然后用95%乙醇浸泡树脂6.0 h，回收乙醇，去离子水洗涤树脂3次，4 000 r/min冷冻离心5 min，收集树脂备用。

1.3.7 单因素试验设计  称取0.5 g穿心莲多糖粉末多份，去离子水分别定容至100 mL，得到多糖质量浓度为5 mg/mL的多糖供试液多份。分别考察脱色时间（A）、脱色温度（B）和大孔树脂添加量（C）对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的影响。

1.4 响应面试验设计

基于单因素试验结果，以穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率两者加权的综合评分（M）作为检测指标，按照表1设置各个因素及其水平，采用响应面法优选大孔树脂脱除穿心莲多糖中色素物质的工艺参数。

1.5 穿心莲多糖清除·OH自由基的作用

参照文献[19]的方法，取3支洁净试管，分别标注测定管、空白管和本底管，分别向3支试管中加入1 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL。向空白管和测定管中各加入3 mmol/L的双氧水2.5 mL，本底管中加入2.5 mL去离子水代替双氧水；向测定管和本底管中各加入0.5 mL不同质量浓度的穿心莲多糖溶液，向空白管中加入0.5 mL去离子水。最后向3支管中各加入3 mmol/L的水杨酸溶液4.5 mL，混匀，37 ℃孵育15 min。以3 mmol/L的水杨酸溶液作参比调零，测定510 nm波长处的各管吸光度。选用抗坏血酸（Vc）作为阳性对照，同法操作，将测得的各管吸光度代入式（4），计算穿心莲多糖或者Vc对·OH自由基的清除率。

式（4）中，E为穿心莲多糖或者Vc对·OH自由基的清除率，%；A0为空白管的吸光度；A1为穿心莲多糖或Vc测定管的吸光度；A2为穿心莲多糖或Vc本底管的吸光度。

1.6 試验数据统计分析

各个试验均3次重复，各个试验的数据均采用平均值，应用Design-Expert 10.0开展响应面试验，使用SPSS 9.0软件对各个试验的数据进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 脱色时间对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的影响

如图1所示，穿心莲多糖的色素去除率随着脱色时间的延长而不断增加，穿心莲多糖的保留率则不断下降，可能是大孔树脂对穿心莲多糖也具有吸附作用，导致多糖保留率下降。当脱色时间达到2.0 h时，多糖色素去除率达到71.21%，多糖保留率为78.03%。当脱色时间超过2.0 h后，穿心莲多糖的保留率则迅速下降。考虑时间成本以及减少多糖的损失，选择2.0 h进行后续单因素试验。选择脱色时间1.0、2.0和3.0 h这3个水平开展响应面试验。

2.2 脱色温度对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的影响

如图2所示，穿心莲多糖色素去除率与脱色温度的增加呈正相关，但是穿心莲多糖的保留率则随着脱色温度的增加呈现下降的趋势。当脱色温度达到50 ℃时，穿心莲多糖色素去除率达到82.00%，多糖保留率为63.00%；当脱色温度超过50 ℃后，穿心莲多糖色素去除率增加缓慢，而穿心莲多糖的保留率下降较快，可能是温度过高引起多糖的水解，导致多糖的损失。为了减少穿心莲多糖的损失，选择脱色温度50 ℃开展后续试验。综合考虑，选取脱色温度40、50和60 ℃这3个水平开展响应面试验。

2.3 大孔树脂添加量对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的影响

如图3所示，随着大孔树脂添加量的增加，穿心莲多糖色素去除率也有所增加，表明穿心莲多糖色素去除率与大孔树脂的添加量呈正相关，但是穿心莲多糖保留率与大孔树脂的添加量则呈负相关，可能是大孔树脂吸附色素物质的同时也非特异性地吸附了穿心莲多糖，导致多糖损失。当大孔树脂添加量达到3.0 g时，穿心莲多糖色素去除率达到75.00%，多糖保留率为76.00%，再增加大孔树脂添加量，穿心莲多糖色素去除率增加趋缓，多糖保留率则呈下降趋势，为减少穿心莲多糖损失，选择大孔树脂添加量3.0 g开展试验，选择大孔树脂添加量2.0、3.0和4.0 g这3个水平开展响应面试验。

2.4 响应面试验分析相关指标对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的影响

2.4.1 响应面试验  按照Design-Expert 10.0软件的设计方案开展响应面试验，得到的试验结果如表2—3所示。表2中的试验数据经Design-Expert 10.0软件拟合分析，得到穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）与脱色时间（A）、脱色温度（B）以及大孔树脂添加量（C）之间的二次回归方程：M=77.76-2.33A-1.96B-0.28C+0.22AB-1.01AC-2.83BC-6.51A2-11.72B2-9.62C2。

由表3的分析结果可知，该回归模型P值<0.000 1，失拟项的P值为0.157 4，提示脱色时间（A）、脱色温度（B）、大孔树脂添加量（C）与穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）的拟合具有统计学意义。拟合系数（R2）为0.991 4，校正拟合系数（R2Adj）为0.980 4，提示脱色时间（A）、脱色温度（B）和大孔树脂添加量（C）3个因素与穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）的线性关系较好。

表3中A、B、A2、B2和C2的P值均小于0.05，提示A、B、A2、B2和C2对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）的影响都具有统计学意义。表3中BC的P值小于0.05，表明BC对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）的影响具有统计学意义。A、B和C的F值分别为25.37、18.06和0.38，提示脱色时间（A）、脱色温度（B）和大孔树脂添加量（C）对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）影响的强弱顺序为脱色时间（A）>脱色温度（B）>大孔树脂添加量（C）。

2.4.2 各因素交互作用分析  响应曲面的陡峭程度和等高线的形态均可表示两个因素间的交互作用是否具有统计学意义。响应曲面越陡峭，等高线形状越接近椭圆，表示两个因素的交互作用越具有统计学意义；响应曲面越平缓，等高线形状越趋近圆形，则提示两个因素的交互作用不具有统计学意义[20]。

由图4可知，脱色时间（A）与脱色温度（B）、脱色时间（A）与大孔树脂添加量（C）之间的响应曲面较为平缓，且等高线趋近圆形，提示脱色时间（A）与脱色温度（B）、脱色时间（A）与大孔树脂添加量（C）间的交互作用不存在统计学意义（图4A—B），表明AB、AC对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）的影响不存在统计学意义。脱色温度（B）与大孔树脂添加量（C）间的响应曲面较为陡峭，等高线形状接近椭圆形，提示脱色温度（B）与大孔树脂添加量（C）之间的交互作用存在统计学意义（图4C），表明BC对穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分（M）具有明显影响。以上结果与表3中的方差分析结果基本一致。

2.4.3 工藝验证试验结果分析  将表2的试验数据导入Design-Expert 10.0软件，通过软件预测得到穿心莲多糖的理论最佳脱色工艺参数：100 mL穿心莲多糖溶液中添加大孔树脂3.05 g，脱色1.82 h、脱色温度49.13 ℃和脱色1次，得到多糖色素去除率和多糖保留率综合评分的预测值为78.05。考虑到生产实际情况，将穿心莲多糖的最佳脱色工艺参数调整为大孔树脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脱色温度50 ℃，脱色2.0 h，脱色1次。基于该工艺进行3次平行试验并计算平均值，可得穿心莲多糖色素去除率为81.35%，多糖保留率为73.16%，综合评分为77.25，与理论预测值78.05较为接近，表明该穿心莲多糖大孔树脂脱色工艺稳定可靠，可用于穿心莲多糖中色素脱除的生产实际。

2.5 穿心莲多糖对·OH自由基的清除作用

如图5所示，穿心莲多糖对·OH自由基的清除率与多糖浓度呈相关性。当穿心莲多糖质量浓度为0.6 mg/mL时，对·OH自由基的清除率可达44.64%，低于相同浓度的Vc对·OH自由基的清除率（98.42%），但穿心莲多糖仍表现出一定的抗氧化活性。自由基的强氧化性对DNA、油脂和有机物具有一定的破坏性。临床上常用Vc作为抗氧化剂清除自由基，但是其过量使用可能会引起副作用。穿心莲多糖属于天然产物，具有副作用小的优点，在食品、医学领域具有作为天然抗氧化剂的潜在应用价值。

3 结论与讨论

本研究以穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率作为考察指标，研究脱色温度、脱色时间以及大孔树脂添加量对穿心莲多糖中色素去除的影响。基于单因素试验结果，采用响应面法优选大孔树脂脱除穿心莲多糖色素的工艺参数。结果表明，穿心莲多糖大孔树脂最佳脱色工艺参数为大孔树脂添加量3.0 g/100 mL多糖溶液，脱色温度50 ℃，脱色2.0 h，脱色1次。基于该工艺参数开展脱色试验，穿心莲多糖色素去除率可达81.35%，多糖保留率为73.16%，穿心莲多糖色素去除率和多糖保留率的综合评分为77.25，与理论预测综合评分（78.05）的误差较小，提示该穿心莲多糖大孔树脂脱色工艺稳定可行，可用于穿心莲多糖色素脱除的实际生产。穿心莲多糖体外抗氧化试验结果表明，穿心莲多糖对·OH自由基具有一定的清除作用，质量浓度0.6 mg/mL的穿心莲多糖对·OH自由基的清除率可达44.64%，提示穿心莲多糖仍具有一定的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂在食品、医疗等领域开发应用。

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（责编：王 菁）