南繁基地牛筋草对草甘膦的抗药性研究

陈景超 崔海兰 于海燕 李志玲 李香菊

摘要

牛筋草是一年生禾本科惡性杂草，在我国黄淮海流域及长江以南地区的农田危害严重。草甘膦是一种优良的非选择性除草剂，随着生物育种产业化的推进，草甘膦会逐步在玉米、大豆等作物田登记应用。育种基地抗草甘膦杂草的产生是其快速传播的潜在因素。为明确三亚一育种基地牛筋草种群对草甘膦的敏感性，本研究利用生物测定、分子生物学等方法检测了待测种群的抗性水平，并分析了可能的分子机制。结果发现，草甘膦对牛筋草种群的生长抑制中量为2 053.0 g/hm2（有效成分用量），抗性指数（RI）为5.0;靶标基因EPSPS的保守区域无突变，但相对表达量是敏感种群的47.4倍;抗性植株中EPSPS蛋白的浓度是敏感植株的17.1倍。以上结果表明，该牛筋草种群对草甘膦产生了中等水平抗性，靶标基因过量表达是其抗性机制之一。

关键词

牛筋草; 草甘膦; 抗药性; 传播

中图分类号：

S 451.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2023167

Study of glyphosateresistant Eleusine indica in seed breeding base in Hainan

CHEN Jingchao， CUI Hailan， YU Haiyan， LI Zhiling， LI Xiangju*

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Eleusine indica is an annual malignant Poaceae weeds. This grass inflicts substantial damage to farmlands in the HuangHuaiHai Region and south of the Yangtze River. Glyphosate， renowned for its efficacy as a nonselective herbicide， is gradually finding application in corn， soybean， and other crop fields with the advancement of biological breeding industrialization. The emergence of glyphosateresistant weeds in seed breeding bases serves as a potential factor for their rapid spread. To clarify the susceptibility of E.indica to glyphosate in Sanya， Hainan province， wholeplant bioassays， target gene mutation， and expression detection were conducted to detect the resistance levels and mechanisms. The results showed that the GR50 of this population was 2 053.0 g/hm2， with a resistance index （RI） of 5.0. There was no significant difference in the conserved region of EPSPS between the resistant and susceptible populations. However， the relative expression level of the target gene EPSPS in the resistant population was 47.4 times of that in the susceptible population. In addition， the EPSPS protein concentration in resistant plants was 17.1 times of those in susceptible plants. These results suggest the evolution of glyphosate resistance within the population， with one of the resistance mechanisms involving an increase in target protein content due to EPSPS overexpression.

Key words

Eleusine indica; glyphosate; resistance; spread

牛筋草Eleusine indica （L.） Gaertn.，俗名蟋蟀草，是一种分布在热带、亚热带以及温带地区的恶性杂草［12］。牛筋草是我国华南地区果园的优势杂草。在黄淮海等棉花、玉米产区，牛筋草也是田间危害严重的杂草之一［3］。草甘膦是一种优良的非选择性除草剂，具有杀草谱广，对环境友好等优点，1985年在我国登记使用，主要以茎叶喷雾方式防除果园、非耕地等的杂草，也应用于茶园、棉田、稻田等作物田埂或田间定向除草。草甘膦竞争性抑制莽草酸途径中的5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19），阻断植物体内芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成而引起植物死亡［4］。由于长期单一使用，我国已有多个省发现了抗草甘膦的牛筋草种群。华南地区的果园是抗草甘膦牛筋草发生的重灾区，范围广，抗性水平高［56］。此外，茶园、棉田、直播稻田等也发现零星发生的抗性种群［710］。

杂草对草甘膦的抗性主要分为两大类，一类是靶标抗性。主要包括靶标基因EPSPS保守区域发生突变导致氨基酸替换，此外，靶标基因过表达也是一种常见的靶标抗性机制［1112］。另一类是非靶標抗性。通过改变植株叶片等器官组织的生理结构以及快速坏死等应激反应，来降低草甘膦的吸收与转导是最为常见的非靶标抗性机制［13］。另外一种机制是将草甘膦代谢为无毒的乙醛酸和氨甲基膦酸等物质从而产生抗性［14］。

2020年以来，具有耐草甘膦性状的多个转基因玉米、大豆转化体获得我国农业转基因生物生产应用安全证书［15］。随着我国生物育种产业化的逐步推进，草甘膦的应用范围将会扩大。阻断抗草甘膦杂草向转基因作物田传播，对转基因作物及草甘膦的长期应用都至关重要。育种基地抗草甘膦杂草的防除及种子检疫是阻断其快速传播的重要手段。本研究从海南某育种基地采集了疑似对草甘膦产生抗性的牛筋草种子，对其抗性水平和分子抗性机制进行了研究，研究结果可为育种基地杂草防除策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试试剂及种子材料

41％草甘膦异丙胺盐水剂，拜耳股份公司;植物总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2×PCR Mix、DL Marker 2000购于天根生化有限公司;引物订购于生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂糖等一般化学试剂购于北京索莱宝科技有限公司，均为国产分析纯或化学纯。

疑似对草甘膦产生抗性的牛筋草种群采集自海南省三亚市天涯区育种基地，敏感种群采自附近无草甘膦施用历史的荒地。

1.2 牛筋草对草甘膦的敏感性及体内的莽草酸含量测定

选取成熟饱满一致的牛筋草种子，用1%的赤霉素溶液浸泡24 h。洗净后播种到盛有土壤表层土：有机质（3∶1）混合土壤的方形花盆中（7 cm×7 cm），置于L∥D=12 h∥12 h的温室内培养，光照时温度（27±4）℃，相对湿度（60±20）%;黑暗时温度（20±4）℃，相对湿度（50±20）%［16］。选取生长一致的牛筋草，每盆保留8株备用。牛筋草生长至5～6叶期时茎叶喷雾处理。草甘膦施用剂量为0（清水对照）、225、450、900、1 800、3 600、7 200、14 400 g/hm2，每处理重复4次，喷雾后继续光暗交替培养，14 d后剪取各浓度处理植株地上部分称量鲜重。

将抗性与敏感种群牛筋草培养至5～6叶期，分别喷施草甘膦（1 800 g/hm2）及清水对照，在第1、3、5、7天，剪取地上叶片，参照娄远来等的方法［17］检测叶片中莽草酸的含量，并比较不同处理间的差异。

1.3 牛筋草中EPSPS扩增和测序

随机剪取20株抗性植株的新鲜叶片保存于-80℃冰箱。按照说明书的步骤使用试剂盒提取DNA，利用Primer 5.0设计引物扩增包含常见突变位点的EPSPS目的片段，长度为461 bp。上游引物为：5′AGATAAGAAGCAGCCGCCTT3′；下游引物为5′GCACTCCATCAAGCACATAACT3′。

PCR反应体系25 μL，包含2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，去离子水9.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次； 72℃ 7 min。

PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定之后送交生工生物工程（上海）股份有限公司测序，根据序列和峰图判断突变类型及纯合性。

1.4 牛筋草抗性和敏感种群中EPSPS基因表达分析

分别剪取8～10抗性植株与敏感植株的新鲜叶片保存至-80℃冰箱。利用常规方法提取叶片的RNA并反转录。利用Oligo 7.0设计EPSPS基因的荧光定量PCR引物，上游引物EF：5′CTGATGGCTG

CTCCTTTAGCTC3′；下游引物ER：5′CCCAGCTATCAGAATGCTCTGC3′。选取ALS基因作为内参基因，上游引物ALSF：5′GCAATTTCCCCAG

TGACGACC3′；下游引物ALSR：5′GCAAAAGCCTCTATCTTCCCTGT3′。利用常规方法绘制引物的标准曲线。利用2-△△Ct的方法检测靶标基因EPSPS的表达量，ΔΔCt=［（Ct待测靶标-Ct待测ALS）-（Ct敏感靶标-Ct敏感ALS）］［18］。

结果为待测植株EPSPS表达量相对于敏感植株EPSPS表达量的倍数。

1.5 酶联免疫试剂盒检测EPSPS含量

取0.1 g牛筋草葉片（抗性与敏感种群各检测10株）液氮研磨成粉末转移至1.5 mL离心管，加入250 mL样品提取液，振荡混匀离心取上清，待测。用2 mL样品提取液溶解EPSPS标准品配制成32 μg/L的溶液，梯度稀释制成16、8、4、2、1 μg/L标准溶液;将100 μL空白对照（样品提取液）/标准品/待测样品对应的上清加入微孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45 min;将孔内液体甩干、洗涤、拍干，重复3次;加入抗体工作液（100 μL/孔），轻轻振荡混匀，25℃避光孵育30 min;加入酶标抗体（100 μL/孔），振荡混匀，25℃避光反应45 min;加入显色剂（100 μL/孔），置于25℃避光反应15 min;加入终止液（100 μL/孔），轻轻振荡混匀;酶标仪测定每孔OD450 nm值。根据标准品的OD值绘制标准曲线;通过标准曲线和检测样品的OD值计算出待测样品中EPSPS的浓度［19］。

1.6 数据统计与分析

所得的数据通过统计软件SigmaPlot 12.0（Systat Software， San Jose， CA.）进行非线性回归拟合，模型为Y=C+（D-C）/［1+（X/X0）b］，式中Y代表鲜重抑制率，X代表处理剂量，X0代表GR50，b代表曲线在X0处的斜率，D代表待测指标上限，C代表待测指标下限［20］。抗性指数（RI）计算方法为疑似抗性种群的GR50与敏感种群GR50的比值。不同种群之间EPSPS基因的相对表达量、蛋白含量差异通过软件SPSS 13.0 （SPSS， Chicago， USA）分析。

2 结果与分析

2.1 疑似抗性和敏感牛筋草种群的抗性水平与莽草酸含量

随着草甘膦剂量的增加，抗性种群与敏感种群受抑制的程度明显不同。在900 g/hm2的剂量处理后14 d，抗性植株鲜重是对照植株的77.6%，敏感植株鲜重仅为对照的39.6%。当剂量达到1 800 g/hm2时，敏感植株全部死亡，而抗性植株的鲜重为对照植株的47.6%。草甘膦对抗性种群的GR50为2 053.0 g/hm2，抗性指数（RI）为5.0，表明该种群对草甘膦产生了中等水平的抗性（图1）。草甘膦1 800 g/hm2处理牛筋草植株后第5天，敏感种群植株的莽草酸浓度显著升高（345.7 μg/g，P<0.05），是抗性植株的2.2倍（图2）。抗性植株体内的莽草酸浓度与对照植株无显著差异（P>0.05）。

2.2 EPSPS基因的突变检测

从抗性种群中随机选取20株，敏感种群中选取10株牛筋草检测EPSPS基因保守区域是否存在突变。通过DNA测序得到的测序峰图判断突变位点的纯合性。结果表明，所检测抗性植株序列和峰图（图3）与敏感植株无差异，表明抗性植株的EPSPS核苷酸序列均未发生突变。

2.3 抗性和敏感牛筋草中EPSPS表达量分析

为明确抗性种群牛筋草植株中是否存在靶标基因EPSPS过表达，本研究检测了抗性与敏感种群中EPSPS基因的表达水平。结果表明，抗性种群植株中EPSPS的表达量显著增加，其相对表达量是敏感种群的47.4倍（图4）。

2.4 抗性和敏感牛筋草中EPSPS蛋白含量

为了确定EPSPS基因表达量的变化对酶含量

的影响，本研究利用研发的牛筋草EPSPS酶联免疫试剂盒检测了抗性和敏感种群中EPSPS蛋白含量，结果发现，抗性植株中EPSPS蛋白含量为3.3 μg/g，

是敏感植株的17.1倍。这表明EPSPS基因在抗性植株的过量表达导致了该蛋白浓度的升高（图5）。

3 结论与讨论

近10年来，国内多个科研机构对分布在华南地区果园、黄淮海及长江流域棉田等作物田的牛筋草种群进行了抗性检测。2012年就发现广东省果园牛筋草对草甘膦产生抗性［5］。近期又有报道广西壮族自治区甘蔗田牛筋草对草甘膦产生了较高水平的

抗性，可达109倍，甚至对莠去津等除草剂产生了多抗性［6］。黄河流域及长江流域部分棉田的牛筋草种群对草甘膦也产生不同程度的抗性，其中湖北地区部分种群的抗性指数可以达到14.4，湖南棉田部分种群的抗性水平可以达到10.2［7］。虽然不同报道使用的生物测定方法不一，但是均证实对草甘膦有抗性的种群已经产生。本研究发现位于三亚育种基地的牛筋草对草甘膦的抗性水平为5.0，属于中等水平抗性。

国内外大量研究发现，靶标基因EPSPS发生突变是杂草对草甘膦产生抗性的机制之一。发生氨基酸替换的位置常在106位，如P106S、P106T、P106A、P106L，与敏感种群相比，这些突变使杂草对草甘膦产生的抗性水平相对较低，抗性倍数在2～5之间。2015年，在马来西亚首次发现了发生双重突变（T102I和P106S）的抗性牛筋草，且抗性水平很高，可以在21 600 g/hm2的草甘膦剂量处理下存活［21］。随后在我国也发现了具有相同突变类型的牛筋草种群，对草甘膦也能产生较高水平抗性（抗性倍数可以达到13.4倍）［22］。EPSPS基因过量表达是另一种靶标抗性机制，EPSPS过表达与其在染色体上的拷贝数增加有关。目前报道的靶标扩增机制中EPSPS的相对拷贝数是可变的。如与敏感植株相比，长芒苋Amaranthus palmeri的拷贝数从2到160倍不等，而在地肤Bassia scoparia中，拷贝数低至2～9倍，大多数杂草EPSPS拷贝数与其表达量正相关［23］。另外，Zhang等

利用基因组测序分析证实EPSPS基因在染色体亚端粒位置发生了拷贝数扩增变异［24］。此外，

牛筋草EPSPS启动子片段长度的改变也显著提高了EPSPS在抗性种群中的表达量［25］。

随着草甘膦在我国登记应用范围的扩大，草甘膦的使用频率和使用量将有明显的提高。最新研究显示，我国玉米田牛筋草等主要禾本科杂草对草甘膦表现敏感［26］。切断抗草甘膦杂草向新登记应用作物田的传播是防止抗草甘膦杂草迅速蔓延的重要手段。在繁种基地的田埂等草甘膦已经长期使用的区域，可以采用不同作用方式的除草剂轮换应用除草，或采用物理除草、人工除草等方式，避免抗草甘膦杂草的产生，杜绝育种基地成为抗草甘膦杂草的潜在传播源头。

参考文献

［1］ HOLM L G， PLUCKNETT D L， PANCHO J V， et al. The worlds worst weeds： distribution and biology ［M］. Honolulu： University Press of Hawaii， 1977.

［2］ SONG Wenwen， QI Nawei， LIANG Chen， et al. First report of the southern rootknot nematode meloidogyne incognita on goosegrass （Eleusine indica） in China ［J/OL］. Plant Disease， 2019， 103（5）： 1045. DOI： 10.1094/PDIS09181498PDN.

［3］ MA Xiaoyan， WU Hanwen， JIANG Weili， et al. Goosegrass （Eleusine indica） density effects on cotton （Gossypium hirsutum） ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（9）： 17781785.

［4］ STEINRCKEN H， AMRHEIN N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5enolpyruvylshikimic acid3phosphate synthase ［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1980， 94（4）： 12071212.

［5］ 楊彩宏， 田兴山， 冯莉， 等. 牛筋草对草甘膦的抗药性［J］. 中国农业科学， 2012， 45（10）： 20932098.

［6］ LI Jingbo， ZHANG Zhiqian， LEI Qi， et al. Multiple herbicide resistance in Eleusine indica from sugarcane fields in China ［J/OL］. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2022， 182： 105040. DOI： 10.1016/j.pestbp.2022.105040.

［7］ 王新玲， 马小艳， 姜伟丽， 等. 不同棉区牛筋草对草甘膦的抗药性比较［J］. 中国棉花， 2016， 43（2）： 2731.

［8］ CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Glyphosate resistance in Eleusine indica： EPSPS overexpression and P106A mutation evolved in the same individuals ［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2020， 164： 203208.

［9］ DENG Wei， YANG Qian， CHEN Yongrui， et al. Cyhalofopbutyl and glyphosate multipleherbicide resistance evolved in an Eleusine indica population collected in Chinese directseeding rice ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2020， 68（9）： 26232630.

［10］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Investigating the mechanisms of glyphosate resistance in goosegrass （Eleusine indica （L.） Gaertn.） by RNA sequencing technology ［J］. Plant Journal， 2017， 89（2）： 407415.

［11］GAINES T A， ZHANG Wenli， WANG Dafu， et al. Gene amplification confers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010， 107（3）： 10291034.

［12］BAERSON S R， RODRIGUEZ D J， TRAN M， et al. Glyphosateresistant goosegrass. Identification of a mutation in the target enzyme 5enolpyruvylshikimate3phosphate synthase ［J］. Plant Physiology， 2002， 129（3）： 12651275.

［13］GE Xia， AVIGNON D A， ACKERMAN J J， et al. Vacuolar glyphosatesequestration correlates with glyphosate resistance in ryegrass （Lolium spp.） from Australia， South America， and Europe： a 31P NMR investigation ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（5）： 12431250.

［14］PAN Lang， YU Qin， HAN Heping， et al. Aldoketo reductase metabolizes glyphosate and confers glyphosate resistance in Echinochloa colona ［J］. Plant Physiology， 2019， 181（4）： 15191534.

［15］李香菊. 我國转基因耐除草剂作物研发与应用［J］. 现代农药， 2023， 22（1）： 510.

［16］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， WEI Shouhui， et al. Characterization of glyphosateresistant goosegrass （Eleusine indica） populations in China ［J］. Journal of Integrative Agriculture， 2015， 14（5）： 919925.

［17］娄远来， 邓渊钰， 沈晋良， 等. 甲磺隆和草甘膦对空心莲子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影响［J］. 植物保护学报， 2005， 32（2）： 185188.

［18］余舜武， 刘鸿艳， 罗利军. 利用不同实时定量PCR方法分析相对基因表达差异［J］. 作物学报， 2017（7）： 12141218.

［19］李志玲， 李香菊， 崔海兰， 等. 牛筋草EPSPS酶联免疫试剂盒的研发及应用［J］. 中国农业科学， 2022， 55（24）： 48514862.

［20］SEEFELDT S S， FUERST E P. Loglogistic analysis of herbicide doseresponse relationships ［J］. Weed Technology， 1995， 9（2）： 218227.

［21］YU Qin， JALAUDIN A， HAN Heping， et al. Evolution of a double amino acid substitution in the 5enolpyruvylshikimate3phosphate synthase in Eleusine indica conferring highlevel glyphosate resistance ［J］. Plant Physiology， 2015， 167（4）： 14401447.

［22］CHEN Jingchao， HUANG Hongjuan， ZHANG Chaoxian， et al. Mutations and amplification of EPSPS gene confer resistance to glyphosate in goosegrass （Eleusine indica） ［J］. Planta， 2015， 242（4）： 859868.

［23］GAINES T A， PATTERSON E L， NEVE P. Molecular mechanisms of adaptive evolution revealed by global selection for glyphosate resistance ［J］. New Phytologist， 2019， 223（4）： 17701775.

［24］ZHANG Chun， JOHNSON N A， HALL N， et al. Subtelomeric 5enolpyruvylshikimate3phosphate synthase copy number variation confers glyphosate resistance in Eleusine indica ［J］. Nature Communications， 2023， 14（1）： 4865. DOI： 10.1038/s41467023404076.

［25］ZHANG Chun， FENG Li， TIAN Xingshan. Alterations in the 5′ untranslated region of the 5enolpyruvylshikimate3phosphate synthase （EPSPS） gene influence EPSPS overexpression in glyphosateresistant Eleusine indica ［J］. Pest Management Science， 2018， 74（11）： 25612568.

［26］馬振杰， 谢家建， 李香菊， 等. 玉米田四种禾本科杂草对草甘膦的敏感性测定［J］. 中国生物防治学报， 2023， 39（6）： 13611372.

（责任编辑：杨明丽）