黑肩绿盲蝽的线粒体基因组结构

许常玉 刘玉娣 侯茂林

摘要

為研究黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis的谱系地理和遗传结构，本文测定并分析了其线粒体基因组全序列。结果表明：黑肩绿盲蝽线粒体基因组全长16 835 bp （GenBank登录号：OK149286），包括13个蛋白质编码基因（PCGs），22个tRNA基因，2个rRNA基因和1个非编码区，呈闭合双链环状DNA分子结构。线粒体基因组中A+T含量高达768%，G+C含量为232%，呈现明显的AT偏向性;13个蛋白质编码基因均以通用密码子ATN作为起始密码子;蛋白质编码基因中呈现出明显的氨基酸偏好性，异亮氨酸含量占比最高，为1078%;22个tRNA基因中有21个tRNA形成典型的三叶草式二级结构;系统发育树显示，盲蝽科的11个种聚为两大分支，黑肩绿盲蝽以99％的自展支持率位于其中的一个分支内。本研究结果将为黑肩绿盲蝽作为天敌昆虫来防治水稻害虫提供帮助。

关键词

半翅目; 盲蝽科; 黑肩绿盲蝽; 线粒体基因组; 系统发育

中图分类号：

S 4762

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2023215

Structure of the mitochondrial genome of Cyrtorhinus lividipennis Reuter （Hemiptera： Miridae）

XU Changyu， LIU Yudi*， HOU Maolin

（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In order to investigate phylogeography and genetic structure of Cyrtorhinus lividipennis， mitochondrial genome of C. lividipennis was sequenced and analyzed. The mitochondrial genome of C.lividipennis is a closed double stranded circular DNA with 16 835 bp in total length （GenBank accession noOK149286）， contains two ribosomal RNA （rRNA） genes， 22 transfer RNA （tRNA） genes， 13 proteincoding genes and a control region. Nucleotide composition of the mitochondrial genome is biased toward adenine and thymine （A+T） with an AT content of 768% and GC content of 232%. All 13 proteincoding genes （PCGs） start with a typical ATN initiation codon， showing obvious amino acid preference， and Ile is the most abundant amino acid （1078%）. 21 out of 22 tRNA genes form a typical cloverleaf secondary structure. The phylogenetic tree revealed that the 11 species of the family Miridae clustered into two major branches， and the C.lividipennis clustered in one of the branches with a bootstrap support value of 99%. The results will provide insights into the potential of C.lividipennis as a natural enemy insect for controlling rice pests.

Key words

Hemiptera; Miridae; Cyrtorhinus lividipennis; mitochondrial genome; phylogeny

黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis Reuter隶属于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae，为褐飞虱Nilaparvata lugens （Stl）、白背飞虱Sogatella furcifera （Horváth）和黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps （Uhler）等半翅目水稻害虫的重要捕食性天敌，主要捕食卵和低龄若虫。据报道，黑肩绿盲蝽对控制稻飞虱种群有重要作用，其对稻田褐飞虱卵的捕食比例约为30%，最高可达70%左右［13］。在飞虱和叶蝉类猎物不足时，黑肩绿盲蝽也可以捕食多种鳞翅目昆虫的卵和幼虫［45］。黑肩绿盲蝽分布范围广，在东南亚国家、太平洋群岛、日本、澳大利亚等水稻产区均有分布，在我国主要分布于华北、华东、西南及东南等水稻种植地区［67］。目前有关黑肩绿盲蝽的研究主要集中在形态学、捕食生物学和抗药性等方面［813］，全基因组测序分析能为我们研究多营养互作（寄主植物捕食者天敌）提供基因组信息，使我们能更好地运用天敌昆虫防治水稻害虫［14］。

线粒体是真核生物细胞中具有独立遗传物质和体系的半自主型细胞器。由于具有母系遗传、进化速率快以及易于PCR扩增等特点［15］，线粒体基因在研究分子进化、种群遗传结构和系统发生学分析等方面得到广泛应用［16］。昆虫线粒体基因组为共价闭合的环状DNA分子，长度13～19 kb，包括13个蛋白质编码基因（proteincoding genes， PCGs）、2个核糖体RNA基因（rRNA genes）、22个转运RNA基因（tRNA genes）和1个长的非编码区（又称为控制区或AT富含区）［16］。为了给黑肩绿盲蝽的谱系地理及遗传结构相关研究提供更加丰富的分子标记工具，从而充分发挥其作为天敌昆虫控制水稻害虫的作用，本研究通过二代高通量测序技术组装了黑肩绿盲蝽线粒体基因组的全序列，分析了其碱基组成、密码子使用情况、预测分析了tRNA结构、并基于线粒体基因组13个蛋白编码基因构建了盲蝽科的系统发育树。研究结果一方面可以丰富盲蝽科线粒体基因组的数据，为从线粒体基因组水平分析盲蝽科的系统发育关系提供信息;另一方面将为黑肩绿盲蝽的谱系关系研究提供有力工具，从而可以更好地发挥其在不同稻区的生物防治作用。

1 材料与方法

1.1 供试虫源和DNA提取

黑肩绿盲蝽采自农业农村部桂林作物有害生物科学观测实验站的稻田（25°36′ N， 110°40′ E）。样本于－80℃冰箱保存备用。挑取20只黑肩绿盲蝽成虫，使用DNeasy DNA Extraction Kit（Qiagen， Hilden， 德国）提取混合样本的总DNA，提取方法参照试剂盒说明书。使用DeNovix DS11超微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的质量和浓度。

1.2 线粒体基因组分析

将质量合格的黑肩绿盲蝽基因组总DNA送至北京诺禾致源科技股份有限公司，构建小片段文库和高通量测序。采用Illumina NovaSeq 6000平台进行双末端测序（pairedend sequencing），测序长度为150 bp。对测序数据进行整理，截除测序接头以及引物序列，过滤掉质量较低的reads，并去除N含量大于5%的reads，获得clean data数据集［1617］。然后使用宏基因组组装工具IDBA 113对clean data数据集进行组装校正［19］，获得黑肩绿盲蝽线粒体基因组全长序列。得到完整的线粒体基因组序列后，再利用线粒体在线注释工具MITOS （http：∥mitos.bioinf.unileipzig.de/index.py）和ORF Finder（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對组装好的序列进行注释。

1.3 系统发育分析

从NCBI中下载半翅目盲蝽科昆虫的线粒体全基因组，共11个。选取其中13个蛋白质编码基因的核苷酸序列，以鳞翅目水稻害虫二化螟Chilo suppressalis和稻蛀茎夜蛾Sesamia inferens作为外群，采用最大似然法（maximum likelihood， ML）和贝叶斯法（Bayesian inference，BI）构建系统发育树。利用Clustal X对核苷酸序列进行比对后［20］，用MEGA 60软件和MrBayes软件分别构建ML和BI系统发育树，计算各分支节点的bootstrap置信值（重复计算1 000次）。

2 结果与分析

2.1 黑肩绿盲蝽线粒体基因组结构

黑肩绿盲蝽线粒体基因组序列全长16 835 bp （GenBank登录号：OK149286），共由37个基因组成，包括13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个tRNA基因和2个rRNA基因，呈闭合双链环状DNA分子结构（图1）。通常将多数编码基因所在链定义为主要编码链J链（majority strand， Jstrand），将另外一条链定义为次要编码链N链（minority strand， Nstrand）。黑肩绿盲蝽线粒体基因组中J链编码23个线粒体基因，包括14个tRNA基因（trnI， trnM， trnW， trnL1， trnK， trnD， trnG， trnA， trnR， trnN， trnS1， trnE， trnT， trnS2）和9个蛋白质编码基因（COX1， COX2， COX3， ATP8， ATP6， ND2， ND3， ND6， CYTB）;N链编码14个线粒体基因，包括8个tRNA基因（trnQ， trnY， trnC， trnF， trnH， trnP， trnL2， trnV）、4个蛋白质编码基因（ND1， ND4， ND4L， ND5）和2个rRNA基因（rrn12， rrn16）。此外，N链还包括1个2 378 bp的非编码区。

黑肩绿盲蝽线粒体基因组中有20处基因无重叠和间隔现象;有11处基因发生重叠，各重叠部分序列长度差异不大，其中最长重叠序列在trnW和trnC之间，长为8 bp，总共重叠序列长34 bp;有6处基因有间隔，最长间隔序列位于基因trnS2和ND1之间，长为7 bp，总共间隔序列长16 bp（表1）。

2.2 黑肩绿盲蝽线粒体基因组核苷酸组成

黑肩绿盲蝽线粒体全基因组中A、C、G、T含量分别为432%、130%、102%、336%。A+T总量高达768%，AT偏斜值（ATskew）为013，G+C含量为232%，GC偏斜值（GCskew）为-012，呈现明显的AT偏向性。在蛋白质编码基因序列中，T碱基的使用频率高于A碱基，除COX3和ND3两个蛋白质编码基因的AT偏斜值为负值外，其余11个蛋白质编码基因及22个tRNA基因和2个rRNA基因的AT偏斜值均为正值;GC偏斜值，只有J链tRNAs和整体的蛋白质编码基因（PCGs）为正值，13个蛋白质编码基因（ND2， COX1， COX2， ATP8， ATP6， COX3， ND3， ND5， ND4， ND4L， ND6， CYTB， ND1）和N链tRNAs及2个rRNA基因均为负值（表2）。

2.3 黑肩绿盲蝽线粒体基因组蛋白质编码基因

黑肩绿盲蝽线粒体的13个蛋白质编码基因均以通用密码子ATN作为起始密码子。其中7个蛋白质编码基因（ND2， ATP8， ATP6， ND4L， ND6， CYTB， ND1）使用了标准终止密码子TAA，其余6个基因（COX1， COX2， COX3， ND3， ND5， ND4）均以不完全终止子T作为终止密码子（表1）。

根据相对同义密码子使用频率（relative synonymous codon usage， RSCU）可以看出黑肩绿盲蝽线粒体基因组中密码子使用频率具有明显的偏向性，比如TTA、ATT、ATA、TTT、TCA密码子的使用频率较高（图2）。蛋白质编码基因中异亮氨酸（Ile）含量占比最高，为1078%，半胱氨酸（Cys）占比最低，为123%，表明黑肩绿盲蝽蛋白质编码基因中呈现出明显的氨基酸偏好性（图2）。

2.4 黑肩绿盲蝽线粒体基因组rRNA和tRNA基因

黑肩绿盲蝽线粒体基因组有2个rRNA基因（rrn16和rrn12），都位于N链。其中rrn16位于trnL2和trnV之间，长1 231 bp，AT含量788％，rrn12位于trnV和非编码区之间，长761 bp，AT含量781%。

黑肩绿盲蝽线粒体基因组的22个tRNA基因的长度在62～70 bp。在预测得到的tRNA基因的二级结构中，除trnS1（GCU）因DHU臂缺失不能形成典型的三叶草式二级结构外，其余21个tRNA都形成典型的三叶草式二级结构。典型的AU和GC配对存在于22个tRNA基因的二级结构中，此外，共发现错配tRNA 14个，共24处，均为GU错配（图3）。

2.5 系统发育分析

利用最大似然法和贝叶斯法构建了基于盲蝽科11个种的13个蛋白编码基因的系统发育树，两种建树方法结果一致，本研究列出了最大似然法的建树结果（图4）。聚类结果显示，作为外群的二化螟和稻蛀茎夜蛾以100%的自展支持率聚在了一起，盲蝽科11个种聚为两个大的分支。第一个大分支包含苜蓿盲蝽属Adelphocoris、淡盲蝽属Creontiades、后丽盲蝽属Apolygus、草盲蝽属Lygus和嗜卵盲蝽屬Cyrtorhinus。第二大分支包括了跳盲蝽属Halticus和烟盲蝽属Nesidiocoris。黑肩绿盲蝽以99%的自展支持率聚在第一个大分支内。系统发育树各分支置信值较高，系统发育关系可信度较高（图4）。

3 结论与讨论

盲蝽科的一些种类为捕食性昆虫，如黑肩绿盲蝽、异须微刺盲蝽Campylomma diversicornis、食虫齿爪盲蝽Deraeocoris punctulatus、烟盲蝽Nesidiocoris tenuis、中华微刺盲蝽Campylomma chinensis等，它们作为天敌昆虫在生物防治中发挥着巨大的作用［2124］。由于盲蝽体型小且体色多样，对于形态相似的种类或者室内保存时间较长的样本形态鉴定上存在困难时，可以借助线粒体基因作为辅助手段进行分子鉴定。另外黑肩绿盲蝽与其主要猎物褐飞虱、白背飞虱等有同步伴迁迁飞现象［2526］，所以作为天敌昆虫防控水稻害虫是很有效的。线粒体基因在天敌昆虫捕食猎物的分子生态学研究中具有重要作用，因此黑肩绿盲蝽线粒体基因序列的研究能够为其捕食功能的研究提供帮助。

本研究测得黑肩绿盲蝽线粒体全基因组序列长为16 835 bp，为典型的闭合双链环状DNA分子。

基因组的AT含量高达768%，蛋白质编码基因序列AT含量高达758%，呈现明显的AT偏向性，与昆虫线粒体基因组中AT含量偏向性的特征一致［2731］。在密码子的使用上，盲蝽科偏好使用ATN作为起始密码子，终止密码子使用频率较高的是TAA和T［32］。本研究中黑肩绿盲蝽起始密码子均为ATN，没有发现TTG和GTG起始密码子，终止密码子全部使用TAA以及不完全终止密码子T，与盲蝽科其他种的密码子使用具有相似的特性。而其他半翅目物种密码子的使用有别于盲蝽科物种，比如蝽科Pentatomidae昆虫的线粒体蛋白质基因编码序列除了ATN还会选择TTG作为起始密码子［33］，长蝽科Lygaeidae小长蝽Nysius ericae的cob基因编码序列以TAG作为终止密码子，且没有不完全终止密码子［34］。线粒体基因组中核苷酸组成会影响蛋白质中的氨基酸组成［35］，本研究中黑肩绿盲蝽线粒体基因组RSCU值表明，使用频率较高的同义密码子大部分以A/T结尾，与盲蝽科其他物种一致［32］，蝽科和网蝽科Tingidae昆虫也有具有此特征［27，34］。

黑肩绿盲蝽线粒体基因组22个tRNA基因除了trnS1（GCU）由于DHU臂缺失不能形成典型的三叶草式二级结构外，其余21个tRNA都形成了典型的三叶草式二级结构，trnS缺失DHU臂的现象在其他昆虫中也有报道［3639］。昆虫线粒体基因组的大多数tRNA具有典型的三叶草式二级结构，但也有例外，如高桥仁蚧Aclerda takahashii线粒体全基因组中有12个非典型的tRNA结构［40］。蛛形纲甜果螨Carpoglyphus lactis和伯氏嗜木螨Caloglyphus berlesei都仅有1个tRNA的二级结构能折叠成典型的三叶草结构［4142］。

系统发育树分析显示，盲蝽科11个线粒体基因组序列聚为两个大分支，黑肩绿盲蝽以99%的自展支持率聚在其中的一个大分支内。由于盲蝽科线粒体全基因组数据有限，构建的系统发育树仅能反映出大致的谱系关系，随着盲蝽科线粒体全基因组数据资源的不断丰富，基于线粒体全基因组构建的系统发育树将更加全面精确。

本研究测定了黑肩绿盲蝽的线粒体基因组全序列，明确了黑肩绿盲蝽线粒体基因的结构和组成。研究结果为探究黑肩绿盲蝽的谱系结构和利用其进行生物防治打下了基础，也为盲蝽科线粒体基因组分析和研究提供了信息。

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