水蛭抗凝活性检测两种滴定方法比较

王文祎 赵卫涛 孙希 杨金申 杨瑶珺

【摘 要】

目的：比較药典标准凝血酶滴定法和白瓷板法对中药水蛭抗凝活性检测结果的影响。方法：分别采用《中国药典》中凝血酶滴定法和云南省《菲牛蛭冻干粉中药饮片炮制规范征求意见稿》中白瓷板法对水蛭抗凝活性进行多次平行滴定实验。结果：抗凝活性成分含量较高的菲牛蛭其药典法滴定结果重复性更稳定，白瓷板滴定法结果的重复性会随着单次进样量减少而趋于稳定；宽体金线蛭的抗凝活性结果在两种方法的对比检测下均较为稳定。结论：对于吸血水蛭品种抗凝活性的测量，建议保留原凝血酶滴定法；对于抗凝活性较低，实验中凝血酶溶液浓度较小的水蛭品种，两种滴定法均适用，也可同时应用互相验证。另在滴定操作中，将反应试管改换成玻璃液相进样瓶，且在滴定动作后将反应容器呈一定角度倾斜放置，有助于对反应终点进行判断，提高实验结果的准确性和稳定性。

【关键词】

水蛭；菲牛蛭；白瓷板滴定法；抗凝活性

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）07-0023-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.07.zgmzmjyyzz202407006

Comparison of Two Titration Methods for Detecting the Anticoagulant Activity of Hirudo

WANG Wenyi1，2 ZHAO Weitao2 SUN Xi1 YANG Jinshen2 YANG Yaojun1*

1.School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China；

2. Hollzhipharm （Yunnan） Co.， Ltd， Kunming 650199 China

Abstract：

Objective To compare the effect of pharmacopeia standard thrombin titration and white porcelain plate method on the anticoagulant activity of leech. Methods The thrombin titration method in the Chinese Pharmacopoeia and the white porcelain plate method in the Opinions Draft of Processing Specifications for Poecilobdella Manillensis Lesson. Freeze-dried Powder of Traditional Chinese Medicine in Yunnan Province were used to conduct several parallel titration experiments on the anticoagulant activity of leech. Results The repeatability of the pharmacopeia titration results of Poecilobdella Manillensis with higher content of anticoagulant active ingredients was more stable. The repeatability of the titration results of the white porcelain plate titration was regional stable with the decrease of the single injection volume. The results of anticoagulant activity of the Whitmania pigra Whitman. are stable under the comparison of the two methods. Conclusion For the measurement of anticoagulant activity of blood-sucking leech varieties， it is recommended to retain the thrombin titration method in the Chinese Pharmacopoeia. For leech species with low anticoagulant activity and small thrombin solution concentration in the experiment， both titration methods are applicable， and mutual verification can also be applied at the same time. In addition， in the titration operation， the reaction test tube was changed into a glass liquid injection bottle， and the reaction container was placed at a certain Angle after the titration operation， which was helpful to judge the reaction end point and improve the accuracy and stability of the experimental results.

Keywords：

Hirudo; Poecilobdella Manillensis Lesson.; White Porcelain Plate Titration Method; Anticoagulant Activity

中药水蛭为水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭，Whitmania pigra Whitman.）、水蛭（日本医蛭，Hirudo nipponica Whitman.）或柳叶蚂蟥（尖细金线蛭，Whitmania acranulata Whitman.）的干燥全体［1-2］；菲牛蛭为医蛭科动物菲牛蛭（马尼拟医蛭，Poecilobdella Manillensis Lesson.）的干燥全体［2-3］，被《云南省中药材标准》（云YNZYC-0357-2013）和《广西壮族自治区瑶药材质量标准》［4］（DYB45-GXYYC0106-2021）收录，其冻干粉炮制品又被《云南省中药饮片标准》（云YBPZ-0199-2013）［5］收录。以上4种水蛭均有破血痛经、逐瘀消癥等功效，是我国目前使用较为普遍的活血化瘀中药品种。

为评价水蛭活血化瘀能力，中国药典和地方标准均以抗凝血酶活性作为评价指标，其含量测定方法均参照1970年Markwardt报道的凝血酶测定法［6］制定，其原理是根据1个单位水蛭素抗凝血酶活力中和1个单位凝血酶测得样品中所含水蛭素量。该方法简单经济、反应迅速、终点敏锐。但对于终点判断的主观性较强，导致其准确度和重复性不够理想。万明等［7］提出以白瓷板作为滴定载体，其终点结果更易观察；刘义梅等［8］通过两种方法的对比实验，认为白瓷板滴定法结果更为准确，且样品浓度、凝血酶浓度、滴定间隔时间等因素对于检测结果均有影响。张利等［9-10］考察了待测样品提取方式、提取温度、供试液pH值等因素对结果的影响，且通过限定反应时间。滴定后搅动次数更精细化了滴定操作过程细节以提升实验结果的准确性和客观性。而云南省食品药品监督管理局在2022年10月发布的《菲牛蛭冻干粉中药饮片炮制规范征求意见稿》中，关于菲牛蛭冻干粉抗凝活性物质的滴定载体也由药典的试管修改为白瓷板。以上一系列的研究与改进均说明药典标准滴定方法，影响其结果的因素较多，改进的空间较大。

本实验以宽体金线蛭药材和菲牛蛭冻干粉为样品，参照《中国药典》和云南地标的滴定法，以及云南2022年发布的“征求意见稿”改进后的白瓷板法，对两种滴定方法进行考察，并对其反应现象进行分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器 数显恒温水浴锅（HH-4，上海力辰邦西仪器科技有限公司）；电子天平（FA2004 d=0.0001 g，上海浦春计量仪器有限公司）；pH值测量仪（PH-100，浙江力辰仪器科技有限公司）；超声仪（DK-80 上海致高精密仪器有限公司）；移液器（100～1000μL，0.5～10μL，艾本德公司）。

1.2 材料 菲牛蛭冻干粉［样品1，华治医药（元江）有限公司提供；样品2，云南玉药生物制药有限公司提供］；蚂蟥（宽体金线蛭）药材（样品3，安国药材市场购买，北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定）；纤维蛋白原（批号：140626-202012，中国食品药品检定研究院）；凝血酶（批号：140625-202013，每瓶含凝血酶1070 U，中国食品药品检定研究院）；盐酸（西陇化工股份有限公司）；三羟甲基甲烷（上海韶远试剂有限公司）；氯化钠（上海易恩化学技术有限公司）；纯化水。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备 取供试品粉末（过三号筛），宽体金线蛭取样约1g（本实验实际取样量为1.0000g），菲牛蛭冻干粉取样约0.25g（本实验实际取样量为样品1取样0.2496g，样品2取样0.2495g），精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液，宽体金线蛭加入5mL，菲牛蛭加入15mL，超声提取30 min，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 测定法

2.2.1 药典标准测定法 精密量取续滤液100μL，置试管中，加入含0.5%纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基盐酸缓冲液［注1］（临用配制）200μL，摇匀，置水浴中（37±0.5）℃温浸5min，滴加凝血酶溶液［注2］（临用配制，宽体金线蛭滴加浓度为每1mL中含10单位的凝血酶溶液，每4min滴加2μL；菲牛蛭滴加浓度为每1mL中含40单位的凝血酶溶液，每1min固定滴加2～5μL），边滴加边轻轻摇匀至凝固（或有凝固物出现），记录消耗凝血酶溶液的体积，按公式［注3］计算。

2.2.2 白瓷板滴定法 将白瓷点滴板浸于37℃水浴中，精密加入供试品溶液100μL与含0.5%纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液［注1］（临用配制）200μL，用搅拌针轻轻搅动摇匀，滴加每凝血酶溶液［注2］（临用配制，宽体金线蛭滴加浓度为每1mL中含10单位的凝血酶溶液，每4min滴加2μL；菲牛蛭滴加浓度为每1mL中含40单位的凝血酶溶液，每1min固定滴加2～5μL），并用搅拌针轻轻搅动摇匀，以最后加入凝血酶溶液混匀反应1 min后，用搅拌针能挑到丝状或块状凝固物为滴定终点（凝血酶溶液滴定体积控制在10～30μL內，反应时间控制在10 min以内，如不在此范围内应重新稀释样品或换管重滴），记录消耗凝血酶溶液的体积。按公式［注3］计算。

［注1］三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液的配制：取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25mL，与0.1mol/L盐酸溶液约40mL，加水至100mL，调节pH值至7.4。

［注2］凝血酶溶液的配制：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1mL含凝血酶10个（滴定宽体金线蛭）或40个（滴定菲牛蛭）单位的溶液。

［注3］水蛭抗凝活性计算公式如下：

U=C1V1/C2V2

U为每1g样品含抗凝血酶活性单位，U/g；

C1为凝血酶溶液的浓度，μ/mL；

C2为供试品溶液的浓度，g/mL；

V1为消耗凝血酶溶液的体积，μL；

V2为供试品溶液的加入量，μL；

中和1个单位的凝血酶的量，为1个抗凝血酶活性单位（U）。

3 结果与讨论

本实验对菲牛蛭样品在滴定过程中均进行了进样量分别为5μL、4μL、3μL、2μL的尝试，两种滴定法对水蛭抗凝活性检测结果详见下表1。

3.1 菲牛蛭标准滴定法实验分析 从两个菲牛蛭冻干粉样品的滴定结果来看，在同一人的操作前提下，药典标准滴定法的结果重复性较好。本实验除样品2单次进样量为5μL只做了2次平行外，2个冻干粉样品其余单次进样量均做了6次平行，且每种进样量的平行结果相同，说明同一人操作时，每次实验其对于反应终点判断标准基本趋同。且本实验法待测样品反应时的结果呈现比较典型稳定，因此每个样品相同进样量的不同次实验其结果均一致，但纵向比较同一样品不同进样量的检测结果又发现，样品最终抗凝活性结果差异很大，样品1的最大最小值差可达约96个活性单位；样品2则达到约120个活性单位。笔者认为，菲牛蛭这个品种的抗凝血活性本身很高，根据中国药典的规定，不吸血的宽体金线蛭（蚂蟥）和尖细金线蛭（柳叶蚂蟥）的抗凝活性不得低于3U/g，日本医蛭（水蛭）不得低于16U/g，而现行云南标准对与菲牛蛭药材活性要求则是不低于60U/g，对于菲牛蛭冻干粉则不低于200U/g。新規征求意见稿更是将标准提高到不低于240U/g，并将700U/g作为活性上限。为在较短时间内尽快得出结果，在实验中用来滴定反应的凝血酶溶液浓度较高，且制备供试液时样品提取液较为稀释。以云南现行标准单次进样量为5μL为例，每滴定1次，即需要中和120U的凝血酶，这个数值的浮动空间是很大的。本实验在5μL滴定2次，即中和掉240 U的凝血酶溶液后，尚未达到终点，滴定3次后才出现凝固，说明样品待测液活性在240～360U/g之间，同理，在进样量为4μL、3μL、2μL时，样品1的活性结果误差区间分别在约288～384U/g、216～288U/g、240～288U/g。随着单次进样量的减少，结果浮动范围越小，结果相对稳定，但滴定次数和实验时间会相应延长，根据之前的研究结论来看，又会对实验结果产生一定影响，这或许解释了本实验中样品1在单次进样量为4μL时，滴定3次并未出现凝固，而进样量为3μL、2μL时，随着反应时间延长，终点也发生变化的现象。同理样品2在进样量为4μL和3μL与2μL时的终点差异也是因反应时间的延长而产生的影响。

3.2 菲牛蛭白瓷板滴定法实验分析 从本实验的结果来看，每个进样的平行实验中，均有判定终点到来时滴定次数不一致，即消耗凝血酶单位数量不相同的情况发生，且单次进样量越多，平行结果的标准差越大，实验结果越不稳定。同时横向对比药典标准中滴定法来看，单次进样量越多，两种方法的滴定结果差异越大。

分析其差异原因，笔者认为，药典标准方法是在试管中进行反应，液面表面积较小，滴定动作后通过振摇的方式能迅速且均匀地将浓度较大的凝血酶溶液稀释分散到供试液中，客观因素也提升了本法在平行检测过程中的稳定重现性；而白瓷板本身较浅，供试液在白瓷板中表面积较大，滴定后又需要较尖细的搅拌针来辅助分散，从单人操作的层面就已经增加了难度。用细针分散混匀的效率本不及振摇，且笔者在实验操作中发现，浓度较高的凝血酶溶液在滴入白瓷板供试液时，会出现供试液于凝血酶注入区域迅速产生结块或丝状物，从而导致实验终点因“假阳性”现象而提前出现，而根本原因可能仅仅是搅拌不够及时与均匀，或滴定瞬时局部浓度太高未来得及分散形成的凝结。而两个菲牛蛭样品白瓷板实验数值随着单次进样量的减少，其标准差也随之减小，平行结果趋于稳定的结果也同样可用上述分析进行解释。

另一方面，纤维蛋白原结构也有其特殊性，在药典滴定方法中，若对供试液进行剧烈摇晃，则可能会破坏其原有内部结构，提前出现液体浑浊或不再随着凝血酶溶液的添加而凝固，因此不论是纤维蛋白原溶液在配制过程中，还是与凝血酶溶液解除后的振摇混匀，都要求实验人员要动作缓慢，幅度小，力道轻，以避免实验结果失真。而白瓷板滴定法则需要工具介入到反应液内进行搅拌，这个过程是否会对供试液原有结构进行破坏，进而导致实验结果不稳定或不准确，也有待进一步验证。

3.3 宽体金线蛭两种滴定方法的实验结果对比 通过实验结果不难看出，两种滴定方法对于抗凝活性较低的宽体金线蛭几乎没有影响，分析原因如下。

首先，宽体金线蛭的供试液浓度高。通过前文，宽体金线蛭和菲牛蛭供试液提取条件可看出，宽体金线蛭的取样量为1g，是菲牛蛭的4倍；提取溶剂添加量为5mL，为菲牛蛭的1/3，供试液的浓度已相差12倍。此外，滴定时药典规定宽体金线蛭对供试液滴加的凝血酶溶液浓度为10 U/mL，是菲牛蛭的1/4，且单次规定进样量为2μL，是菲牛蛭现行标准的2/5，在反应环节每滴定一次中和凝血酶的量又与菲牛蛭相差10倍，综合整个实验流程，两个品种的实验浓度相差120倍。供试液与凝血酶溶液的浓度反差也使两种方法下的实验结果产生不稳定性的概率增加，因此相比之下，宽体金线蛭的药典标准滴定法和白瓷板滴定法结果均较稳定且一致。

3.4 白瓷板滴定法的发展 一般说到中药水蛭白瓷板滴定法，大多会追溯到万明等［7］2012年发表的文献，其本身是为比较几种对中药水蛭不同提取方式对其抗凝活性的影响，并辅以APTT（活化部分凝血活酶时间）试剂盒法进行验证；2014年刘义梅等［8］将白瓷板法与药典操作进行对比，还进一步考察可能影响检测结果的因素，如滴定间隔时间、凝血酶浓度等，完善了滴定体系。以上研究成果为白瓷板法运用到水蛭抗凝活性效价的检测奠定了基础，但文献均是以供试液凝固的时长作为比较指标，并未体现出药典法对抗凝活性单位的直接判断，且供试液制备过程时间长、步骤多，并不能较快速地对一批样品进行处理并得出结果。2017年张利等［9-10］学者的研究将药典中供试液的制备方法和抗凝活性评价指标引入白瓷板法，并通过对影响因素的考察较为直观地便显出两种滴定方法在检测结果上的差异，提出操作改进建议。2022年云南省“征求意见稿”也将药典凝血酶滴定法改为白瓷板法，并通过调整凝血酶溶液进样量、限定实验反应时间等方式力求检测结果的准确性。

3.5 关于水蛭抗凝活性检测的建议 本实验对同一样品的两种滴定方法进行了较多重复次数的实验，从结果看，针对抗凝活性较高且实验中凝血酶溶液浓度较大的菲牛蛭来说，白瓷板滴定法的稳定性相比于药典标准中滴定法较低。

一些研究认为原药典方法的反应终点难以判断，笔者经过较多次实验对比发现，造成这个问题的原因主要在于实验反应的载体和操作中的一些细节。原法在试管中进行反应，而试管也有材质之分。笔者通过实验观察到，塑料材质试管，因试管壁较厚，且内径较窄，供试液在管内张力较大，会影响对其流动性的判断，再加之所料材质的透明度较差，会综合影响笔者从试管壁外观察供试液是否有凝固的效果。相较于塑料材质，管壁较薄且透明度好的玻璃试管观察效果更佳，但同样因为内径较细，从直立到倾斜判断其流动性的观察过程也会受到张力的影响而失真。

研究认为，将反应容器替换成平底的2mL左右大小的玻璃液相进样瓶为宜。相较于圆底的试管，在液相进样瓶中反应会增加液体在底部的平展空间，一定程度还原了供试液的流动性，同时在滴入凝血酶溶液并摇匀后，建议将反应容器呈一定角度倾斜放置，下次滴定前先将容器直立判断是否有凝固，这样凝固初期的一些“挂壁”现象或供试液流动性显著降低的状态就会相对敏锐地被实验人员捕捉到，也一定程度简化了判断标准，提高了实验准确性与效率。

3.6 小结 综合以上实验结果和分析，笔者认为当凝血酶溶液浓度较高时，白瓷板滴定法会因滴入凝血酶溶液瞬间使供试液局部浓度过高而导致“假阳性”凝固出现而影响检测结果，故建议在检测吸血品种菲牛蛭和日本医蛭时，仍保留现行药典标准滴定法为主要测定方法，并结合前文操作改进方法，提升结果准确度与稳定性。若采取白瓷板法，则减少单次进样量或降低凝血酶溶液浓度，且通过多次平行实验得到相对稳定的结果。而不吸血的宽体金线蛭和尖细金线蛭本身抗凝活性较低，且滴定溶液凝血酶含量较低，故两种方法均适用。为提升检测结果准确度，也可通过同一份样品的两种滴定方法互为验证。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］. 北京：中国医药科技出版社，2020：85.

［2］杨潼.中国动物志-环节动物门-蛭纲 ［M］.北京：科学出版社，1996：120-122.

［3］云南省食品药品监督管理局. 云YNZYC-0357-2013，菲牛蛭 ［S］. 昆明：云南科技出版社，2013.

［4］广西壮族自治区省食品药品监督管理局. DYB45-GXYYC0106-2021，金边蚂蟥 ［S］. 南宁：廣西科技出版社，2021.

［5］云南省食品药品监督管理局. 云YBPZ-0199-2013，菲牛蛭冻干粉［S］. 昆明：云南科技出版社，2013.

［6］MARKWARDT F. Hirudin as an inhibitor of thrombin ［J］. Methods Enzymol，1970（19）：924-932.

［7］万明，汪蜜，刘义梅，等.宽体金线蛭抗凝血活性物质的提取方法［J］.中国医院药学杂志，2012，32（6）：414-417.

［8］刘义梅，喻珊，崔瑞勤，等.凝血酶滴定法测定宽体金线蛭抗凝血活性的影响因素［J］.中国药师，2014，17（5）：789-793.

［9］张利.菲牛蛭的含量测定方法改进及检测中的注意事项［J］.云南中医中药杂志，2017，38（3）：71-73.

［10］张利，李志远，风云昉.凝血酶滴定法测定云南菲牛蛭中水蛭素含量的改进研究［J］.云南中医学院学报，2017，40（1）：70-73.

（收稿日期：2023-07-14 编辑：陶希睿）

基金项目：

作者简介：

王文祎（1990—），男，汉族，博士研究生在读，研究方向为动物药安全性评价、民族动物药。E-mail：13511026431@163.com

通信作者：

杨瑶珺（1969—），女，汉族，博士，教授、博士生导师，研究方向为中药品种及质量鉴定、动物类中药的安全性研究。E-mail：yangyaojunbucmtcm@163.com