脂肪干细胞基质胶在糖尿病创面治疗中的研究进展

任永恒综述,苗春雷,白 南,陈远征审校

0 引 言

据统计,2021年全球已有5.29亿人患有糖尿病,到2050年这一数字将达到13.1亿[1]。在糖尿病高糖微环境下,内皮细胞的增殖迁移活性降低、胶原蛋白合成功能障碍和生长因子抵抗共同导致上皮形成能力下降,从而引起糖尿病创面长期迁延不愈[2-3]。糖尿病创面的常规治疗方法主要有加强临床护理、降低局部压力、改善微循环和控制炎症反应等[4-5],但这些方法并不能从根本上解决问题,且远期效果并不理想,所以探讨更高效的促进糖尿病创面愈合的方法成为研究热点[6]。干细胞疗法已被证明在慢性创面治疗上发挥了重要作用,其中治疗效果比较好的干细胞为脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)[7],因其具有获取方便、储备量大和增殖速度快等优势,常被用于组织的再生和修复[8],然而干细胞在体内表现出存活率低、致瘤性和异质性等问题[9-10],因此其移植治疗一直存在争议,所以需要寻找一种新的风险较低的治疗方法。脂肪细胞外基质/基质血管组分凝胶(adipose extracellular matrix/stromal vascular fraction gel,SVF-gel)作为近年来新兴的脂肪组织衍生物开始被广泛研究,因其中包含的高密度细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基质血管组分(stromal vascular fraction,SVF)等多种生物活性物质在难愈性创面的修复中得到了明确应用,使得SVF胶成为治疗糖尿病创面的新颖疗法之一。本文就SVF胶治疗糖尿病创面的作用机制及其应用作一综述。

1 SVF胶

1.1 SVF胶制备在无菌条件下,Yao等[11]采用吸脂的方法将所获取的脂肪组织在冰水混合物中静置,弃去液体层后置入离心机中,以1200×g离心3 min后静置,去除最下层无用液体,保留最上层油脂及中间层脂肪。取2个10 mL注射器,用鲁尔连接器(Luer-Lok connector)连接两个注射器口,达到密封对接。置入第一步离心后的中间层脂肪,推动含有脂肪组织侧的注射器活塞,以10 mL/s的恒定速度将脂肪组织通过连接器推注至对侧注射器中,如此反复推注约2 min。推注完成后,两注射器同时回抽形成真空负压状态,充分破碎脂肪组织,直至脂肪颗粒成絮凝状、蛋花样即可。再经纳米过滤器过滤掉多余的结缔组织,加入第一步离心所保留的最上层油脂后混合,再次置于离心机中,以2000×g离心3 min后静置,中间层黏性凝胶状物即为所需的SVF胶。

1.2SVF胶成分用胶原酶等相关酶消化剪碎的成熟脂肪组织,可得到一种独特的、不含脂肪细胞的异质性细胞混合物,称为SVF。SVF是一个复杂的细胞系统,不仅包括ADSCs,还包括内皮细胞、红细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞和周细胞等[12]。SVF胶的制作加工过程是通过简单的物理方法对成熟脂肪组织进行破碎和离心,高度浓缩了ECM和SVF等活性成分,其有核活性细胞数量约为4.56×105cells/mL,显著高于纳米脂肪的4.12×104cells/mL[13],虽然最终产物在体积上被高度浓缩为初始的十分之一,但具备了高功能的细胞密度。置于电镜下观察时,其内可见大小不等的细胞及部分脂肪组织结构均匀分散,在浓缩的ECM支架上附着大量SVF细胞以及破裂的成熟脂肪细胞壁和毛细血管碎片[14]。此外,相比于含有同等SVF细胞数的Coleman脂肪而言,SVF胶中浓缩的ECM(其中包含胶原蛋白、纤维蛋白和弹性蛋白等)更多,在调节细胞行为、刺激细胞增殖、激活细胞分化潜能及促进生长因子分泌的同时,可使细胞免于巨噬细胞的吞噬[11],从而起到了为ADSCs等活性细胞提供适宜生存微环境的作用。

2 SVF胶活性成分修复糖尿病创面机制

2.1 ADSCs糖尿病创面的典型表现包括血液循环不良、异常炎症和最外层表皮防御屏障生成障碍[15]。在创面愈合的过程中,结缔组织中的细胞通过分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)刺激内皮细胞增殖,使创面边缘完整的血管以萌发或发芽的方式形成新生血管是创面愈合的关键环节[16-17]。Chang等[18]将成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)诱导ADSCs产生的增强型ADSCs局部注射于糖尿病大鼠足部创面周围,经TUNEL试验验证了其对创面周围组织凋亡的抑制作用,同时促进内皮细胞的增殖,刺激血管的新生,增强创面的血流,加速了糖尿病伤口的闭合。Cao等[19]在建立糖尿病大鼠创面模型的过程中表述,经ADSCs注射治疗的第14天,创面愈合率为86.76%±5.5%,显著高于对照组的37.91%±5.05%,差异有统计学意义(P<0.01),并对ADSCs进行了转录组测序,发现其具有比骨髓间充质干细胞更高的血管生成相关基因表达水平,可见基于ADSCs的治疗加速了糖尿病溃疡创面的愈合。

ADSCs还可调节巨噬细胞极化状态和抑制炎症介质表达[20],减缓糖尿病创面的炎症进程。M1型巨噬细胞受肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和脂多糖等促炎因子调控,产生白细胞介素(interleukin,IL)-12、IL-23和活性氧等加重组织损伤。相反,M2型巨噬细胞受IL-4和IL-10等抗炎因子刺激,释放转化生长因子(transforming growth factor,TGF)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)等加快组织愈合[21-22]。Shi等[23]研究证实ADSCs通过分泌高表达circ-Snhg11的外泌体,与下游的缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)受体作用,激活miR-144-3p/HIF-1α通路,抑制高糖微环境诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的释放,同时维持M2型巨噬细胞的极化状态,加快糖尿病小鼠的创面愈合速率,调节创面中炎症水平。Chen等[24]为评价ADSCs促进糖尿病创面愈合的能力,用酶联免疫吸附试验测定了经ADSCs注射治疗前后的糖尿病大鼠创面炎症因子表达情况,发现IL-6和IL-10的表达上调,同时TNF-α的表达下调,表明ADSCs可通过直接分泌或旁分泌的方式抑制炎症介质的释放[25],具有减轻糖尿病创面炎症反应的功能。

当皮肤发生损伤后,其修复过程依赖角质细胞的上皮化[26-27]。Amidzadeh等[28]使用含角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)的培养基培养ADSCs,检测到角质细胞标记物(角蛋白10、外膜蛋白、胶原蛋白-1和波形蛋白)的表达,结果说明皮肤损伤引起成纤维细胞高表达的KGF可以刺激ADSCs向上皮角质细胞方向分化,加快创面的修复。此外,Hasegawa等[29]在研究ADSCs修复创面的机制时,通过流式细胞术、实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹等技术检测到ADSCs群体内存在p63和DSG3等角质细胞祖细胞标记物,且当其与成纤维细胞共培养时,可以检测到角蛋白5及DSG3表达的上调,由此可看出ADSCs在特定环境下可被诱导形成上皮细胞,促进创面愈合。Wang等[30]不仅在体外观察到ADSCs分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)通过Fas/Fasl信号通路抑制角质细胞的凋亡,进而促进角质细胞的增殖和迁移及其在体外促血管生成中的旁分泌作用,还在糖尿病小鼠体内证实了ADSCs释放的EVs加快了糖尿病创面的血管生成及再上皮化。不难看出,ADSCs在糖尿病创面治疗中的效果是肯定的[31]。

2.2ECMECM是由胶原、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等成分组成的非细胞三维大分子结构,基质各成分之间以及细胞与黏附受体间的结合,形成了一个持续分解与重构的动态复杂网络,居住于其中的多种细胞通过表面受体将ECM信号转导到细胞内,调节细胞相关生理功能,对维持正常的内环境稳态至关重要[32]。伤口愈合过程被划分为炎症、增殖和重塑三个阶段,涉及皮肤不同部位的不同细胞成分与相关ECM组分间的广泛沟通[33]。

创面修复的过程始终离不开多种生长因子和细胞因子的调控[34],许多生长因子已被发现可与ECM组分相互作用,如VEGF、IGF-I、IGF-II、TGF-β、KGF、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、FGF、TNF-α、IL-6等[35]。Ishihara等[36]发现ECM中包含的多种结构蛋白可与VEGF和PDGF等结合,延缓生长因子释放速度来增加其组织留存时间的同时,显著提升生长因子在体内促进糖尿病伤口愈合的功效。ECM作为生长因子的储存和隔离场所,在保留内源性生长因子和吸附外源性生长因子的同时[37],通过直接结合的方式将它们的活性集中在细胞附近,并保护它们免受降解[38]。Martino等[39]分别将上述两种血管生成相关生长因子与融合了胎盘生长因子-2的ECM蛋白结合,发现结合了ECM的生长因子促进糖尿病小鼠创面修复的能力得到增强。此外,纤维蛋白-2可与TGF-β结合蛋白-1竞争TGF-β结合位点并促进TGF-β的释放,与之相反,纤维蛋白-4通过R-Smad通路抑制TGF-β的信号传导,表现出负性调节能力,可见ECM可对生长因子的生物活性进行调控[40]。

ECM始终与干细胞保持动态沟通和相互作用,不仅是细胞结构不可分割的部分,而且还指导和支持干细胞的命运、形态变化、黏附、增殖、生存和分化等过程[41]。ECM通过内部的多种基质细胞蛋白或直接与细胞表面的整合素家族跨膜受体结合的方式,传导影响细胞行为的外部信号,而整合素的活化又可使ECM与细胞间的黏附力增加和基质重塑,更有利于细胞发挥迁移、增殖、分化和凋亡等生物学功能[42-44]。皮肤内存在的ig-h3蛋白是一种由TGF-β诱导的ECM糖蛋白[45],Li等[46]将ig-h3蛋白加入表皮干细胞培养物中,进行定量蛋白质组分析,观察到增殖标志物PCNA、Ki67和表皮干细胞标志物P63、KRT14的表达增加,同时基于转录组分析后证实,ig-h3蛋白通过Wnt/β-catenin信号通路,促进创面愈合所需表皮干细胞的生长、增殖和功能的维持。由此可看出,ECM具有特定的功能,可与嵌入的细胞相互作用,指导并调节细胞活性,有效的促进糖尿病慢性创面愈合。

细胞所驻留的、复杂的动态细胞外微环境,也被定义为细胞生态位[47-48],由ECM、EVs和生长因子组成,其中ECM提供的三维结构是组成生态位的主要成分,支持细胞黏附和存活,调节其行为和命运[49]。在新生肉芽组织中,成纤维细胞转分化为表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纤维细胞需要TGF-β为主的化学信号和ECM提供的机械信号,机械信号通常来自于ECM蛋白质的组分变化、重排列和激活,引起ECM硬度和刚性改变的同时又增强TGF-β化学信号的激活,并与细胞形成可传递ECM张力的局灶性粘连结构[50-51]。Zhang等[52]运用三维生物打印技术将脂肪衍生脱细胞基质(adipose-derived decellularized ECM,adECM)与甲基丙烯酰明胶和甲基丙烯酰透明质酸结合形成的生物活性支架置入裸鼠背部创面,观察到adECM组第7天的创面未闭合面积显著小于无dECM组,此外进行的Masson染色中胶原蛋白的沉积及III型/I型胶原的比值和CD31免疫组化染色中内皮细胞标志物的含量均显著优于无dECM组,证实ECM形成的细胞外微环境有利于ADSCs生物功能的发挥。

3 SVF胶在糖尿病创面中的应用

Xing等[53]用腹腔注射链脲佐菌素的方法成功诱导出稳定的糖尿病大鼠模型,于背部创面分别给予各组治疗措施后,在第7、14、21、28天等各时间点均观察到高剂量SVF胶组的创面愈合率显著优于其它组,差异有统计学意义(P<0.05),后续进行的组织染色结果提示SVF胶增强伤口血管生成及胶原沉积并减轻炎症及纤维化,同时猜测SVF胶促进糖尿病创面愈合的机制可能与MyD88/NF-κB信号通路的激活相关。不难看出,应用SVF胶对糖尿病创面进行治疗的效果是肯定的。杨丽娜等[54]考虑到糖尿病高血糖微环境对ADSCs活性的影响,因此将ADSCs与SVF胶联合应用,观察到ADSCs的创周皮下注射和创面涂抹联合SVF胶的创面涂抹治疗组的糖尿病大鼠创面愈合速率显著高于其它治疗组,且炎症细胞浸润较少,毛细血管及纤维细胞生长较多,具有更强的促进创面愈合能力。因此,SVF胶改善了ADSCs的局部生长环境,提高了其治疗糖尿病创面的效果。

此外,为直观观察SVF胶在临床中治疗糖尿病创面的效果,Deng等[55]以常规负压创面治疗(negative pressure wound therapy,NPWT)为对照,发现SVF胶组的平均创面愈合率为34.55%±11.18%,而NPWT组为10.16%±2.67%,差异有统计学意义(P<0.01),同时进行的创面组织学检测结果提示SVF胶组创面的胶原蛋白积聚水平、新生血管数量均显著高于对照组,结果表明SVF胶有利于糖尿病创面愈合,这与Cai等[56]进行的SVF胶治疗糖尿病创面长期随访结果相一致,提示了其安全性、有效性和持久性。贺译贤等[57]选取9例糖尿病足部溃疡创面患者,于创伤表面敷以SVF胶并在创面周围及基底处给予注射治疗,发现SVF胶治疗组创面的愈合速率、肉芽组织生长情况及疼痛评分均明显优于封闭式负压吸引治疗组且无明显不良反应发生,此外检测的创面组织免疫组化结果提示SVF胶通过下调金属蛋白酶-1阻止胶原降解进而为糖尿病创面愈合提供适宜条件。这些实验及临床案例均表明了SVF胶在促进创面愈合上的积极作用并明确了其可行性,为糖尿病创面治疗提供了一种更高效快速的方法。

4 结语与展望

SVF胶作为近年来一种新的脂肪产物,因其将Coleman脂肪中的ECM和SVF细胞高度浓缩并保留其生物活性而被广泛研究,其中包含的ECM为SVF细胞的生长和生物学功能的发挥提供了支持微环境,所以具有比SVF细胞更好的治疗效果。SVF胶通过促进血管新生、抑制创面炎症、刺激上皮形成、活化细胞和生长因子以及提供间充质干细胞支持微环境等机制促进糖尿病难愈性创面修复,虽然在被尝试应用于临床的过程中,受到伦理学等因素的限制,缺少研究证据证实SVF胶的疗效,但其已在动物实验研究中表现出了良好的安全稳定性及巨大的糖尿病创面治疗潜力。此外,将SVF胶与组织工程和其它难愈性创面治疗技术等相结合,可以进一步扩展其在临床上治疗糖尿病创面的应用前景。至此,呼吁未来开展更多SVF胶的临床试验完善制备过程,进一步提高体积保留率及创面修复效率,使其成为糖尿病创面修复领域高效的治疗方法,为糖尿病患者带来福音。