多肽在病毒感染性疾病中的研究进展

王春芳,韩一芳综述,汪春晖审校

0 引 言

病毒感染性疾病长期以来严重威胁人类的健康和生命,疫苗的研究诞生和抗病毒药物的应用使天花被消灭,乙型脑炎等病毒感染性疾病发病率大幅下降。但病毒性肝炎、出血热、狂犬病等仍然广泛存在,同时,艾滋病、传染性非典型肺炎、中东呼吸综合征、H7N9禽流感、埃博拉出血热等新发感染病不断出现,特别是新型冠状病毒的出现,使得抗病毒类药物的研发推上了热潮。由于针对病毒的相关疫苗及药物研发周期长,且易因病毒变异而失效,目前大多数病毒性疾病缺乏特效的治疗药物。多肽药物因其独特的生化特性在抗病毒治疗中的应用前景,日益引起人们的关注。本文主要就多肽在病毒感染性疾病中的研究现状作一综述。

1 多肽的简介

肽一般由2～50个氨基酸残基组成,其中2～10个氨基酸组成的肽属于寡肽,11～50个氨基酸组成的肽属于多肽,分子量介于小分子和蛋白质之间。多肽分为天然肽和合成肽,天然肽可从动物、植物、微生物中直接提取,合成肽可通过重组技术、固相合成法、α-氨基酸-N-羧基内酸酐法、碳酸二甲酯两步法、N-甲氧酰基氨基酸直接靶向脱羧合成法等方法人工合成。此外,多肽还通过自组装作为各种治疗药物的输送载体。多肽药物具有生物活性高、免疫原性低、特异性好、组织渗透性好、毒性低安全性好、易于合成和修饰、不易在组织中蓄积等特点。自1921年合成第一个治疗性肽胰岛素以来,伴随着结构生物学、重组生物制剂和合成和分析技术的进步,多肽类药物的研发已成为药物研究的热点之一。

2 多肽的抗病毒作用

目前,抗病毒药物主要可分为核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫调节剂,通过抑制病毒复制、抑制病毒侵入细胞、增强机体免疫力等方面来治疗病毒感染。但由于现有抗病毒药物不良反应以及耐药性病毒突变体的产生,抗病毒新药及新疗法的研发尤为重要,近年来多肽类物质的抗病毒作用引起了广泛关注。抗病毒肽通过不同作用机制展现出强有效的抗病毒作用,且对包膜病毒和非包膜病毒均具有抗病毒活性。根据已知的病毒蛋白结构及其细胞靶点,可合理设计和优化不同靶定区域、不同长度的抗病毒多肽,所合成的多肽对靶点具有高度特异性,通过筛选得到对特定的病毒病原体具有广泛抗病毒活性的多肽。

2.1抗包膜病毒

2.1.1 抗新型冠状病毒多肽严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)是一种包膜正义单链RNA病毒,病毒基因组编码四种主要的结构蛋白,刺突蛋白S(spike protein)、N蛋白(nucleocapsid protein)、M蛋白(membrane protein) 和E蛋白(envelope protein)。S蛋白介导病毒与宿主细胞膜之间以及感染细胞和邻近未感染细胞之间的附着和融合,是冠状病毒感染细胞的核心蛋白。虽然现有疫苗接种有一定的控制感染和重症的作用,但由于SARS-CoV-2突变体的快速迭代,而无法提供长期的有效保护。目前研究的抗新冠病毒多肽作用方式主要体现在以下几个方面:①多肽可通过靶向S蛋白中的宿主细胞受体结合域(receptor binding domain, RBD)来抑制其与宿主血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)的结合进而抑制病毒的感染。有研究报道,由人肠道潘式细胞分泌的防御素5(human defensin-5,HD5)可通过靶向宿主ACE2,抑制其与S蛋白的RBD结合,进而减少SARS-CoV-2侵入细胞[1];Beddingfield等[2]发现纤连蛋白衍生的多肽ATN-161,可能通过与整合素RGD基序(arginine glycine aspartate sequence)附近位点的结合抑制整合素α5β1-S和蛋白RBD复合物的形成,从而抑制病毒感染。此外,一种由人气道上皮细胞产生的天然肽LL-37与S1RBD结合,也具有抑制SARS-CoV-2假病毒颗粒感染的潜能[3]。2020年4月初,研究者首次探索口服 LL-37抗COVID-19 的初步疗效,入组的11例轻型患者,对该药均具有较好的耐受性、依从性,服药后未出现不良反应,消化道和全身症状改善尤为显著[4]。随后研究表明,LL-37可阻断 SARS-CoV-2 刺突蛋白和宿主受体 ACE2的结合,限制SARS-CoV-2 感染[3]。但是由于患者数量少,临床证据不足。为进一步评估口服 LL-37 的有效性并证明其对 Omicron的确切治疗效果,Zhao等[5]进行了一项临床试验,研究中共纳入238例轻度奥密克戎BA.5感染住院患者(129例接受口服LL-37,109例口服接受乳酸杆菌,发现口服LL-37有较高的安全性,而且早期口服LL-37进行干预治疗效果更好,具有对抗SARS-CoV-2其他突变体的应用前景。②多肽以激活S蛋白的水解酶弗林蛋白酶(furin)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)为靶向,是治疗SARS-CoV-2的另一种策略。有研究发现使用弗林蛋白酶抑制剂CMK(decanoyl-RVKR-chloromethylketone)和MI-1851可消除furin的裂解,抑制SARS-CoV-2感染哺乳动物细胞[6-7]。Bestle等[6]测试发现拟肽抑制剂MI-432及其类似物MI-1900可以通过抑制TMPRSS2复制阻断病毒感染人呼吸道上皮细胞。③多肽的设计可以计算机分析技术作为辅助工具,针对病毒生命周期的各个阶段设计强效SARS-CoV-2抑制剂。有计算机辅助药物设计发现SARS-CoV和SARS-CoV-2的S2具有序列高度相似性[8],表明有效阻断SARS-CoV的多肽也可能抑制SARS-CoV-2感染,为治疗SARS-CoV-2提供了新思路。

2.1.2抗人类免疫缺陷病毒多肽获得性免疫缺陷综合症(acquired immunedeficiency syndrome, AIDS)简称艾滋病,由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起。HIV是一种具有包膜的正链RNA病毒,其膜表面嵌有外膜糖蛋白(gp120)和跨膜糖蛋白(gp41)。在HIV-1感染靶细胞的过程中,gp120与细胞表面的CD4受体和CXCR4或CCR5共受体结合,触发gp41的构象变化。目前针对HIV的多肽设计主要是HIV进入抑制剂。HIV进入抑制剂通过靶向病毒表面蛋白或宿主细胞受体来阻断病毒与宿主细胞的融合或阻断病毒进入宿主细胞。Bashir等[9]研究发现人类血红蛋白a衍生肽的类似物HbAHP-25直接作用于gp120,抑制其与CD4结合,微摩尔水平即可抑制HIV-1感染;Cimbro等[10]关于硫酸化V2模拟肽抑制HIV-1进入和融合的报道,为针对HIV-1的治疗和疫苗设计的策略提供了线索;Wang等[11]的研究结果表明,来源于HIV包膜蛋白(Env)胞内区的F9170可靶向HIV包膜蛋白胞内区的LLP1结构域,破坏病毒膜的完整性,使得HIV基因组释放,失去感染能力。恩夫韦肽(Enfuvirtide)是目前唯一经FAD批准用于治疗HIV的多肽类药物。尽管FDA批准的抗HIV肽数量有限,但是很多肽类药物已经进入临床研究阶段,如西夫韦肽(临床试验Ⅲ)和阿达帕韦(临床试验Ⅱ),基于肽的HIV进入抑制剂比抗体成本更低,并且比小分子化合物具有更高的特异性[12]。

2.1.3抗流感病毒多肽流感病毒(influenza virus,IV),属于正黏病毒科,根据核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,可分为甲、乙、丙、丁4种亚型,其中甲型流感病毒(infuenza A virus,IAV)因其常见的抗原飘移和抗原转变而易引起大流行。IAV为单链负链8节段RNA包膜病毒,分别编码聚合酶B1(PB1)、聚合酶B2(PB2)、聚合酶A(PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M)、非结构蛋白(NS)。病毒包膜由植物血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和质子通道(M2)组成,病毒的核心由核蛋白(NP)和RNA依赖的三聚体RNA聚合酶组成,该聚合酶又包括三个P蛋白(PB1、PB2和PA),目前抗流感病毒多肽药物主要以HA、NA、PB1和M2为靶标。

最近Reyes-Barrera等[13]观察到,天然和合成EB(entry blocker)肽可通过干扰宿主膜糖蛋白的唾液酸(SA)与HA的结合,抑制病毒复制(IC50分别为20.7 nM、754.4 nM),且天然EB肽对IAV流感蛋白的抗病毒效力是合成肽的32倍。Chen等[14]发现具有低溶血活性、低细胞毒性和良好药代动力学特性的errKPAQP(P2)对NA具有较强的亲和力, 能够减少流感病毒诱导的炎症,并最大限度地降低感染小鼠的死亡率。有实验表明PB1-0肽可通过阻断PA-PB1间的相互作用进而抑制病毒复制[15]。Martyna等[16]研究发现M2AH可通过改变M2蛋白结构,引起病毒膜的变形,中和流感病毒的毒性,从而阻止传播。目前针对流感病毒包膜和宿主细胞吸附以及整个RNA复制过程的多肽药物在研,但尚未上市,这些多肽药物潜在效能有待进一步验证。

2.1.4抗其他包膜病毒针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)的合成肽波西普韦(Boceprevir)和特拉匹韦(Telaprevir),于2011 年获得 FDA 批准,这些肽作用于HCV的NS3/4,干扰病毒的复制[17];来源于两栖类抗微生物肽的 HS-1 能破坏病毒衣壳从而对抗登革热病毒[18];依赖于人源细胞发现人Claudin衍生肽CL7.1(claudin-7)和CL1.1(claudin-1)可阻断寨卡病毒的膜融合过程,也是广泛的黄病毒抑制剂[19]。

2.2抗非包膜病毒目前研究的抗病毒多肽活性主要依赖于破坏病毒包膜的特性,而对于非包膜病毒,多肽的研发主要基于直接与非包膜病毒衣壳相互作用而产生抑制作用。有研究报道人抗菌肽LL-37、猪抗菌肽PG-1和羊抗菌肽SMAP-29均对人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)有直接抗病毒作用[20-21]。α防御素HD5可阻断人腺病毒(human adenovirus, HAdV)的脱膜和基因组暴露,使病毒侵入细胞时无法脱壳而在溶酶体中积累,从而拮抗病毒感染[22]。乳铁蛋白对HAdV的抗病毒活性可发生在感染期间的多个阶段[23]。

3 多肽的免疫调节作用

多肽除抗病毒、杀菌作用之外,还具有免疫调节作用。

3.1抗原的识别多肽可作为抗原,激发免疫系统产生免疫应答的分子,基于肽的疫苗已被广泛用于针对病毒的免疫反应。肽疫苗是通过与患者的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)结合进行表达,HLA 分子将肽疫苗呈递给T细胞受体,从而诱导特异性T细胞反应。有研究报道基于五种来源于HCV基因型1和2的核心、NS3和NS4蛋白的保守区域设计的肽疫苗IC41,以多聚L-精氨酸为佐剂,在Ⅱ期临床试验中,对60名HLA-A2 慢性无应答反应感染者接种IC41,发现有67%的患者产生T细胞免疫应答反应[24]。

3.2调节宿主的炎症反应多肽具有促炎和抗炎作用,可通过作用于先天免疫细胞(如吞噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等),间接调节趋化因子和固有免疫分子(补体、细胞因子等)的释放,调节感染患者体内免疫反应来减少病毒感染所引发的剧烈炎症反应。细胞因子风暴是SARS-CoV-2重症感染者的主要死亡原因,有临床研究表明AMY-101(一种高度选择性的补体C3抑制剂)可抑制COVID-19患者体内通过补体系统(C3)激活导致的炎症反应,但仅开展了Ⅱ期临床试验,明确结果需通过进一步临床研究完善[25-27]。LL-37通过调节固有免疫细胞,特别是嗜中性粒细胞IL-8 的释放,减少IAV对机体肺部的损伤[28],也可抑制巨噬细胞焦亡,诱导促炎细胞因子的释放[29]。

3.3调节信号通路多肽可作为信号分子,与免疫细胞上的受体结合影响免疫应答。多肽可以与Toll 样受体(toll-like receptors, TLRs)信号通路相互作用,影响 Toll 样受体的识别和免疫应答。有研究表明 HNP-1 能够与 HAdV-C5、HAdV-D26 和 HAdV-B35 的衣壳直接结合,并将病毒定位到 TLR4 复合物以促进 HAdV 的侵入,并诱导 NLRP3 炎症小体激活和 IL-1β 释放[30]。LL-37 能够通过调节IIFN 信号通路介导抗 ZIKV 的作用[31]。

综上所述,多肽可直接作用于病毒颗粒,或者通过干预病毒生命周期的各个阶段去阻断病毒的感染,其作用机制主要分为三种:①干扰病毒的吸附和进入,通过破坏病毒和靶细胞识别和结合过程导致病毒感染失败;②抑制病毒复制;③参与宿主抗病毒免疫调节。

4 结 语

多肽药物相较于小分子药物具有更好的特异性和生物多样性,且不良反应低;同时比生物制品(蛋白质或抗体)成本低、组织渗透性好、易于改造。与传统抗生素相比,具有免疫调节活性、耐药性较低等优势。但是多肽的应用也存在以下问题。首先,天然多肽半衰期短、在体内稳定性差,易受蛋白酶的降解。但有研究指出可通过序列修饰、环化如聚乙二醇化、拟肽等方法修饰或掩盖多肽的潜在切割位点,从而减少蛋白酶的识别和蛋白降解,也可纳米载体递送方式解决其分子量较大的问题。其次,多肽如多粘素对机体肾脏和神经存在潜在毒性,以及一些抗微生物肽对真核细胞(特别是红细胞)的毒性作用等不良反应限制了其在临床上的应用。化学修饰的设计、治疗指数的引入、基于目标的合理化修饰和合成可提高未来多肽的疗效。此外,如果要使多肽得到可持续的应用,就必须掌握它们是否可规避目前传统抗病毒药物耐药性问题。总之,抗病毒多肽药物的研发由实验结果转化为临床药物,需完善设计、合成、实验、临床试验等一系列研究过程,以其巨大的抗病毒潜能、市场应用前景和经济优势仍十分具有科学价值。