β-葡萄糖醛酸酶（GUS）在原发性肝内胆管结石形成中的作用

李果 叶海军 徐至开 李文涛 徐承雷 李江

摘要： 原发性肝内胆管结石 （PIS） 是我国西南地区高发和难治性疾病， 对患者的生活造成极大的影响。胆道系统慢性感染产生的β-葡萄糖醛酸酶等代谢产物， 在色素性结石的形成中起着重要作用， 除细菌产生的外源性β-葡萄糖醛酸酶， 肝内胆管细胞产生的内源性β-葡萄糖醛酸酶在结石的形成中亦扮演重要角色。本文就PIS发病机制中β-葡萄糖醛酸酶的作用研究进展予以分析， 以期为PIS的防治提供可能的方式。

关键词：  胆石；  葡萄糖醛酸酶；  病理过程

基金项目：  云南省科技厅-高校联合基金项目 （202101AY070001-129）

Role of β-glucuronidase in the formation of primary intrahepatic stones

LI Guo，  YE Haijun，  XU Zhikai，  LI Wentao，  XU Chenglei，  LI Jiang.  （Department of Hepatobiliary Surgery，  The First Affiliated

Hospital of Kunming Medical University，  Kunming 650032，  China）

Corresponding author：  LI Jiang，  13888836057@163.com  （ORCID：  0000-0002-6872-9434）

Abstract： Primary intrahepatic stones （PIS） is a refractory disease with a high incidence rate in Southwest China， which greatly affects the life of patients. Metabolites， such as β-glucuronidase produced by chronic biliary tract infection， play an important role in the formation of pigmented stones. In addition to exogenous β-glucuronidase produced by bacteria， endogenous β-glucuronidase produced by intrahepatic bile duct cells also plays an important role in the formation of stones. This article analyzes the research advances in the role of β-glucuronidase in the pathogenesis of PIS， in order to provide a possible method for the prevention and treatment of PIS.

Key words： Gallstones； Glucuronidase； Pathologic Processes

Research funding： Yunnan Province Department of Science and Technology-University Joint Fund Project （202101AY070001-129）

原发性肝内胆管结石（primary intrahepatic stones，PIS）， 區别于胆总管结石和胆囊结石， 特指原发于胆总管分叉以上， 肝内胆管近端的结石， 占胆石症患者的10%～20%［1］ 。该病在欧美地区较少见， 在我国长江流域西南地区较为高发。该病本身为良性疾病， 但其发病极其隐匿、 迁延， 能对肝内胆管及肝组织造成严重破坏， 当出现症状就医时大多已经伴随多次胆道感染、 肝细胞损伤、肝纤维化、 增殖性胆管炎甚至癌变。对患者的生活质量和医疗资源的利用效率造成极大的负面影响。该病发病机制的研究目前国内外仅见零星报道， 其中胆道感染后产生的内、 外源性β-葡萄糖醛酸酶 （β-glucuronidase，GUS） 在结石的形成中具有重要作用。本文就GUS在PIS形成中的作用进行综述， 以期为GUS在PIS发病机制方面的研究探索方向。

1 PIS发病机制及胆道感染与PIS的关系

根据结石成分的不同， PIS可以分为胆色素性、 胆固醇性以及混合性结石， 比例上， PIS绝大多数为胆色素性结石［2］ ， 而形成机制较为明确的胆囊结石则主要为胆固醇结石［3］ ， 提示PIS与胆囊结石形成机制存在差异。一般认为， 感染、 胆汁淤积、 胆管解剖以及胆汁代谢异常是该病发病的主要危险因素［4-5］ ， 此外， 胆道及胃肠道寄生虫感染、 肠道菌群失调、 饮食习惯、 饮水条件等也被认为和该病相关［6］ 。在病理学上， PIS主要的表现为病变肝内胆管上皮慢性炎症， 胆管上皮腺体增生， 胆管壁纤维化［7］。近来研究［8］发现， 健康胆道系统内并非无菌环境， 可能存在常规菌群定植， 通常认为胆道微环境对大多数细菌都是不利的， 感染治疗中不可避免的抗生素应用可能会对正常生理的胆道微生物群检测产生偏差。但PIS患者胆道内菌群和健康人胆道菌群种类和构成比例存在差异［9］ ， 因而， 很可能存在致石菌群， 其导致结石形成的机制亦将是研究的重点。

胆道感染主要由细菌和寄生虫引起。其中， 寄生虫导致肝内胆管结石的病例相对较少， 华支睾吸虫和棘口吸虫可寄生在胆道内， 引起持续性慢性炎症， 导致胆管的机械性梗阻、 炎症和胆管周围纤维化， 而胆管内蠕虫及其虫卵通常是炎症形成的基础病灶， 刺激上皮细胞增生引起机械性梗阻和杯状细胞增生引起黏蛋白过表达，成为结石形成的理想条件［10］ 。在细菌检测中， PIS患者胆道样本主要检出微生物主要为大肠杆菌、 粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、 铜绿假单胞菌［11-12］。Clemente等［13］在73例复杂肝内胆管结石患者的胆汁中分离出上百种微生物， 其中多重耐药肠球菌、 假单胞菌和大肠杆菌的检出率分别为43. 9%、 41. 2和20. 6%， 表明细菌感染与结石的形成密切相关， 且常合并多种微生物感染。肠道细菌可通过血行和淋巴管传播， 也可通过Oddi括约肌进入胆道并引起感染［4］ 。在上述3种途径中， 通过Oddi括约肌上行感染最为重要， 一旦Oddi括约肌的 “门户” 功能异常或消失， 带菌小肠液逆流入胆道， 感染胆管黏膜引起胆管炎及一系列下游病理变化。早期的Maki学说［14］ 指出胆道感染后细菌分泌的GUS可将结合胆红素水解成非结合胆红素和葡萄糖醛酸， 非结合胆红素再与钙离子结合而形成胆红素钙， 从而在胆汁中析出成为肝内胆管结石的成石核心。而此后的研究发现， 胆道系统内的GUS可分为2类， 一类为肠道菌群微生物分泌， 主要为大肠杆菌， 其次包括脆弱类杆菌和梭形杆菌属等， 也是肝内致石菌群的主要构成物种［8-9］ ， 此类菌群直接产生并释放入胆道的GUS， 称为外源性或细菌性GUS； 另一类则由机体自身组织细胞受内毒素等刺激后产生释放的GUS， 主要由肝内胆管上皮细胞合成分泌， 称为内源性或组织学GUS［15］ 。外源性和内源性GUS在肝内胆管结石的形成中扮演重要角色， 尤其是内源性GUS存在时间长， 与结石的复发关系更为密切， 但其具体调控机制尚待研究。

2 GUS的功能及作用

2. 1 维持内源性成分的代谢稳态 GUS属于两个糖基水解酶家族2和家族79， 广泛分布于人和多种肠道细菌中 （人GUS∶hGUS； 肠道细菌GUS∶BGUS）。hGUS主要存在于肝脏、 脾脏、 肠黏膜及胃黏膜上， BGUS主要存在于厚壁菌门、 变形菌门、 疣微菌门和拟杆菌门中［16］ 。作为水解酶， GUS可以特异性催化O-或S-糖苷基部分水解，并从糖苷中分离出糖苷元。葡萄糖醛酸化是消除机体内、 外源性生物活性分子的最重要途径之一， 例如， 甾体激素 （雌、 雄激素）、 神经递质 （血清素、 儿茶酚胺等）、 胆红素、 炎性介质等生物活性分子， 通过结合内源性葡萄糖醛酸分子， 生成极性更强、 水溶性更高的代谢物， 促进其从尿液或胆汁中排泄［17］ 。

胆红素作为葡萄糖醛酸化程度最高的内源性分子之一， 分别以单 （约16%）、 双葡萄糖醛酸结合物 （约80%） 形式存在于健康人胆汁中［18］ 。胆红素葡萄糖醛酸酯被肠道菌群大量代谢为胆色素和尿胆原， 通过肠道上皮细胞重新吸收并进入肠肝循环［19］ 。在某些新生儿中， GUS表达增加， 胆红素被显著地循环利用， 从而导致高胆红素血症［20］ 。胆红素也可以调节肠道微生物群的结构和代谢， 例如， 胆红素对革兰阳性菌具有潜在毒性， 可能是对胆红素的敏感性破坏了细菌膜的完整性、 呼吸代谢和碳水化合物代谢。与革兰阳性菌相比， 革兰阴性菌外膜的结构或组成 （内膜和外膜） 可能赋予其抵抗胆红素嵌入作用的能力， 从而抵抗胆红素的毒性作用［21］ 。另外， BGUS的糖化过程不仅是生物转化的重要途经， 其产生的葡萄糖醛酸 （glucuronic acid， GlcA） 是维持肠道微生物群生长的碳源。多种肠道细菌已被证实可代谢GlcA， 但利用能力有所差别， 提示GlcA可影响肠道菌群及微环境［17］ 。

2. 2 介导外源性成分的体内处置 人类接触的许多药物和外源性物质 （如膳食、 环境和工业化学品） 是非极性的亲脂化合物。虽然这些化合物的亲脂性促进了生物膜的扩散并随后进入其作用部位， 但同样的特性阻碍了它们通过肾脏、 肠道从体内消除， 因此利用高极性的GlcA形成亲水的葡萄糖醛酸盐， 转化为更极性的亲水化合物是一种消除途径和清除机制［17］ 。而肠道BGUS的水解可能会增加外源性成分在肠道的重新释放， 增加胃肠炎症或癌症的发生风险。比如晚期结直肠癌患者接受伊立替康治疗后发生迟发性腹泻［22］ ， 这种毒性是由于其代谢物SN-38葡萄糖醛酸缀合物被BGUS分解而被重新激活而导致， 使其临床疗效受到严重限制。与单独接受伊立替康治疗的小鼠相比， BGUS抑制剂具有显著的抗腹泻保护作用而不影响疗效， 还可以增加肠道微生物的丰富度， 减少变形杆菌水平［23］ 。非甾体抗炎药酮洛芬和吲哚美辛的胃肠道损伤也可以通过选择性抑制细菌GUS来改善［24］ 。目前確定了超过100种药物经BGUS参与循环。这些药物包括吗啡、 雌激素、 布洛芬、 咪达唑仑及其结构类似物［25］ 。因此开发有效的、 特异性的、 无细胞毒性的GUS抑制剂对于提高治疗药物的临床疗效和有效的疾病管理是必不可少的。

3 GUS在PIS形成中作用

3. 1 外源性GUS在PIS形成中作用 胆道菌群失调是结石形成的关键因素， Chen等［26］ 分析了16例复发性胆总管结石患者和44例原发性胆总管结石患者的胆道微生物群， 16S rRNA测序显示， 在原发性胆总管结石组中普遍存在变形菌门、 厚壁菌门、 拟杆菌门和放线菌门 （均为肠道细菌）。这些数据表明， 胆道微生物群可能起源于肠道微生物群， 并通过十二指肠乳头进入胆道。总体上， PIS的致石菌群以革兰阴性杆菌为主， 和肠道菌群有大量重合。感染胆汁中产生大量的BGUS， 促使葡萄糖醛酸缀合物释放游离胆红素， 并与钙进一步沉淀， 形成色素性结石。而结石的形成又使得胆道中大肠杆菌、 克雷伯菌、 屎肠球菌、 拟杆菌等细菌容易聚集繁殖， 导致胆汁中BGUS活性升高［27］ ， 形成恶性循环。此外， 当某些外源性代谢生物增加 （如伊利替康）， 会使肠道内产生更多肠杆菌科细菌， 导致肠道外源性GUS的表达增加［28］ ，是否参与色素性结石的形成， 仍需进一步研究。GUS抑制剂能减少胆红素的肠肝循环［29］ ， 通过口服GUS抑制剂D-葡萄糖二酸-1， 4-内酯， 检测发现胆汁中GUS的活性显著降低。在体外实验中， 胆红素钙在人感染胆汁中孵育的蛔虫卵表面显著沉淀， 而加入D-葡萄糖二酸-1， 4-内酯后， 通过抑制BGUS的活性来控制胆汁中胆红素钙的分离， 从而明显减少胆红素在人胆汁中培养的蛔虫卵表面的沉淀［14］ 。

另外， 肠道细菌产生的脂多糖（LPS）通过 TACE/TGF-α/EGFR和EP4/p38MAPK途径， 上调黏蛋白 （Mucin，MUC） 基因， 诱导的MUC过表达使胆汁中黏液蛋白的分泌增加， 可能协同GUS的成石作用［30］ 。Li等［31］ 发现增殖细胞核抗原 （PCNA shRNA） 处理动物胆管炎模型能有效抑制增殖相关基因： PCNA、 Ki-67的mRNA和蛋白表达， 抑制病变胆管壁胆道上皮、 黏膜下腺和胶原纤维的增生行为， 同时酸性黏液腺、 MUC3 RNA的表达和内源性GUS的分泌也被有效抑制。黏蛋白加重胆道梗阻促进结石， 是否需要GUS诱导胆色素钙形成为结石提供材料； 而GUS致石作用提供的材料， 是否也需要黏蛋白加重胆道梗阻从而才能聚集成石？MUC与GUS是否存相同或相关的调节通路有待进一步研究。

3. 2 内源性GUS在PIS形成中作用 随着研究的深入，内源性GUS在PIS形成中的作用正逐渐被认识。1987年Oyabu等［32］ 发现内源性GUS在结合胆红素的分解过程中有重要作用， 促进色素性结石的产生， HO等［33］ 发现肝内色素性结石患者肝脏组织内源性GUS水平较无结石者高约12倍， 同时， 当pH为4. 6时， 检测液中有活性的GUS为内源性GUS， 这可能是胆汁感染， 肝细胞受损时，周围组织pH降低， 激活了内源性GUS的表达来加速生物活性物质的清除。肠道存在大量产生LPS的细菌， 当胆汁反流或细菌移位， 外源性GUS在早期迅速升高， 参与结石的形成。若胆道系统通畅性好， 其内并无致石菌群长期定植， 在致石菌群感染中产生的GUS也可在细菌清除后12 h内随胆汁排泄清除［34］ 。张西波等［35］ 通过动物模型发现胆道感染后， 首先外源性GUS增高， 但随着感染控制和胆汁排空， 外源性GUS活性逐渐下降， 而内源性GUS活性持续增高并维持较长时间， 提示内源性GUS可能在色素结石形成过程中发挥长期作用， 研究内源性GUS的表达、 分泌和活性调控可能对揭示PIS的发生和复发机制更有意义。Yao等［36］ 通过免疫组化染色评估了PIS胆管黏膜标本中内源性GUS、 c-myc、 p-p65和p-PKC的表达， 发现与正常肝标本相比PIS区域的胆管黏膜上述分子表型显著增加。同时， 姚晨辉［37］ 通过建立胆管上皮细胞损伤细胞模型研究， 发现 LPS 可通过TLR4/NF-κB/c-myc信号级联， 诱导肝内胆管上皮细胞表达及分泌内源性GUS。NF-κB通过调节淋巴细胞和淋巴器官的发育和存活， 从而控制免疫应答、 恶性转化、 细胞凋亡等多个过程， 在免疫系统中发挥核心作用。当胆道发生感染时， 可能存在多种炎症因子参与， 多条以NF-κB为中心的信号通路串扰， 从而调控GUS的表达。此外， LPS激活肝窦内的巨噬细胞 （Kupffer细胞）， 促进循环单核细胞向巨噬细胞的转化， 参与并放大炎症反应［38-39］ 。在结石饮食喂养的小鼠试验中， 肝内巨噬细胞浸润明显增加［40］ 。Yang等［41］ 发现肝内胆管结石患者肝脏标本中巨噬细胞标志物CD68、 CD206以及TNF-α、 内源性GUS的表达均较正常肝脏标本明显升高， 且呈正相关。在LPS的刺激下具有抗炎和免疫调节的M2型巨噬细胞及其分泌产物TNF-α可能通过NF-κB/PCNA的信号级联通路增加胆管上皮细胞内源性GUS的表达。通过使用NF-κB抑制剂有效抑制炎症介质表达后， TNF-α和GUS的表达均下降， 表明巨噬细胞浸润可能参与了肝内胆管细胞分泌GUS。肝脏巨噬细胞对肝损伤和修复过程有重要调控作用， 可能是通过去除细菌病原体、 抑制肝脏炎症反应， 从而减少内源性GUS的表达。以上内源性GUS可能的信号通路见图1。内源性GUS参与结石形成的调控机制尚不明确， 可能涉及多条信号通路偶联，对相关信号通路的研究， 可能为干预PIS的形成或复发提供新的潜在治疗靶点。

4 小结

PIS成因复杂， 其完整、 确切的发病机制尚不明确。外源性GUS在肝内胆管结石的形成中作用已得到肯定，内源性GUS在结石形成中的面纱在逐渐被揭开。近年来， 内源性GUS在肝内胆管结石形成中的作用逐渐得到重视， 但目前尚未有系统研究。对内源性GUS抑制的相关研究虽然取得一定成果， 但大多在体外或动物模型中进行， 缺乏临床相关性。另外， GUS参与了人脑含葡萄糖醛酸的糖胺聚糖的降解， 若缺乏GUS可能引起Ⅶ型黏多糖病， 导致脑内溶酶体储存功能障碍。如果GUS被抑制， 是否会发生相关严重副作用尚不清楚。因此揭示内源性GUS表达的调控机制， 研究其信号通路， 可能更有意义， 将为干预肝内结石的形成提供新的治疗思路。

利益冲突声明： 本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明： 李果、 叶海军、 李江负责课题设计， 资料分析， 撰写论文； 徐至开、 李文涛、 徐承雷、 李江参与收集数据， 修改论文； 李江负责拟定写作思路， 指导撰写文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-08-23； 录用日期：2023-10-07

本文编辑：王亚南