芽孢杆菌脂肽类抗生素的抑菌活性及其对植物病害的生物防效研究

陈莉 张奂棋 戴婷 王亮

摘 要：生物农药替代化学类农药和农药减量已成为农业可持续发展的必然趋势。为此，介绍了脂肽类抗生素的种类和结构以及脂肽类抗生素的抑菌活性，阐述了脂肽类抗生素在植物病害生物防治中的表现，探索了芽孢杆菌开发为生物农药方面的应用。

关键词：芽孢杆菌；脂肽类抗生素；抑菌活性；植物病害；生物防效

中图分类号：S436.68 文献标志码：B文章编号：2095–3305（2024）02–00-03

在自然生态系统中存在着一类有益微生物能够抑制或杀灭植物病原菌的生长，人们可以将有益微生物开发成为生物农药替代化学农药，减少化学农药的使用，从而减少环境污染和食品安全隐患。芽孢杆菌是生物农药中最具潜力和开发前景的一类有益微生物。芽孢杆菌产生的芽孢具有非常强的抗逆性，能够适应恶劣的环境。芽孢还可以避免生物农药在运输或储藏过程中活菌剂容易失活的现象，因此芽孢杆菌是一种较为理想的生物农药。更重要的是，大多数芽孢杆菌还能够产生多种多样的抗菌活性物质，脂肽类抗生素是芽孢杆菌产生的重要活性物质。由于脂肽类抗生素具有低毒、易降解等特点，同时对极端温度、酸碱度等具有广泛的适应性，不仅被用于农业生产植物病害的生物防治，还被广泛应用于土壤修复、石油回收、化妆行业、食品加工行业以及医疗等领域。由于脂肽类抗生素具有各种优势，脂肽类抗生素的研究受到人们的青睐。了解和研究脂肽类抗生素不同抗菌活性及其在植物病害生物防治中的作用，有助于人们在农业生产中更好地开发和利用。

1 脂肽类抗生素的种类和结构

脂肽类抗生素是芽孢杆菌非核糖体合成的抗菌活性物质，主要由脂肪酸和肽链构成，根据碳原子数目以及氨基酸种类不同，可以分为三大家族：表面活性素（surfactins）、伊枯草菌素（iturins）和丰原素（fengycins）。在三大家族的肽环上由于不同的氨基酸序列和结构、类型或者连接的脂肪酸链，因此三大家族的脂肽之间由于氨基酸序列、长度、分支不同或者脂肪酸的不饱和现象等形成明显的异构体或同系物。同时，三大家族的每一脂肽类抗生素种类都存在几种同系物，而且往往是共同存在的。

表面活性素和伊枯草菌素都由7个氨基酸连接脂肪酸链构成的环脂肽类抗生素化合物。表面活性素是由C14到C17组成的β-羟基脂肪酸链，伊枯草菌素（iturins）是由C14至C15组成的β-氨基酸脂肪酸链，表面活性素同系物包括表面活性素、地衣芽孢杆菌素（lichenysin）和埃斯波素（esperins）；伊枯草菌素

（iturins）同系物包括iturinA、B、C、D，杆菌抗霉素（bacil-omyein）L、D、F和抗霉枯草菌素（mycosubtilin）等。丰原素

（fengycins）包括fengycin A 和B，plipastatin属于fengycin

或有人认为fengycin也称为plipastatin；fengycin由10个氨基酸连接脂肪酸链构成的环脂肽类抗生素化合物，脂肪酸碳原子数C14到C18，并且是3-Tyr和10-Ile通过内酯键形成一个环状结构。

2 脂肽类抗生素的抑菌活性

在脂肽类抗生素三大家族中，surfactin具有强的表面活性，具有抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和抗细菌的活性，但是不具有显著的抗真菌活性，surfactin的抗菌机制在于能够与细菌细胞膜相互作用可以诱导脂质双分子层穿孔并形成离子通道，从而破坏膜的完整性。有研究表明surfactin与芽孢杆菌的鞭毛运动有关，可能会减弱细胞群在向植物根部聚集时细胞表面相互产生的摩擦力，因此有利于芽孢杆菌在植物根部定殖。此外，虽然surfactin没有明显抑制真菌的活性，但与其他脂肽类抗生素类化合物如iturin A共同作用时能够显著增强抑真菌活性。

伊枯草菌素具有较强的表面活性，而且对多种病原真菌和酵母菌表现强烈的抗菌活性，但是对细菌的抗菌活性是有限的，甚至没有抑菌活性。研究表明，iturin A能够有效抑制植物病原真菌和酵母菌，其抑菌机理主要通过病原真菌细胞壁和干扰小囊泡的细胞膜，造成内膜微粒子的聚集，促进电解质释放和大分子物质与磷脂的降解，导致细胞死亡。此外，iturin A还改变细胞膜的渗透性，造成膜内钾离子的泄漏。由于iturin A低毒、低致敏性，可用于人和动物真菌病害的防治。在iturins家族中，与iturin A亲缘关系最近还有芽孢菌霉素和抗霉菌枯草杆菌素，由于iturin A抗真菌活性最强，可与化学杀菌性能相媲美，且具有低毒、低致敏性，对动物和人安全，因此可开发为最具理想的环境友好型的生物源农药。

丰原素的表面活性比伊枯草菌素和表面活性素弱，但是对丝状真菌，如实灰霉病原菌具有较强的抑制作用。此外，还能够抑制大肠杆菌的生长。经fengycin

处理过的抑菌区域，新生菌丝顶端或者分枝顶端膨大，呈淡黄色泡囊。部分泡囊破裂，细胞壁内含物流出，造成菌丝细小、呈空瘪状和局部断裂。有学者研究表明Bacillus subtilis C2产生的fengycin A能够诱导尖孢镰刀菌后桓孢子的形成，同时造成菌丝生长稀疏，菌丝肿胀畸形和分生孢子溶解。丰原素（fengycins）抑菌機理主要通过破坏真菌细胞膜上磷脂分子的正常秩序，引发胞质外流导致细胞死亡，且在高浓度下与surfactins类似对细胞膜具有溶解作用。

3 脂肽类抗生素在植物病害生物防治中的表现

由于脂肽类抗生素结构具有多样性和复杂性，对植物病原真菌、细菌、病毒、昆虫等都具有较强的生物活性，因此抑制或杀死病原菌的机制存在多样性。芽孢杆菌作为生物农药，最主要最直接的方式是产生抑菌活性物质包括脂肽类抗生素，而其在田间的生物防治效果：一方面与芽孢杆菌在植物根部土壤中的移动能力有关，另一方面与诱导寄主植物产生抗性有关，同时促进植物生长以抵抗病原菌的侵袭（一些芽孢杆菌被称为根围促生菌，PGPR）。研究表明：脂肽类抗生素不仅有利于生防菌在植物根部的定殖，而且在激发寄主植物产生抗性机制过程中也起到关键性作用，为脂肽类抗生素作为生物农药的开发和利用提供了可行性条件，因此脂肽类抗生素在植物病害生物防治中具有举足轻重的地位。

3.1 促进芽孢杆菌在植物根部的定殖

芽孢杆菌在植物根部的定殖与鞭毛有关。芽孢杆菌通过鞭毛的运动在植物根部定殖，在竞争中这些芽孢杆菌形成具有较强的黏着性、组织性和抗菌能力的多细胞群体。在固体表面，芽孢杆菌菌落进化和形成一个结构性组织，称之为生物膜，在液相或气相表面形成薄皮，会黏着在土壤颗粒表面，形成一个互相协调的群体，以此联合起来共同适应不良的环境条件。这些芽孢杆菌产生的芽孢也具有高度的有序性，共筑的生物膜或薄皮之间就形成了“铜墙铁壁”。研究表明，脂肽类抗生素surfactin和mycosubtilin与芽孢杆菌的鞭毛运动有关，可能会减弱细胞群在向植物根部聚集时细胞表面相互产生的摩擦力，因此有利于芽孢杆菌在植物根部定殖。此外，surfactin还与生物膜形成有关。生防菌通过抑制病原物是其生态竞争的重要机理， 脂肽类抗生素由于脂肪酸链与肽链的长度和种类不同，因此表现出不同的抗菌属性，许多芽孢杆菌在植物根际土壤中具有一定的竞争优势与环脂肽类抗生素的抗菌活性密不可分。

3.2 诱导寄主植物产生系统抗性

芽孢杆菌能够诱导寄主植物产生系统防卫反应，被称为诱导系统抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）。系统抗性反应是在寄主植物在感病状态下，由微生物引起的寄主植物细胞分子反应模式的一种结果，系统反应信号通过转导给寄主植物使得其修饰基因的表达，从而增强了植物对病原物的抵抗能力。生防菌诱导的ISR信号主要通过茉莉酸或乙烯信号途径，水杨酸也可以引起环脂肽（CLP）的诱导系统抗性，主要是由表面活性素和丰原素诱导的多种寄主植物上的系统抗性 。

4 脂肽类抗生素的应用

由于surfactins具有较强的表面生物活性，因而在食品方面作为乳化剂或食品添加剂以及在药物开发方面作为佐剂开发应用较为广泛，并逐渐成为化学表面活性剂的天然替代品。近年来，有文献报道surfactins具有较强的抗真菌活性，且具有潜在蚊虫杀蛹作用；fengycins具有良好的抗真菌活性，可特异性治疗真菌，在许多芽孢杆菌的抗菌活性物质检测中发现存在fengycins，在医药研究中发现fengycins还可抑制金黄色葡萄球菌的定殖；iturins脂肽类抗生素在三大家族中表现抗真菌活性最强，可与化学杀菌性相比拟，且具备较强的稳定性、低毒性和低致敏性的特点，因此是最具理想的环境友好型的生物源农药。植物病害中80%的病害是由病原真菌引起的，iturins在植物病害中的抑菌活性得到了较为充分的体现，加之iturins的大规模发酵生产已积累了长期的技术和经验，显示了iturins作为生物农药广泛的应用前景。

伊枯草菌素A（iturin A）最初是从枯草芽孢杆菌分离得到的，对多种病原真菌和酵母菌具有强烈抑制作用的环脂肽化合物，其在农业中主要用于种子储藏性和对土壤寄居性病原真菌的防治，后来用于人类和动物的医药研究。国外，iturin A用于防治坚果类和谷物类的黄曲霉毒素曾获得专利。随后，科学家发现了与iturin A亲缘关系最近的芽孢菌霉素（bacillomycin）和抗霉菌枯草杆菌素，三者都属于iturins家族，而iturin A在iturins家族中抗真菌活性最强。通过动物和人体临床试验也表明，iturin A低毒、低致敏性，可用于人和动物真菌病害的防治。有学者最初从枯草芽孢杆菌中分离到iturin A的8个同系物，并认为iturin A是8个同系物的混合物。后来Yerra Koteswara Rao等[1]从解淀粉芽孢杆菌中也分离到iturin A的8个同系物。因此，能够产生iturin A的生防菌株以枯草芽孢杆菌（B. subllis）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）报道较多。

与iturin A先后被发现，且亲缘关系最近的是bacilo-

mycin和mycosubtilin，两者都是从Bacillus subtilis分离出的一类环脂肽类抗生素化合物，它们的肽段均包括L-型和D-型的氨基酸，并且bacillomycin F抗菌活性与iturin A有关。mycosubtilin与iturin A的亲缘关系最近。与surfactin相同，mycosubtilin与芽孢杆菌鞭毛运动有关，通过减弱细菌群运动中细胞表面产生的摩擦力，因此优先聚集到植物根部并定殖下来。Valérie Leclère等[2]研究发现B. subtilis ATCC6633产生的mycosubtilin对腐霉病（Pythium aphanidermatum）有较好的防效。

B. subtilis RB14对土传性病害尤其是番茄土传性病害具有良好的防效，并开发成生物农药，其产生的主要抑菌活性物质是iturin A。此后，许多研究者对B. subtilis RB14产iturin A发酵条件以及脂肽类抗生素合成酶基因進行了较为深入的研究。B. subtilis B3对小麦赤霉病（Fusarium graminearum）、小麦立枯病（Rhizoctonia solani）、小麦纹枯病（Rhizoctonia cerealis）和稻瘟病（Pyricularia grisea）等真菌病害具有良好防效且稳定性较好，其商品名为麦丰宁。通过脂肽合成酶基因的克隆测序和分析，研究表明B. subtilis B3产生的抑菌物质主要为iturin A 和fengycin。

5 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用

芽孢杆菌能够产生抗生素、嗜铁素、植物生长激素等活性物质，这些活性物质与植物病害的生防机制密切相关，也对芽孢杆菌开发生物农药和生物肥料起到了优势作用，其中基于芽孢杆菌开发的生物农药产品约占细菌性生物农药的50%。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌中最早和最具代表性的商品化生物农药[3-5]。

例如，日本东研发的B. subtilis RB14对立枯丝核菌（Rhizo-

ctonia solani）引起的番茄病害有良好的防效，美国研发的B. subtilis var. amyloli quefaciens FZB 24，商品名为Taegro，

主要用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂，随后B. subtilis QST713和B. subtilis QST 2808被美国Agraquest公司注册生产，商品名分别为SerenadeTM和SouataAS，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦、胡桃等作物的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等真菌性病害。此后，B. subtilis MBI600在英国、日本、瑞士等国家获得注册登记和商业化生产[6]。

我国生物农药研发的整体水平在发展中国家处于领先地位，利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也達到世界先进水平。较为典型的枯草芽孢杆菌如B. subtilis B916、B908、B3、BS-208 等相继实现产业化，开发商品名分别为纹曲宁、百抗、麦丰宁、依天得。在美国，侧孢短芽孢杆菌被成功地作为生物杀虫剂来防治动物线虫，我国云南大学侧孢短芽孢杆菌杀线虫成果也得到了生产上的应用。2015年，由山东奥丰生物科技自主研发枯草芽孢杆菌B. subtilis BSn5干粉剂已通过相关专家的科技成果鉴定，经大田试验该菌对水稻稻瘟病、黄瓜白粉病、草莓灰霉病等植物病害具有较好的防治效果。当前，芽孢杆菌开发为生物农药大多含有2种或2种以上芽孢杆菌混合液，或芽孢杆菌与杀菌剂的复配剂，通过芽孢杆菌之间或芽孢杆菌与杀菌剂的协同作用，增强生物防治效果和防效的稳定性[7-10]。

6 结束语

当前，虽然化学防治是植物病害防治的主要方式，但随着环保新型农药的研制、开发、利用和推广，新型生物农药的应用效果和对环境友好的优势作用已经被市场逐渐认可，生物农药替代化学类农药和农药减量已经成为农业可持续发展的必然趋势。同时，随着分子生物学和生物信息技术的发展，人们利用宏基因组学、蛋白质组学和代谢组学等手段，对植物、微生物和土壤三者之间的分子水平研究机制逐步开展分析，将会开发出越来越多的新型生物农药，达到良好的应用效果，用于造福于人类。

参考文献

[1] Yerra Koteswara Rao， Hung-Yuh Lin， Wen-Shi Wu， et al. Evaluation of HPLC and MEKC methods for the analysis of lipopeptide antibiotic iturin a produced by Bacillus  amyloliquefaciens[J]. International Journal of Applied Science and Engineering， 2008， 6（2）： 85-96.

[2] Valerie Leclere， Marti R， Max Bechet， et al. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties[J]. Archives of Microbiology， 2006， 186（6）： 475-483.

[3] 熊毅，段燕文，朱湘成.表面活性素在药物开发中应用的研究进展[J].中国医药工业杂志，2022，53（1）：56-64.

[4] 李道明，王瑛，陈超，等.芽孢杆菌几种重要抗菌脂肽研究进展[J].生物工程学报，2022，38（5）：1768-1783.

[5] 付雯，高永祥，张晓勇.伊枯草菌素研究进展[J].安徽农学通报，2014，20（24）：23-26.

[6] 王星云，宋卡魏，张荣意.枯草芽孢杆菌菌剂的开发应用[J].广西热带农业，2007（2）：32-35.

[7] 黄慧婧，罗坤.芽孢杆菌与杀菌剂复配防治植物病害的研究进展[J].微生物学通报，2021，48（3）：938-947.

[8] 李晨楚，张荣意，康迅，等.枯草芽孢杆菌B43对香蕉枯萎病菌抑菌活性及其活性成分分析[J].中国南方果树，2017， 46（3）：57-63，71.

[9] 冉军舰，徐剑宏，胡晓丹，等.1株产脂肽类抗生素芽孢杆菌的鉴定及脂肽类抗生素相关基因克隆[J].食品科学， 2016，37（17）：127-132.

[10] 向亚萍.芽孢杆菌脂肽类抗生素多样性与罗克霉素合成酶启动子关键调控因子的初步研究[D].南京：南京农业大学，2018.