环状RNA在三阴乳腺癌中的研究进展

吴松, 唐海林

中山大学肿瘤防治中心,广东广州510060

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性人群发病率最高的肿瘤,严重威胁着全球女性的健康[1]。三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中复发、转移和死亡率最高的亚型,在BC中所占比例为10%～20%[2]。TNBC的特征为不表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2);由于TNBC特殊的分子分型,TNBC对内分泌治疗或分子靶向治疗并不敏感[3]。由于目前仍缺乏有效的TNBC治疗方案,早期发现和有效的靶向治疗对于TNBC患者尤为重要。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是以共价键形式形成闭合的环状结构单链RNA,缺乏5′端帽子和3′poly(A)尾,被证实可参与多种疾病的发生和发展过程,包括神经系统疾病、心血管疾病和肿瘤等[4-5]。研究表明,环状RNA的异常表达可通过影响TNBC细胞的增殖、凋亡、转移和耐药等过程,最终调控TNBC的进程[6]。因此,环状RNA可能是TNBC潜在的生物标志物或治疗靶点。本文主要阐述了环状RNA的形成、作用机制和对TNBC潜在的临床意义,为未来的临床应用提供有效的信息。

1 环状RNA的形成

与信使RNA(messenger RNA,mRNA)的线性剪接相比,环状RNA的形成主要依赖于前体mRNA的反向剪接机制,即前体mRNA下游5′剪接位点(剪接供体)与上游3′剪接位点(剪接受体)通过3′-5′磷酸二酯键连接形成反向剪接位点[7]。根据组成成分的不同,环状RNA可分为外显子环状RNA(exonic circRNA,ecircRNA)、内含子环状RNA(circular intronic RNA,ciRNA)、外显子-内含子环状RNA(exonic-intron circRNA,EIciRNA)和融合基因来源的环状RNA等4种类型[8]。研究表明,4种环化机制与ecircRNA和EIciRNA的生成相关,包括内含子配对驱动环化、套索驱动环化、依赖RNA结合蛋白(RNA-binding-protein,RBP)驱动环化和依赖小核核糖核蛋白驱动环化机制[6]。ciRNA主要的产生机制是,反向互补的特定内含子配对环化形成含有3′-5′磷酸二酯键的RNA套索,随后切除3′尾巴并形成ciRNA。ciRNA和EIciRNA定位在细胞核中。环状RNA如何从细胞核运输至细胞质中的机制尚不明确。此外,m6A修饰也被报道会影响环状RNA的核输出[9]。环状RNA的闭合环状结构可以有效抵抗核酸外切酶的降解,所以比线性RNA拥有更长的半衰期[10]。总之,环状RNA的稳态丰度是生成效率、核输出率和降解率三者平衡的结果。

2 环状RNA的作用机制

研究表明,环状RNA在基因表达的过程中具有重要作用[11]。环状RNA可调控转录和剪接、作为微小RNA(microRNA,miRNA)海绵、与蛋白质结合以及作为翻译模板,进而影响基因表达。

2.1 调控转录和剪接

环状RNA可参与转录和选择性剪接的调控过程。位于细胞核中的ciRNA和EIciRNA可通过结合RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)复合体调控基因表达。circANKRD52和circSIRT7聚集在其转录位点,通过与RNA Pol Ⅱ复合物相互作用从而上调亲本基因的转录[12]。Guarnerio等[13]发现,circPOK在细胞核中结合并激活LIF2/3复合体,从而在间充质肿瘤中发挥促癌作用。研究表明,剪接因子可调控环状RNA的生成和选择性剪接之间的平衡[14]。circMBL由MBL基因的第2外显子反向剪接生成,该过程与MBL的选择性剪接互相竞争。circMBL和circMBL的侧翼内含子均具有保守的MBL蛋白结合位点,这些位点可被MBL牢固而特异地结合。高表达的MBL与circMBL侧翼内含子结合,促进circMBL的反向剪接而抑制MBL mRNA的表达,同时circMBL也会与增加的MBL结合,使其含量趋于稳定[14]。

2.2 与miRNA结合

环状RNA可通过作为miRNA海绵参与转录后的基因调控。miRNA通过与mRNA 3′非编码区碱基直接配对,降低mRNA稳定性和抑制翻译,从而负性调控mRNA的基因表达。环状RNA含有不同类型的miRNA反应元件,可通过碱基互补配对原则竞争性结合miRNA,解除miRNA对靶基因的抑制作用,进而上调靶基因的表达,即形成circRNA/miRNA/mRNA调控轴;该作用机制研究最充分的例子是环状RNA CDR1as,它与miR-7有70多个保守的结合位点,并被miRNA结合蛋白AGO蛋白紧密结合[15]。刘睿涵等[16]报道,环状RNA结合miRNA后在乳腺癌脑转移中发挥关键性作用。本团队近期发现,circROBO1通过竞争性结合miR-217-5p上调KLF5的表达,形成circROBO1/miR-217-5p/KLF5调控轴,并通过抑制BECN1的转录进而抑制afadin的选择性自噬[17]。

2.3 与蛋白质结合

环状RNA具有RBP的结合位点,可通过与蛋白质相互作用来发挥功能。环状RNA不仅可作为支架将不同蛋白质招募或阻滞到特定亚细胞器,也可与其他RNA和蛋白质形成复合物,从而调节信号通路。环状RNA FECR1与TET1结合并可招募到FLI1的启动子区域,还可结合并下调DNMT1,最终导致CpG岛的DNA去甲基化并激活FLI1转录[18]。位于细胞质中的circFoxo3与抗衰老蛋白ID1、E2F1以及抗应激蛋白FAK、缺氧诱导因子-1α相互作用,阻止这些蛋白进入细胞核,使其滞留在细胞质中,从而促进细胞衰老和应激[19]。研究表明,circFoxo3能够结合CDK2和p21,形成circFoxo3-p21-CDK2三元复合物,阻断细胞由G1期进入S期,从而阻断细胞周期进程[20]。环状RNA也可以作为竞争元件阻断RBP功能。位于细胞质的circPABPN1可通过与RBP HuR结合,阻断HuR与PABPN1 mRNA结合,进而抑制PABPN1的蛋白翻译过程[21]。

2.4 作为翻译模板

环状RNA具有翻译成蛋白质或者多肽的潜能。一些具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的环状RNA可以利用起始密码子,以不依赖帽子结构的方式进行翻译。本团队发现,circFBXW7不仅作为内源竞争RNA竞争性结合miR-197-3p而抑制TNBC生长,还可翻译一种新型蛋白FBXW7-185aa,FBXW7-185aa蛋白可增加FBXW7的丰度和促进c-Myc降解,最终抑制TNBC细胞的增殖和转移[22]。不依赖于帽子结构的蛋白翻译是低效的,但是在饥饿和热休克等压力条件下,环状RNA的翻译效率得到提升[23]。此外,m6A修饰也可启动环状RNA翻译。Wen等[24]发现,环状RNA富集m6A motif,且一个m6A位点就能够启动翻译的起始过程。m6A启动的翻译需要起始因子eIF4G2和m6A识别蛋白YTHDF3,同时能被甲基转移酶METTL3/14加强,能被去甲基化酶FTO抑制,也能被激活上调。该团队进一步发现,m6A驱动的环状RNA翻译广泛存在,有数百个内源性环状RNA都具有翻译潜能[24]。

3 环状RNA在TNBC的生物学功能

随着高通量测序和芯片技术的高速发展,越来越多环状RNA在TNBC中的功能和潜在机制被报道。环状RNA通过直接或间接调控肿瘤相关信号通路,在TNBC肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡、自噬、血管生成和化疗耐药等方面发挥重要作用[25]。

3.1 调控TNBC肿瘤细胞的增殖

环状RNA可作为促癌或抑癌分子参与TNBC肿瘤细胞的增殖和生长过程。上调的环状RNA一般被认为是促进肿瘤发生、细胞增殖、侵袭和转移的促癌基因,同时可以抑制细胞周期和凋亡。研究发现,circGFRA1、circEPSTI1、circKIF4A、circRAD18、circPLK1和circGNB1在TNBC细胞和组织中均上调[26],能够在小鼠体内外研究中促进细胞增殖和肿瘤生长。circ_0004676通过miR-377-3p/E2F6/PNO1轴在体外实验可显著加速细胞周期,促进TNBC细胞的增殖和迁移,在小鼠体内试验可促进肿瘤的生长和转移[27]。circSEPT9在TNBC组织中表达上调,与较差的临床分期和预后相关。E2F1和EIF4A3介导生成的circSEPT9可通过miR-637的海绵调控LIF的表达,激活LIF/STAT3信号通路,从而促进TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制TNBC细胞凋亡和自噬[28]。

3.2 调控TNBC的侵袭和转移

环状RNA在TNBC的侵袭和转移过程中起着重要作用[25]。上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是以上皮细胞极性和黏附能力丧失,间充质增加为特征的过程,该过程可通过增强移动性、侵袭性和对凋亡刺激的抵抗,赋予肿瘤细胞转移特性。circKIF4A[29]和circPLK1[30]等环状RNA通过不同的分子机制最终靶向EMT信号通路,从而促进TNBC细胞的侵袭和转移。circNR3C2在TNBC中显著下调,其表达与TNBC的远处转移及预后呈负相关。体内外实验进一步表明,circNR3C2/miR-513a-3p/HRD1轴通过诱导多泛素介导的波形蛋白降解,抑制TNBC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT过程[31]。曾凯旋[32]发现,circANKS1B通过诱导EMT促进TNBC细胞系MDA-MB-231在体内外的侵袭和转移能力,而对肿瘤的增殖和生长无影响。在机制上,circANKS1B通过竞争性吸附miR-148a-3p和miR-152-3p,增加了转录因子USF1的表达,激活转化生长因子-β1/Smad信号通路,最终促进EMT。刘庆等[33]发现,环状RNA circ0000799可经miR-1287-5p/GPX4轴调控铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移。

3.3 调控TNBC的耐药

化疗是TNBC患者的关键治疗方案。TNBC常用的化疗药物包括环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素(adriamycin,ADM)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)等。早期TNBC的标准治疗方案为新辅助化疗后手术。对于复发或难治性TNBC患者,目前还没有标准的化疗方案。晚期TNBC患者可用的治疗方法包括抗代谢物卡培他滨和吉西他滨、非紫杉烷微管动力学抑制剂艾瑞布林和DNA交联铂类药物[34]。而化疗耐药是目前临床治疗的主要限制因素。研究发现,环状RNA在TNBC化疗耐药过程中发挥重要作用。circKDM4C[35]被发现在TNBC中与ADM耐药相关。circGFRA1[36]被报道可能是导致TNBC细胞对PTX耐药的重要因素。circHER2编码一种新型蛋白质HER2-103,因为HER2-103与HER2 CR1结构域具有大部分相同的氨基酸序列,所以HER2-103可被HER2抗体帕妥珠单抗拮抗。帕妥珠单抗能显著降低circ-HER2/HER2-103阳性TNBC细胞的体内致瘤性,但对不表达circ-HER2/HER2-103的TNBC细胞无影响[37]。

4 环状RNA在TNBC的临床意义

4.1 TNBC的诊断和预后标志物

早期筛查和诊断可提高TNBC的疗效,降低TNBC患者的死亡率。环状RNA存在以下特征:①因其末端的闭环结构,环状RNA比线性RNA更为稳定;②在组织中广泛表达,部分环状RNA的表达水平比其亲本基因的mRNA更高;③存在组织以及阶段的特异性,部分环状RNA的组织特异性比其亲本基因的mRNA更高。由于环状RNA在构象、稳定性、丰度、时空特异性表达和免疫原性上都不同于mRNA,与其他标志物相比,环状RNA作为生物标志物可能具有更好的分析有效性[38]。研究报道,TNBC患者的乳腺组织标本和体液中可检测到不同的特异性环状RNA,这些环状RNA有可能作为理想的TNBC诊断标志物,在TNBC活检方面有极大的应用前景[39]。此外,与生存期和临床病理特征相关的环状RNA可能是TNBC患者的独立预后因素。研究证实,环状RNA的表达与TNBC的临床参数显著相关,包括肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、TNM分期、总生存期和无病生存期等,已有报道21种环状RNA对TNBC患者具有预后价值[25]。冯晴等[40]发现,血清miR-21、miR-30b对乳腺癌患者术后曲妥珠单抗靶向治疗心脏毒性具有很好的预测价值。本团队发现,circKIF4A与肿瘤分级、淋巴结及远处转移相关,是TNBC的独立预后因素,而circFBXW7的表达与肿瘤分期、淋巴结转移呈负相关[29]。

4.2 TNBC的潜在治疗靶点

环状RNA通过扮演促癌因子或抑癌因子的角色,参与了TNBC细胞的增殖、转移、凋亡,以及TNBC血管生成和耐药等过程[25]。因此,环状RNA可作为TNBC的潜在治疗靶点。针对促癌的环状RNA反向剪接位点设计小干扰RNA和互补的反义寡核苷酸,使用CRISPR-Cas9编辑来诱导促癌环状RNA失活,或者通过递送含有重复miRNA结合位点的环状RNA增加抑癌环状RNA的含量,将可能产生显著的抑癌作用。He等[41]证明,尾静脉注射靶向ciRS-7的小干扰RNA可以抑制TNBC细胞在体内肝和肺转移,这表明促癌的ciRS-7有可能成为TNBC治疗的潜在治疗靶点;随着技术的发展,细胞外囊泡和纳米粒子可用于增强环状RNA在体内的导入或传递过程。对于编码蛋白的环状RNA,可以在其开放阅读框前加入IRES元件,极大地提高编码蛋白的表达水平,具有产生肿瘤抑制蛋白、肿瘤特异性抗体或免疫刺激细胞因子等潜力[42]。干扰耐药相关环状RNA也可能影响TNBC患者对化疗的敏感性。circGFRA1通过TLR4通路促进TNBC对PTX的耐药。在PTX处理的TNBC PDX小鼠模型中,与对照组小鼠相比,敲低circGFRA1组小鼠的TLR4表达量降低,肿瘤的体积也缩小[36]。

5 结语与展望

环状RNA参与TNBC的发生发展及耐药过程。但由于环状RNA的研究进展大多发生在近十年间,其作用机制和功能尚存在疑点和争议,合成技术和研究方法存在局限性,与肿瘤驱动基因之间的关系仍未明确。此外,有学者提出,那些低丰度的环状RNA很可能是剪接过程的副产物,且几乎没有功能[43];但这些低丰度环状RNA存在序列同源折叠,这给目前的环状RNA的检测和定量方法带来了挑战。尽管天然环状RNA的作用和合成的环状RNA生物学功能仍有待进一步探索,但目前环状RNA作为一类新兴的肿瘤生物标记物、RNA治疗药物和疫苗已展示出广泛的应用前景。随着技术的发展及临床试验的进行,基于环状RNA的应用将得以开展,为TNBC患者带来可靠的生物标记物和新的治疗靶点。