正交设计优选广西钩藤总黄酮的提取工艺及抗氧化活性研究

2024-05-30徐小娜马丽邓蓉潘兰莹欧阳云

品牌与标准化 2024年2期

徐小娜马丽邓蓉潘兰莹欧阳云

【摘要】目的：优化广西钩藤总黄酮的超声波辅助提取工艺，并检测其体外抗氧化活性。方法：采用UV法检测钩藤总黄酮含量；以总黄酮提取率为考察指标，采用正交设计法优化钩藤总黄酮的超声波辅助提取工艺条件；利用DPPH法检测乙醇提取物清除DPPH的活性。结果：采用超声波辅助提取法提取两次，超声功率360 W，最佳提取工艺为60倍量60%乙醇、超声提取30 min、提取温度70℃；在0.05～0.25 mg/mL范围内，随总黄酮提取物浓度的增加，提取物對DPPH的清除率增大；当提取物浓度为0.25 mg/mL时，柳州、梧州、钦州、玉林和桂林等5个产地的钩藤总黄酮对DPPH的清除率均在85%以上，分别为92.0%、91.6%、86.9%、90.8%、85.7%和97.3%。结论：该提取工艺稳定可行，可作为钩藤总黄酮的提取工艺；钩藤黄酮醇提取物对DPPH具有清除作用，可为钩藤黄酮的深入开发提供参考。

【关键词】钩藤；总黄酮；正交设计；含量测定；体外抗氧化

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.008

【基金项目】本文受广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2023KY0527），桂林医学院人才引进科研项目（20501020028），桂林医学院大学生创新创业训练计划项目（S202110601112）资助。

Extraction Optimization by Orthogonal Design and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Guangxi Gambir Plant Rhynchophylla

XU Xiaona1，2， MA Li1， DENG Rong1， PAN Lanying1， OUYANG Yun1，2

（1.Guilin Medical University〔School of Public Health〕， Guilin 541199， China； 2.The Guangxi Key Laboratory of Environmental Exposomics and Entire Lifecycle Health， Guilin 541199， China）

Abstract： Objective： To optimize the ultrasonic assisted extraction process of total flavonoids from Guangxi gambir plant and detect their in vitro antioxidant activity. Method： UV method was used to detect the total flavonoid content in gambir plant； Using the extraction rate of total flavonoids as the evaluation index， the orthogonal design method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction process conditions of total flavonoids in Hook Vine； Use DPPH method to detect the activity of ethanol extract in clearing DPPH. Result： The ultrasound assisted extraction method was used twice， with an ultrasound power of 360 W. The optimal extraction process was 60 times the amount of 60% ethanol， ultrasound extraction for 30 minutes， and extraction temperature of 70℃； Within the range of 0.05～0.25 mg/mL， as the concentration of total flavonoid extract increases， the clearance rate of the extract towards DPPH increases； When the concentration of the extract was 0.25 mg/mL， the total flavonoids of gambir plant from five production areas including Liuzhou， Wuzhou， Qinzhou， Yulin， and Guilin all had a clearance rate of over 85% for DPPH， which were 92.0%， 91.6%， 86.9%， 90.8%， 85.7%， and 97.3%， respectively. Conclusion： The extraction process is stable and feasible， and can be used as the extraction process for the total flavonoids of gambir plant； The alcohol extract of Houttuynia cordata has a clearing effect on DPPH， which can provide reference for the in-depth development of Houttuynia cordata flavonoids.

Keywords： gambir plant； total flavonoids； orthogonal design； determination； in vitro antioxidant properties

钩藤为茜草科钩藤植物，主要生长在我国南方地区，属中医常用药，具有清热平肝、息风定惊、降压等功效，用于治疗头痛眩晕、感冒夹惊、惊痫抽搐、高热惊厥、妊娠子痫等症。钩藤干燥根茎为广西的特色药，其主要含有生物碱、木脂素、三萜、黄酮、香豆素等化学成分。目前，有关钩藤生物碱成分的研究报道较多，而关于钩藤总黄酮的研究报道较少。黄酮是一类极为重要的药理活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等丰富的生物学活性。本文以钩藤总黄酮提取率为考察指标，采用正交设计法对其超声波醇提工艺进行优化，建立钩藤总黄酮的可见光度测定方法，同时对其体外抗氧化活性进行研究，为钩藤黄酮的深入开发提供参考。

1实验

1.1材料、试剂与仪器

钩藤样品于2021年11月分别采集于广西桂林、柳州、玉林、梧州、钦州等地。

芦丁标准品（批号MUST-22081108），成都曼斯特生物科技有限公司；DPPH试剂（1，1-二苯基-2-苦基肼），纯度> 97.0%，京东化成工业株式会社；维生素C（抗坏血酸）（批号1028NO34），纯度99.0%，北京索莱宝科技有限公司；实验所用其他试剂均为分析纯；水为怡宝纯净水。

UV-2700型紫外-可见分光光度计，日本岛津；YZ-360DB型数控超声波清洗器，上海越众仪器设备有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1）标准溶液

精密称取芦丁标准品10.00 mg，加无水乙醇，超声溶解后，定容至刻度，配制成0.2000 mg/mL的芦丁应用液。

2）样品溶液

称取0.5 g钩藤粗粉，按料液比1∶60（g∶mL）加入60%乙醇，超声提取30 min，过滤；残余钩藤渣重复上述操作，合并滤液，用60%乙醇补足；取25 mL，用蒸馏水补足至50 mL。

3）DPPH工作液

精密称取3.9 mg DPPH，用无水乙醇溶解，配制成0.1 mmol/L的DPPH贮备液，避光保存，备用。

1.2.2标准曲线的绘制

吸取芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL具塞比色管中，各加无水乙醇至10 mL。采用亚硝酸钠比色法显色，先加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀静置6 min；再加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖匀静置6 min；最后加4%NaOH溶液8 mL，混匀后静置20 min，以未加芦丁标准溶液的试液作空白，测定各溶液在510 nm波长处吸光度，绘制标准曲线。

1.2.3样品测定

分别吸取适量来自广西桂林、柳州、玉林、梧州和钦州的钩藤总黄酮提取物溶液，按1.2.2给出的方法测定吸光度，依据线性回归方程计算5个产地钩藤中总黄酮的含量。

1.2.4抗氧化活性评价：PPH自由基清除实验

参考文献配制0.4 mg/mL 5种不同产地钩藤总黄酮提取液，分别稀释成0.05、0.08、0.11、0.13、0.16、0.19、0.21、0.24、0.27、0.30 mg/mL的样品溶液。取3 mL各浓度的样品溶液，加入2 mL的0.1 mmol/LDPPH自由基溶液，室温下避光静置，30 min后测定溶液在510 nm波长处吸光度，按公式（1）计算DPPH自由基清除率。

2方法与结果

2.1总黄酮含量测定

2.1.1芦丁标准曲线的测定

参考文献，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定总黄酮含量。回归方程为A=5.2114c-0.0029，相关系数R2=0.9993，表明在0.020～0.100 mg/mL范围内芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2.1.2方法学考察

1）重复性试验

平行制备高、中、低3个不同浓度的芦丁对照品溶液进行重复性试验，按NaNO2-Al（NO3）3比色法进行检测，计算RSD分别为0.37%、0.38%和0.28%（n=6）。

2）稳定性试验

取供试品溶液，在0、20、40、80、100、120 min按NaNO2-Al（NO3）3比色法进行检测，吸光度值的RSD为0.33%（n=6），表明供试品溶液至少在120 min内稳定。

3）加样回收试验

精密称定9份已知含量的钩藤药材，分别按低、中、高3个水平精密加入芦丁适量，按1.2.2给出的方法显色操作，测定吸光度，计算出平均回收率为98.51%，RSD为1.52%（n=6）。

2.2正交试验优选钩藤提取工艺

2.2.1正交试验

以乙醇溶液为提取溶剂，考察乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4个影响因素，采用L9（34）正交设计，因素水平表见表1，正交试验设计及结果见表2，正交试验方差分析见表3。

由表2可知，影响钩藤总黄酮提取率因素的强弱顺序为：提取时间>提取温度>料液比>乙醇浓度；最优提取工艺条件为：乙醇浓度60%、料液比1∶60、提取温度70℃、提取时间30 min。

由表3可知，提取时间对钩藤总黄酮提取效率影响较显著（P<0.05），乙醇浓度、料液比以及提取温度对钩藤总黄酮提取效率影响均不显著（P>0.05）。

2.2.2验证试验

对正交试验优化的钩藤总黄酮提取工艺进行验证，设计3次平行试验，检查预测的钩藤总黄酮新提取工艺的准确性和稳定性。精确称取钩藤粉末0.50 g（精确至0.0001 g）3份，测得钩藤总黄酮提取率分别为7.195%、7.251%和7.208%，平均值为7.218%，高于表2中的总黄酮提取率，说明本工艺条件合理，稳定性较好。

2.3钩藤总黄酮提取物对DPPH自由基的清除效果

按1.2.4给出的方法检测柳州、梧州、钦州、玉林和桂林等不同广西产地钩藤总黄酮对DPPH的清除作用，结果见表4。

由表4可知，采用最佳提取工艺提取得到的钩藤总黄酮提取物对DPPH自由基有较好的清除效果；对同一产地钩藤总黄酮提取物而言，在0.05～0.25 mg/mL范围内，随提取物总黄酮浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也随之增大；相同浓度不同产地的钩藤总黄酮提取物对DPPH自由基的清除效果各不相同，柳州、梧州和钦州的清除效果较强，玉林和桂林的清除效果较弱；当钩藤总黄酮提取物浓度增至0.25 mg/mL时，柳州、梧州、钦州、玉林和桂林等5个产地的钩藤总黄酮提取物对DPPH自由基的清除率均在85%以上，分别为92.0%、91.6%、86.9%、90.8%、85.7%和97.3%。

3结束语

本文以钩藤总黄酮含量为评价指标，采用正交试验设计优化广西钩藤总黄酮的超声波醇提工艺，最佳提取工艺条件为：超声辅助提取两次，最佳工艺为60倍量6 %乙醇、超声时间30 min、提取温度70℃，提取工艺稳定可行。同时，利用DPPH自由基法检测钩藤总黄酮醇提物清除自由基的活性，结果表明，不同产地不同浓度的广西钩藤总黄酮醇提物对DPPH自由基均具有一定的清除作用。研究结果可为钩藤黄酮的深入开发提供参考。

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【作者简介】

徐小娜，女，1974年出生，副教授，博士，研究方向为复杂体系多组分成分分离分析。