哺乳动物精子磷脂酶C zeta(PLCζ)在受精中作用的研究进展

张乐颖,陈柏达,张 鲁*

(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京 102629;2.中国农业大学动物科学与技术学院,北京 100193)

受精过程是哺乳动物高度特化的配子结合产生新生命的过程。受精不是单一的或孤立的现象,而是由一连串的生物学事件组成的链式反应,任何一个步骤的中断都可能导致受精失败。其中,精卵融合后引起的卵子激活是最为重要的事件,是启动胚胎成功发育的关键。现在已确定,精子通过触发细胞质内游离钙离子(Ca2+)浓度的迅速上升,进而诱导卵子的激活[1]。受精时卵子内的Ca2+信号对哺乳动物和非哺乳动物同样重要,非哺乳动物如鱼类、蛙类和海胆等动物受精中,卵子激活时Ca2+信号表现为单个瞬时峰值升高;而哺乳动物精子引发Ca2+信号呈周期性瞬时升高,称为Ca2+振荡[2]。精子诱导的Ca2+振荡是激活卵子和启动胚胎发育的关键。Ca2+振荡是卵子完成一系列激活事件的必要和充分条件,Ca2+振荡调控卵子恢复和完成减数分裂,促进雌雄原核形成和融合及皮质颗粒的释放,以阻止多精入卵[3]。哺乳动物的卵子在受精前停滞在减数分裂第二中期(MⅡ),精子诱导的Ca2+振荡能使细胞周期素B(cyclin B)及其细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)活性丧失,减数分裂恢复,细胞周期转变为后期,并释放出第二极体[3]。此后,雌雄原核形成,代表着减数分裂完成,合子进入有丝分裂细胞周期的第一个间期[3]。此外,卵子胞质内Ca2+的增加可以刺激钙调蛋白依赖性激酶(CaMKⅡ)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK),从而牵引皮质颗粒向卵黄膜移动并与之融合。哺乳动物卵子的激活还涉及皮质颗粒的胞吐,引起透明带的修饰和卵黄膜的改变,以防止后续精子的穿透[4]。文章系统地阐述了关于受精过程中精子内诱导Ca2+振荡分子的鉴定和机制研究,并讨论了相关精子缺陷引起的人和动物的生殖障碍,以及相应的人工卵子激活方法,以期为增进人类生殖健康和提高动物繁殖效率提供参考。

1 精子PLCζ的鉴定和功能研究

1.1 “精子因子”假说到磷脂酶C zeta(phospholipase C zeta,PLCζ)的发现

在受精过程中,Ca2+升高对卵子激活起着至关重要的作用,研究者针对卵子Ca2+变化发生的机制提出了包括“精子因子”在内的许多假说,鉴定出一系列精子卵母细胞激活因子(sperm oocyte activation factor, SOAF),如三磷酸肌醇(InsP3)、NO和氧化型辅酶Ⅱ(NAADP+),都能引起卵子内Ca2+升高,但都不能完全模拟受精过程的Ca2+振荡[5-7]。通过显微操作将仓鼠精子提取物注射到卵子,观测到持续的Ca2+振荡,这是哺乳动物精子因子鉴定的第一份明确证据[8]。在人和小鼠的研究中,卵胞浆内单精子注射(ICSI)精子胞质提取物或完整精子都能够启动Ca2+振荡,这与观察到的体外受精(IVF)时Ca2+变化模式相同[9-10]。同时,精子介导的Ca2+振荡是由卵子内IP3信号通路激活所引起,这提示精子因子本身可能是一种PLC酶,在体外生化试验中发现,哺乳动物精子提取物能水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),具有明显的PLC酶活性[11]。而小鼠卵子显微注射体细胞PLC异构体的重组蛋白,要么未能引发任何Ca2+振荡,要么仅能观测到一些非特异的Ca2+释放[12-13]。此外,对精子提取物进行色谱层析检测,在具有Ca2+振荡诱导活性的蛋白质部分中,没有检测到任何一种当时已知PLC异构体存在[13]。这些证据表明,有一种新的PLC异构体存在于哺乳动物精子中,在受精过程中诱发卵子的Ca2+振荡。随后,根据小鼠体细胞PLC基因序列信息进行同源性搜索后,发现了睾丸表达的新的PLC序列[14]。随后,从小鼠精子cDNA文库中成功扩增出一个2.2 kb的产物,其中包含一个1 941 bp的开放阅读框,编码一个具有647个氨基酸残基的蛋白[14-15]。此PLC蛋白与其他哺乳动物的磷脂酶具有明显的同源性,但其表达局限于睾丸内,这种新的PLC异构体被命名为PLCζ[14-15]。

1.2 精子PLCζ是受精时卵子激活的关键蛋白

功能性试验也证明了PLCζ在不同哺乳动物的卵子激活中都起着关键作用,是决定受精成败的关键蛋白[14-16]。而特异性抗体对精子提取物中的PLCζ进行干扰,其不能再触发小鼠卵子的Ca2+振荡[14]。给卵子注射PLCζ 蛋白或其互补RNA,不仅能诱发Ca2+振荡,而且激活卵子可以发育到囊胚阶段[17-18]。对注射cRNA后的小鼠卵子中表达的PLCζ蛋白进行定量,发现PLCζ达到40 fg时,能有效地触发生理模式的Ca2+振荡,与单个小鼠精子内测得的PLCζ蛋白量相似[17-18]。此外,通过RNA干扰(RNAi)技术生产的转基因小鼠产生的精子,PLCζ表达显著减少,受精时的Ca2+振荡过早终止,虽然没有发生不育,但这些精子中PLCζ含量低的小鼠表现出产仔数减少[19]。一些临床报告也证实了PLCζ在哺乳动物受精中的重要性,人类精子PLCζ的缺陷(表达水平降低或突变)与男性不育症的记录有关[20-22]。在两个不育的兄弟中发现了第一个同源的PLCζ突变,即489处氨基酸残基处异亮氨酸代替了脯氨酸(I489P),使用这种PLCζ突变的精子受精卵子Ca2+信号异常,无法激活卵子,导致早期胚胎发育停止[23-25]。但是, I489P突变的杂合子男性可以生育[23-25],这表明PLCζ功能受到特定的干扰才会导致不孕,但相关的机制仍未有待深入的研究。

近年来,两个利用PLCζ基因敲除小鼠的独立研究发现,在卵胞浆内单精子注射后,缺乏功能性PLCζ蛋白的精子不能引起Ca2+振荡[26-27]。然而,这两种不同类型的PLCζ基因敲除的小鼠,雄性仍然可以生育后代,但产仔的数量显著减少[26-27]。体外受精试验发现,缺乏PLCζ的精子仍可引起约70%的卵母细胞激活,仅可以观测到有限数量的Ca2+振荡,而且原核形成显著延迟、多精入卵比例升高[26-27]。敲除PLCζ雄性未完全丧失生育能力,但卵子激活受影响,PLCζ可能是受精时卵子激活的主要因子。但不排除精子中可能存在其他补偿机制,在缺乏PLCζ时仍能部分完成卵子的激活,但它们在引起Ca2+释放方面似乎不如PLCζ有效。这些研究表明,精子PLCζ是人们长期寻找的哺乳动物“精子因子”,其在哺乳动物受精时诱发Ca2+振荡,决定卵子激活,并影响早期胚胎发育。

1.3 其他“精子因子”候选分子的鉴定

研究者也报道了其他哺乳动物的“精子因子”候选分子。首先是一个大小为33 ku称为oscillin的蛋白,定位在人、小鼠和猪的精子赤道带[28-32]。但显微注射人的oscillin蛋白不能引起小鼠卵子呈现受精时典型模式的Ca2+振荡[32],后续没有对其进行基因敲除或者其他同源蛋白在受精机制方面的研究。另一个蛋白是一个截短形式的kit受体(truncated c-kit tyrosine kinase, tr-kit),其在小鼠精子发生的晚期积累,将tr-kit重组蛋白显微注射到卵子内能引起类似孤雌激活的效应,但不呈现受精时典型模式的Ca2+振荡[33-34]。最近,有研究鉴定出一种精子头部的蛋白,即post-acrosomal sheath WW domain-binding protein(PAWP),位于精子核周膜的顶体后鞘区域,能够引发人类和小鼠卵子的Ca2+振荡和原核形成[35-36]。共同注射一种能与PAWP蛋白的WWI结构相结合的肽段可以阻断精子诱导的Ca2+振荡,这种肽段是PAWP蛋白的竞争性抑制剂[35-36]。尽管这些研究发现PAWP在哺乳动物卵子激活中的潜在作用一致,但这些数据尚未在其他研究中得到验证。有研究发现,PAWP不能引起卵子中的Ca2+释放[35-36]。重要的是,更多的试验显示PAWP衍生的抑制性肽段不能阻断IVF或ICSI后精子诱导的Ca2+振荡[37]。最近,对缺失PAWP雄性小鼠的受精能力进行分析,用PAWP缺失小鼠的精子进行ICSI,与对照组相比,PAWP的缺失并没有引起Ca2+振荡或胚胎后续发育的任何定量差异,显示PAWP在小鼠受精中并不发挥重要作用[38-39]。临床研究显示PLCζ、PAWP和TR-KIT的表达在圆头精子症患者的精细胞内表达都降低[40],但PLCζ目前仍是哺乳动物受精时唯一能引发卵子Ca2+振荡、成功激活卵子而启动早期胚胎发育的蛋白,其他蛋白的作用及其之间的关系仍不清楚,有待进一步研究。

2 PLCζ在哺乳动物精子内的定位与分布

蛋白质在细胞内的定位与其生物学功能相适应,PLCζ在精子特定区域的定位可以使酶迅速扩散到卵子的胞质中,在精卵融合后快速启动Ca2+振荡。利用抗体观测人类精子,发现PLCζ主要定位于精子头部的顶体后缘和赤道区,在颈部和中段有少量定位[41-42]。在对小鼠、仓鼠和猪的精子进行的免疫荧光成像研究中,已经发现了两种不同的PLCζ定位群体,即顶体和顶体后[43-44]。然而,在马精子中的PLCζ存在于顶体、赤道段和头部中段及鞭毛的主要部分[45]。研究人员将分离的马精子尾部显微注射到小鼠卵子中引发Ca2+振荡[45]。而使用多克隆抗体观测发现,PLCζ定位于小鼠和人类精子的顶部,在附睾内精子成熟期间PLCζ分泌后会在精子头部进一步聚集[46]。尽管PLCζ在精子中的浓度比卵子内高一个数量级,尚不确定其在精子中是如何保持无酶活性的。可以推测,在精子内PLCζ可能被包裹,以确保其远离催化底物,或者精子内有抑制因子专门与PLCζ结合,并使其处于非活性状态。另外,精子PLCζ也可能有翻译后修饰,导致其活性受到抑制,一旦PLCζ被递送到卵子内,抑制就解除[47]。尽管在诱导运动、获能和顶体反应期间存在明显的Ca2+上升,但精子中PLCζ活性的抑制可能是防止早期和不受控制的顶体反应所必需的。

3 精子PLCζ蛋白结构研究

哺乳动物精子PLCζ是已知13种PLC同工酶中的分子质量最小的,其具有最基本的功能结构域,诱导Ca2+振荡活性明显优于其他体细胞表达的PLC。PLCζ的主要结构域与其他PLC异构体(β、δ、λ、η和ε)相同, PLCζ与PLCδ同构体的结构最为相似,与PLC δ1的序列一致性最大(33%),与PLCε的一致性最小(9%)[48]。但PLCζ的结构域更加离散,使其具有独特的生理特性。首先,PLCζ具有4个串联的能与Ca2+结合的螺旋-环-螺旋拓扑结构,像人类拇指和食指,称为EF “手型”结构域[49]。相对于其他体细胞PLC异构体,PLCζ的EF结构域有较高的Ca2+敏感性,是PLCδ1的100倍,其半数效应浓度(EC50)达到80 nmol,PLCζ在卵子胞质静止的Ca2+水平(100 nmol)时已经达到一半的最大活性[50-51]。敲除两个EF后,PLCζ的EC50急剧变到30 nmol,导致其完全丧失诱导卵子Ca2+振荡的活性[51]。此外,PLCζ的EF结构域的N端富含碱性残基,第一个EF结构域和XY-连接体多碱基区有静电相互作用,被吸引到含阴离子的PIP2上[51]。

其次,XY结构域是PLC蛋白负责催化底物PIP2水解,具有高度保守性。所有的PLC异构体的XY结构域的相似度为60%,PLCζ的XY结构域与PLCδ1的XY有64%的相似性[52-53]。然而,用PLCδ1的XY替换PLCζ的,这种 PLCζ/PLCδ1蛋白嵌合体无法诱导小鼠卵子Ca2+振荡[54]。对PLCζ的XY结构域的氨基酸残基进行诱导突变,其酶活性完全丧失,引发哺乳动物卵子Ca2+振荡的能力[55]。PLCζ的XY结构域的点突变与人类精子功能丧失有关,导致男性不育症的发生[22-23]。X和Y之间具有连接序列称为XY连接体,具有调节PLCζ的酶活性、靶向PIP2脂质底物和核转位等的功能[56]。与PLCδ1相比,PLCζ的XY连接体更长,富含碱性残基[57]。PLCζ的XY连接体的缺失会显著降低水解PIP2和诱导Ca2+振荡的活性[58]。PLCζ的XY连接体区域内带正电的残基能通过与带负电荷的底物PIP2产生静电相互作用,直接参与其在生物膜上的定位[59]。据报道,小鼠PLCζ的XY连接区含有一个有八氨基酸残基(KKRKRKMK)核定位信号(NLS)序列,位于Y结构域的起点附近[60-61]。而猪的PLCζ在XY连接区断裂后仍然具有功能活性,完整的多肽对PIP2底物的水解可能并不重要,PLCζ在XY连接区域内的蛋白裂解可能在哺乳动物受精过程中具有重要的调节功能[62]。不同物种PLCζ的XY连接序列整体上都是净正电荷,XY连接序列在物种之间保守性最差的区域[63]。用小鼠PLCζ的XY连接域替换人类的相应区域,会使蛋白质的稳定性明显下降[64]。表明XY连接体的多样性可能是不同物种PLCζ对PIP2水解效率和诱导Ca2+振荡能力差异的原因。

最后,PLCζ的另一端是一段约有120个残基的C2结构域[49]。目前,对C2结构域的确切作用仍未得到清晰的解释,敲除C2结构域或用PLCδ1的对应序列替换,都能导致PLCζ完全丧失诱导卵子Ca2+振荡的活性,但水解PIP2的能力及其Ca2+敏感性不受影响[65]。C2结构域与PI3P的相互作用可能在PLCζ的定位中起作用,甚至可能在调节酶的活性中起作用,因为PI3P的存在已被证明会降低PLCζ在体外水解PIP2的活性[49]。尽管对C2结构域的潜在生理特性有了这些推测,仍需进一步深入研究。

4 PLCζ活性的物种特异性

尽管哺乳动物精子PLCζ的序列具有较高的保守性,但PLCζ的催化活性存在明显的物种差异。比较人和小鼠的PLCζ在诱导未受精小鼠卵子Ca2+振荡的相对效力时发现,重组纯化的人PLCζ蛋白的活性比小鼠PLCζ高76%[66]。此外,对人/小鼠PLCζ嵌合体蛋白的分析表明,EF结构域在PLCζ活性的物种特异性中发挥重要的作用[66]。对PLCζ活性表现的明显物种特异性的生理作用需要进一步研究。对猴和人PLCζ的主要结构进行比较发现,氨基酸序列几乎完全相同,只有XY连接区存在差异,人PLCζ缺少一个外显子[56]。大多数哺乳动物的PLCζ相对分子质量为74,人类PLCζ在XY连接区缺失单个外显子导致其相对分子质量降至70[56]。猴子和狨猴XY-linker中的单外显子相对应的33个氨基酸序列含有大量带负电荷,这会改变XY-linker区域内正/负电荷残基的比例[56]。XY连接区域外显子所编码的残基在PLCζ的酶或靶向活动中的确切功能还需要进一步研究。研究还发现,不同物种的精子中PLCζ的相对溶解度存在差异[66-67]。这可能与观察到的Ca2+振荡的启动时间有关,仓鼠精子含有高度可溶性的PLCζ,在精子与卵子融合后10 s内开始出现Ca2+振荡,而小鼠PLCζ的溶解度相对较低,精卵融合和第一个Ca2+峰值之间有数分钟的延迟[67]。

5 哺乳动物精子PLCζ的下游信号

5.1 卵子PIP2的分布和作用

精子的PLCζ与体细胞的PLC异构体相似,可以作用于细胞膜上丰富的PIP2,推测PLCζ也会以受精卵的质膜为靶点[47]。然而,研究发现PLCζ专门作用于卵子胞质中均匀分布的囊泡[68]。试验观测到小鼠卵子膜上的PIP2数量在受精后没有明显的减少[69]。此外,利用二酰甘醇(DAG)探针实时检测发现,当用Ca2+载体处理卵子或者注射PLCζ时,卵子的质膜上没有检测到DAG的增加[70]。这两项研究表明,精子和PLCζ没有在卵子质膜上水解PIP2。而利用免疫化学技术观测小鼠卵子中的PLCζ分布,发现重组PLCζ定位于小于1 μm的细胞质囊泡[70]。使用PIP2特异性抗体进行观测,也发现小鼠卵子中的PIP2似乎同样定位于小囊泡中[70]。使用磷酸肌醇脂质磷酸酶来消耗细胞内的PIP2,并不能抑制或阻止精子或PLCζ介导的Ca2+振荡[70],表明卵子质膜上的PIP2可能对受精时的Ca2+振荡并不重要。相反,通过标记无功能的PLCζ突变体,将肌醇磷酸酶靶向到细胞质的小囊泡中,显著抑制了精子或PLCζ介导的Ca2+振荡[70]。有趣的是,PLCζ转染的CHO细胞提取物能表现出明显的体外PLC酶活性,但利用ATP来诱导的Ca2+释放,并没有观测到明显的Ca2+变化[71]。相反,将PLCζ转染的CHO细胞或由这些细胞制成的细胞提取物注入小鼠卵子中,引发了类似受精的Ca2+振荡[71]。而用PIP2抗体进行免疫化学观测,CHO细胞的胞质中没有PIP2的囊泡[71]。尽管可以确定PLCζ能水解细胞质内的PIP2,但精确靶向机制尚不清楚。

5.2 内质网InsP3受体 (InsP3R)

精子PLCζ进入卵子内催化PIP2水解,产生DAG和InsP3,之后InsP3与内质网膜上的受体InsP3R结合使其释放Ca2+[72]。在体细胞中,InsP3R的活性受激酶PKA、磷酸酶蛋白、环磷酸腺苷(cAMP)和钙调蛋白的调节[73-75]。InsP3R在哺乳动物卵子内是如何调控的还有待确定,但目前对其他细胞的研究发现这个机制是高度复杂的。InsP3R的数量与Ca2+水平相关,在受精后,由于InsP3水平的持续增加导致InsP3R的下调[76-77]。尽管InsP3R在触发卵子Ca2+振荡中起着关键作用,但可能存在其他补偿路径调控Ca2+的存储和释放[78]。InsP3R除了参与调控卵子Ca2+振荡,在卵母细胞成熟过程中也起着重要作用[79-81]。InsP3R1是InsP3R亚型之一,在人类卵母细胞生发泡(GV)中呈现弥漫、不规则的颗粒状分布,但MⅡ期时其定位变化为网状和外周分布[82]。在2～4细胞期胚胎中,InsP3R1存在于中心和外围,发育到6～8细胞期胚胎时,InsP3R1在整个细胞质重新分布,这些定位变化伴随着该受体水平的增加而发生[82]。目前的研究证明,InsP3R在卵母细胞成熟、卵子激活和胚胎发育的信号传递过程中起关键作用,但相关的分子机制需要进一步的试验来揭示。

6 PLCζ缺陷和卵子激活技术的应用

目前,全球超过15%的夫妇受到不孕不育的困扰,其中20%～35%的病例是由女性因素引起的,25%～40%的病例涉及男女共同因素,10%～25%的病例无法解释[83]。自从1978年第一个IVF婴儿诞生以来,辅助生殖技术已经成为寻求不孕不育治疗的夫妇的有力工具[84]。IVF失败的患者可以选择ICSI,但仍有1%～5%接受ICSI的患者受精失败,原因尚不明确[85-87]。ICSI失败的病例通常表现为卵母细胞激活失败或流产,可能与精子中PLCζ相对缺乏或与PLCζ突变有关[20-25]。在部分ICSI反复失败的患者中发现的PLCζ突变,圆头精子症患者的精子缺乏顶体和头部周围的其他结构,造成PLCζ的缺乏,这与Dpy1912基因突变有关[88]。在Dpy1912基因缺失的小鼠模型中,精子头部缺乏PLCζ,雄性精子不能激活卵母细胞[88]。这些研究表明,PLCζ缺乏或活性降低可能是ICSI后受精失败的原因之一,可以以此为靶点,开发提高辅助生殖技术效率的策略。目前临床上已经证实,钙离子载体A23187可用于辅助激活卵子,这在试验中和临床治疗中得到了证实[89]。而直接利用PLCζ的mRNA注射可以辅助激活人类卵子,注射重组蛋白可以激活小鼠卵子并形成囊胚[90-92]。这可以作为开发中人工辅助卵子激活技术的新策略,但其激活效率和安全性需要确认。

7 小结与展望

哺乳动物受精时卵子内的Ca2+振荡是一个独特和关键的信号,精子PLCζ在触发Ca2+振荡中起关键作用。本文总结哺乳动物卵子受精和激活过程中涉及的精子PLCζ蛋白的鉴定、表达规律和作用原理。由于PLCζ触发的级联反应依赖于卵子内部的复杂的信号网络,相关的研究对解析动物个体发生的原理至关重要。目前,一系列研究成果的积累,为解析卵子细胞周期恢复、母源mRNA降解、染色质配合、皮质颗粒释放和阻止多精入卵提供了候选分子,但哺乳动物卵子激活的信号转导网络还有待进一步研究。未来对卵子激活的信号网络关键分子的鉴定和作用机制的解析是重要的研究领域,可由此开发高效人工卵母细胞激活的新手段,提高胚胎移植的成功率,为提高辅助生殖技术和动物体外胚胎生产效率提供新方法。