LIF调控奶牛子宫内膜上皮细胞容受性基因表达研究

2024-03-01王红战陈艳茹

黑龙江动物繁殖 2024年1期

王红战,陈艳茹,李琦,唐颖,李博,郑鹏

(东北农业大学动物科学技术学院,哈尔滨 150030)

胚胎的成功植入需要活化状态的胚胎和处于接受状态的子宫相互作用,并建立紧密的联系[1-2]。此外,胚胎植入阶段需要许多因子协调参与,需要囊胚黏附的稳定性、滋养层细胞的侵袭和免疫调节才能实现妊娠和胚胎发育所需的平衡[3]。一些分子生物途径可以调节胚胎植入和子宫内膜容受性。白血病抑制因子(LIF)是白细胞介素-6(IL-6)细胞因子家族的一部分,在人类、小鼠、猪、反刍家畜的研究中表明,在胚胎植入期间子宫内膜LIF表达显著增加[4-6]。因此,在胚胎植入过程中,LIF可能起到积极的作用。LIF与LIF受体(LIFR)结合后,激活子宫管腔上皮细胞(LE)中Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)信号通路,将LE转变为接受状态,使胚胎得以植入、发育[7]。胚胎滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞在植入过程中相互作用形成新组织[8]。血管生成的刺激为植入提供所需的血流,使子宫内膜细胞附着并在间皮表面生长。血管生成主要由血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR介导[9]。HOXa10是一种含有同源盒的转录因子,能调节子宫内膜上皮细胞中子宫内膜接受性生物标记基因的蛋白水平,包括血管内皮生长因子、骨桥蛋白(OPN)、环氧合酶2(COX-2)和催乳素受体(PRLR)[10]。除了胚胎与子宫内膜容受性同步的挑战之外,炎症在植入部位也起着至关重要的作用。Toll样受体4(TLR4)在母胎界面中广泛表达,既是膜受体,也是核因子Kappa-B(NF-κB)激活剂[11]。TLR4通过NF-κB调节炎症因子的产生,影响胚胎的着床和子宫的生理环境[12]。

因此,本试验探讨了LIF对子宫内膜容受性基因表达的影响,以及LIF能否通过STAT3信号通路改变子宫内膜的容受性和炎症反应,为研究LIF调控子宫内膜细胞的机制提出新的见解,为进一步研究奶牛的妊娠生理学和指导奶牛的实际生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

牛子宫内膜上皮细胞,东北农业大学动物科学技术学院实验室冷冻保存;0.25%胰酶,购自Amresco公司; DMEM/F12,购自Sigma公司;胎牛血清(FBS),购自Gibco公司;双抗(每毫升含10 000 U青霉素和10 mg链霉素),购自Biosharp公司;LIF,购自Sangon Biotech公司;STAT3抑制剂Stattic,购自Selleck公司。

1.2 细胞培养与处理

参照前期试验的方法[8],使用基础培养液(DMEM/F12 + 10% 胎牛血清+ 1%双抗),在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下,在60 mm培养皿内培养子宫内膜上皮细胞,细胞生长密度达到80%时进行试验。设3个组,即对照组、LIF处理(150 ng/mL)组、LIF (150 ng/mL)+STAT3(1.5 μmol)共处理组。处理24 h后,用于下一步的试验。STAT3抑制剂使用DMSO配制成浓缩液,LIF使用无菌纯化水配制成浓缩液,使用时用培养液稀释成所需的浓度(DMSO浓度小于0.1%)。

1.3 实时荧光定量RT-PCR分析

采用实时定量RT-PCR检测TLR-4、NF-κB、HOXa10、VEGF和β-actin的表达量。参考Zheng等[13]的方法,用TRIzol试剂提取RNA,使用TaKaRa试剂盒逆转录成cDNA用于PCR试验。检测基因的引物序列如表1所示。由华大基因公司合成,内参基因为β-actin,用2-ΔΔCT法计算靶基因的表达水平。

表1 基因检测的引物序列

1.4 免疫蛋白印迹分析

参考Zheng等[2]的方法提取蛋白。用RIPA裂解缓冲液提取蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。根据目的蛋白的大小不同使用10%和12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品,每孔上样30 μg蛋白样品进行电泳;将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,按照抗体说明书加入一抗(TLR4、NF-κB、HOXa10、VEGF和β-actin;1∶1 000),4 ℃孵育过夜;再用TBST洗涤3次,每次5 min;随后加入二抗(HRP标记,1∶3 000),室温孵育2 h;再用TBST洗涤3次,每次5 min),使用ECL发光液进行曝光;再用ECL Western印迹检测系统检测。使用 Image J 软件对条带进行分析。

1.5 数据的统计分析

采用SPSS 20.0软件,分别采用独立样本t检验以及邓肯氏法进行数据比较分析。所有数据表示为“平均值±标准误”,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 LIF对奶牛子宫内膜上皮细胞基因和蛋白表达的影响

RT-PCR和Western blot分析结果显示,与对照组相比,LIF处理组奶牛子宫内膜上皮细胞的容受性相关基因HOXa10、VEGF表达水平显著升高(P<0.05),炎症相关基因TLR4、NF-κB的表达水平显著升高(P<0.05)。见图1。

注:标注字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.2 LIF和STAT3抑制剂对奶牛子宫内膜上皮细胞基因和蛋白表达的影响

LIF和STAT3抑制剂对奶牛子宫内膜上皮细胞基因和蛋白表达的影响见图2。由图2可以看出:与LIF处理组比较,LIF+STAT3共处理组奶牛子宫内膜上皮细胞的容受性相关基因HOXa10、VEGF表达量显著降低(P<0.05),但与对照组没有差异(P>0.05),说明LIF需要经过STAT3磷酸化激活HOXa10、VEGF的表达;与LIF处理组比较,LIF+STAT3共处理组奶牛子宫内膜上皮细胞的炎症相关基因TLR4、NF-κB的表达无显著差异(P>0.05),但二者均显著高于对照组(P<0.05)。说明LIF通过膜受体直接激活TLR4、NF-κB,不经过STAT3磷酸化的通路。

注: 标注字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

胚胎附植过程中,子宫内膜经历重塑过程,达到容受状态以接受胚胎。调节子宫内膜容受性的重要因素之一是LIF,这是一种属于IL-6超家族的多效性细胞因子,在广泛的生理过程中起主要作用。在子宫接受期,LIF支持囊胚附着、侵袭以及蜕膜化过程[14]。植入前,LIF在小鼠的囊胚和滋养外胚层中表达[15]。在小鼠交配后第4天,子宫内膜腺中也发现了LIF表达,随后证明雌性LIF基因敲除小鼠具有生育能力,但囊胚未能植入,并且小鼠LIF受体(LIFR)的破坏与胚胎异常发育、死亡有关[16]。猪的子宫内膜中LIF和LIFR表达在发情周期内波动,在发情后期表达升高,并在胚胎发育的第11～12 d升高[17]。绵羊妊娠第16～20 d观察到子宫内膜LIF表达最高,在第17天绵羊囊胚中发现LIF蛋白[18]。这些研究提供了强有力的证据证明LIF影响胚胎植入过程,并且参与了家畜胚胎与子宫内膜的交流。

HOXa家族是胚胎植入、子宫蜕膜和免疫调节的内在组成部分,是胚胎着床调控主要候选基因。上调子宫内膜中HOXa10 mRNA和蛋白的表达,可提高胚胎着床率和临床妊娠率,相反,如若敲除HOXa10,胚胎着床率和成活率均降低[19]。血管内皮生长因子VEGF在子宫内膜新生血管形成中起重要作用,直接参与调控子宫内膜容受性的调控[20]。这都表明HOXa10和VEGF在着床期子宫内膜中高表达,二者都是子宫内膜容受性的标志性分子,在胚胎植入过程中起重要作用。本试验结果表明,LIF能够上调HOXa10、VEGF基因的表达,对奶牛的胚胎植入具有促进作用。

STAT3是LIF下游的信号转导因子,通常以非活性状态存在于细胞质中,当被磷酸化激活时,可将刺激信号传递入细胞核内,LIF与gp130复合受体结合可以激活下游STAT3,促进基因的转录和翻译[21]。研究表明,LIF通过对STAT3的磷酸化影响子宫内膜上皮细胞。体内STAT3活化仅由LIF诱导,使得STAT3特异性定位于子宫管腔上皮细胞的细胞核,这些都与子宫内膜容受性相吻合[22]。本试验中的蛋白印迹结果显示,使用LIF处理子宫内膜上皮细胞后,与子宫内膜上皮细胞容受性相关的基因、蛋白表达量均显著增加,而使用STAT3抑制剂处理后减少。以上结果都表明,LIF可以激活STAT3信号通路、增强子宫容受性,进而影响牛的胚胎植入过程。

适当的免疫应答在胚胎植入期间的子宫内膜中起着至关重要的作用[23]。在子宫内膜的母胎界面进行精确的免疫平衡,可以获得积极的妊娠结果。目前的研究表明,着床和早孕是一种促炎状态,局部炎症反应有助于植入[24]。白血病诱导因子LIF是促炎IL-6家族的一种多效性细胞因子[25]。研究发现,在植入窗口期,LIF免疫反应较弱的女性比LIF表达较高的女性怀孕的可能性更小。因此,LIF可能调控局部炎症反应,以确保植入成功[26]。TLR4、NF-κB是调控机体炎症反应和免疫应答过程中的重要细胞因子[27]。本试验结果表明,LIF上调了TLR4和NF-κB的表达,但是其具体调控机制还需进一步研究。