几种抗氧化剂对马精液冷冻保存效果的影响

2024-03-01依比布拉阿那亚提阿依努尔亚森罗永明玉山江阿拉达尔

黑龙江动物繁殖 2024年1期

依比布拉·阿那亚提,阿依努尔·亚森,罗永明,团勇,玉山江*,齐·阿拉达尔*

(1.新疆农业大学动物科学学院,乌鲁木齐 830000; 2. 新疆畜牧科学院畜牧研究所, 乌鲁木齐830000; 3. 伊犁州畜牧科学研究所, 新疆伊宁 835000)

人工授精(artificial insemination, AI)在马的繁育中发挥着越来越重要的作用,在全球范围内都在逐步普及,但也存在精子保存和运输的难题。马冷冻精液的应用范围比较窄,这是因为种公马的选择是基于马匹运动特性和竞赛成绩,对繁殖性能考虑得比较少,导致马精子承受温度变化的能力比较弱。精液的低温保存可在一定范围内打破时间和空间的限制,因此马精液冷冻技术的研究及商业化应用呈现增长的趋势,其中对稀释液进行优化组合是个重要的方向。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在伊犁州昭苏马场种公马站,选取12匹6～14岁的种公马作为试验动物,包括4匹英纯血马、1匹阿拉伯马、3匹速步马和4匹温血马,所有马匹按照繁殖季节的饲养标准饲喂。

1.2 主要试剂及仪器

牛磺酸、谷胱甘肽、维生素C、蛋氨酸、原花青素、甲基甲酰胺等,购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;葡萄糖、棉籽糖、乳糖、二水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、甘油、二甲基亚砜等,均购自上海麦克林生化科技股份有限公司;脱脂奶粉和鸡蛋,均为市购;马精液离心垫,购自德国米尼图公司。

计算机辅助精子分析仪(minitube sperm vision),购自德国米尼图公司,由新疆畜牧科学院畜牧研究所繁殖实验室提供;精子密度仪,购自法国卡苏公司;精子灌装机(MRS1 Dual v2),购自法国卡苏公司;马假阴道,购自中国农业大学马研究中心,由昭苏马场种公马站提供。

1.3 溶液的配制

马精液基础稀释液INRA82的配制:5.0 g葡萄糖、0.3 g棉籽糖、0.3 g乳糖、0.06 g柠檬酸钠、0.082 g柠檬酸钾、0.476 g HEPES、10 000 IU青霉素、2.0 mg庆大霉素放入无菌容器中,加入双蒸水溶解,定容至100 mL,用磁力搅拌器搅拌30 min[8]。

低温稀释液的配制:基础稀释液50 mL,添加50 mL脱脂奶,充分混匀后分装,用高压锅消毒灭菌。

冷冻稀释液的配制:取低温稀释液90 mL,加5 mL卵黄、5 mL甘油、3 mL甲基甲酰胺和二甲基亚砜的混合液,定容至100 mL。配制好的低温与冷冻稀释液需要调整pH至6.8～7.0,渗透压为300～330 mOsm/kg。

抗氧化剂工作浓度的确定是根据文献资料及实验室前期研究成果,梯度筛选出效果较好的浓度,然后依据工作浓度计算相应母液浓度并配制,取相应的母液量添加到基础稀释液中。

表1 不同抗氧化剂浓度及稀释液的配制

1.4 精液采集与处理

用活体母马作台畜,清洁马体并用绑带将尾巴绑起固定在体侧,用马采精专用假阴道进行精液采集。采集到的精液先挑除副性腺凝胶,然后用8～12层滤纸进行过滤。过滤后的精液每匹马取相同的量做混池,每次试验至少选择4匹种公马精液做混池。

1.4.1 离心及平衡处理

混池的精液用预热的低温稀释液按1∶1稀释,缓慢向离心管底部添加1.0～1.5 mL精液离心缓冲垫,1 500×g离心15 min,弃上清液及管底离心缓冲垫。离心后加入冷冻液,调整密度至1.0×108/mL,上下混匀后灌装于0.5 mL细管,放置在5 ℃平衡柜中平衡150 min。

1.4.2 冷冻及解冻处理

冷冻采用液氮熏蒸法:使用聚苯乙烯泡沫盒,液氮深3 cm,将摆放有细管的冷冻架放入泡沫盒中,细管距离液氮面2.5～3.0 cm,熏蒸12 min后投入液氮储存。解冻:先在46 ℃水中解冻20 s,再在38 ℃水浴锅中回温1 min,剪开后的细管精液保存在2 mL微量无菌离心管中,检测精子质量指标后放置在冰箱冷藏柜(4～5 ℃)中冷藏。

1.5 试验设计

(1)为评测抗氧化剂对种公马精液冷冻保存效果的影响,设置试验组和对照组。试验组为5个,试验组1、试验组2、试验组3、试验组4、试验组5的基础液中分别添加谷胱甘肽(Gsh)、牛磺酸(Tau)、维生素C、蛋氨酸(Met)、原花青素(Pc),对照组1不添加抗氧化剂。用试验组和对照组稀释液制作的冻精在解冻后分别储存于4～5 ℃的冰箱中,储存48 h后测定马精子的活力参数。

(2)进一步试验以牛磺酸为基础抗氧化剂,在此基础上添加其他抗氧化剂,评估抗氧化剂组合对冻融后精液质量参数的影响。以添加牛磺酸的组为对照组2,设置4个试验组,试验组6添加牛磺酸和谷胱甘肽,试验组7添加牛磺酸和蛋氨酸,试验组8添加牛磺酸、谷胱甘肽与蛋氨酸,试验组9添加谷胱甘肽和蛋氨酸,评测抗氧化剂组合添加对马精子冷冻保存效果的影响。

(3)在冷冻程序的不同时间添加抗氧化剂,评测抗氧化剂不同添加时间对马精子冷冻保存效果的影响。以牛磺酸为抗氧化剂,设置3个试验组,试验组10(离心前)在鲜精稀释液和冷冻稀释液中均添加抗氧化剂;试验组11(冷冻前)在冷冻液中添加抗氧化剂;试验组12(冷冻前后)在冷冻稀释液中添加抗氧化剂,解冻后再次添加抗氧化剂。

精子活力参数的测定:细管冻精解冻后,在室温稳定30 min后测定;细管冻精解冻后再次添加抗氧化剂,在室温下稳定30 min后测定。

1.6 精液质量的测定

精子在母畜生殖道中的存活时间直接影响母畜受胎率。而冷冻过程会使精子受到一系列的损伤(如质膜损伤等),从而降低精子在母畜体内的存活时间,这也是冻精人工授精效果不如鲜精的原因之一。为更好地评估冷冻过程对精子的影响效果,试验将冻融后精子在4～5 ℃保存48 h后,用精子分析仪测定精子质量指标。选择精子活力、运动速度及直线性三个方面,活力参数包括活精子比例(total motility,TM)、前进式活力平均值(progressive motility,PM)和快速运动精子比例(rapid motility,RAP),在运动速度和直线性方面选择了精子平均路径速度(average path velocity,VAP)和直线性(linear,LIN)。

取样本精液4 μL,滴加在恒温载物台的载玻片上,恒温载物台的温度保持38 ℃恒温,置于计算机精液辅助分析仪下进行精液运动指标的测定。每个样本观察3～5个视野,数据取平均值。采用米尼图公司的计算机辅助精子分析仪对马精子活力参数的评判标准:TM即活精子(精子侧摆幅度>4 μm,精子鞭打频率>4次/s)所占比例;PM即精子头部曲线运动速率>35 μm/s,直线运动速率>15 μm/s的精子所占的比例;RAP即精子头部曲线运动速率>120 μm/s的直线运动精子比例;VAP反映的是精子头部沿其空间平均轨迹的运动速度;LIN即精子头部直线移动距离的速度(VSL)与精子头部沿其实际行走曲线的运动速度(VCL)的比值,反映精子运动曲线的直线分离度。

1.7 数据的统计分析

所有精液运动参数检测数据均采用SPSS 25.0软件单因素方差分析(One-Way ANOVA)中的 Turkey’s检验进行多重比较分析,以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂对精子低温保存效果的影响

不同抗氧化剂对精子低温保存效果的影响见表2。由表2可知:添加了不同抗氧剂的马精子冻融保存48 h后,试验组1的TM显著低于对照组1(P<0.05),PM、RAP、VAP及LIN均与对照组差异不显著(P>0.05)。说明10 mmol/L 谷胱甘肽并不能提升马精子冻融后的活力指标。与对照组1相比,试验组2、试验组3、试验组4、试验组5能在不同方面提高冻融后的马精子质量指标。RAP是与精子的受胎率密切相关的精子活力指标,与对照组1相比,试验组2、试验组3、试验组4、试验组5的RAP均有显著提高(P<0.05)。在TM、PM和VAP上,试验组3、试验组4、试验组5都显著优于对照组(P<0.05)。在人类精子常规检测报告单中, LIN在0.32以上为正常值。在本试验中各组间LIN差异不显著(P>0.05),但所有试验组数值均高于对照组,这也表明牛磺酸、维生素C、蛋氨酸和原花青素等抗氧化剂的添加有助于精子形态和功能的维持。

表2 添加抗氧化剂后的马精子冻融低温保存效果(48 h)

2.2 抗氧化剂组合对精子低温保存效果的影响

以添加牛磺酸为对照组2,试验组6为牛磺酸+谷胱甘肽,试验组7为牛磺酸+蛋氨酸,试验组8为牛磺酸+谷胱甘肽+蛋氨酸,试验组9为谷胱甘肽+蛋氨酸,抗氧化剂的添加量不变,比较抗氧化剂组合对马精子冻融后保存的质量参数,结果见表3。由表3可知:与对照2组相比,试验组6、试验组7的TM、PM、RAP、VAP均显著降低(P<0.05),试验组8的TM、PM 、RAP、VAP均低于对照组2,其中PM显著低于对照组2(P<0.05)。试验中需要关注的是谷胱甘肽,与甲硫氨酸组合的试验组9表现出了优于对照组的趋势,这表明谷胱甘肽更适合用于抗氧化剂的搭配组合。各试验组间LIN均差异不显著(P>0.05),但试验组6、试验组7低于0.32,说明试验组6、试验组7的抗氧化剂组合对精子存活有毒害作用,也说明加入牛磺酸和试验组6,7,8并没有表现出组合优势。

表3 添加抗氧化剂组合后马精子冷冻保存效果(48 h)

2.3 抗氧化剂添加程序对精子冷冻保存效果的影响

在冷冻程序的不同时间添加抗氧化剂,可以明确抗氧化剂起作用的时间,从而优化冻精制作程序。不同时间添加抗氧化剂后马精子冻融低温保存效果见表4。由表4可知:冷冻前后两次添加抗氧化剂的试验组12,其5项评测指标都显著低于只在冷冻前添加一次抗氧化剂的试验组10、试验组11(P<0.05),其中能反映精子授精能力的快速运动精子比例的RAP数值降了一半还多,说明两次添加抗氧化剂不利于精子存活。在离心前添加抗氧化剂的试验组10、冷冻前添加抗氧化剂的试验组11比较,发现两者PM、RAP和VAP无显著差异(P>0.05),但TM、LIN差异显著(P<0.05),其中LIN差异比较大,说明离心前添加抗氧化剂对于精子形态和功能的维持有益,也证明了冷冻程序中在鲜精稀释液中添加抗氧化剂是有益的。

表4 不同时间添加抗氧化剂后马精子冻融低温保存效果

3 讨论

马精子主要是依靠氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS),而不是糖酵解产生能量。这种情况下,精子线粒体的活性更高,容易产生更多的ROS[9];同时,白细胞的免疫抗炎机制也是马精液中ROS产生的主要来源之一;另外,精液中死亡精子比例增加也会导致ROS增多。正常条件下,精子和精浆中的抗氧化系统能保护精子免受ROS的有害影响。但在冻精制作过程中,为了避免精浆蛋白在体外使精子过早获能,大部分马精浆在精液离心后被丢弃,精浆中的抗氧化酶也一并被消除了,从而导致氧化应激的产生。过多的ROS带来的危害有:脂质过氧化、DNA断裂、蛋白质氧化、线粒体功能障碍等[1]。为减轻ROS对精子冻后质量所带来的不利影响,需要添加抗氧化剂来平衡ROS的产生,建立抗氧化防御系统。

谷胱甘肽作为一种抗氧化剂,在猪、牛、羊、兔的精液稀释液中都有应用,可以显著改善精液稀释液的抗氧化特性,能通过保持精子顶体和质膜完整性来维持精液质量,从而提高精子在冻融过程中的受精能力[10]。谷胱甘肽是一种三肽,由氨基酸L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺和甘氨酸组成。半胱氨酸含有巯基或硫醇基。硫醇基团是强还原剂,谷胱甘肽作为电子供体的特性可减少H2O2的产生,并催化谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)氧化形成谷胱甘肽二硫键[11]。通过研究发现,马精子可能利用外源半胱氨酸调节谷胱甘肽[12-13],即说明种公马精子可以生成谷胱甘肽。此外,半胱氨酸的巯基可穿透精子的质膜,增加谷胱甘肽的细胞内生物合成,从而通过清除ROS保护精子的DNA、蛋白质及膜脂含量[10]。与其他动物相比,马精子中谷胱甘肽平均浓度为(8.2±2.1)μmol/L[12],远高于其他哺乳动物。阿娜尔等[14]报道,5.0 mg/mL谷胱甘肽组蒙古马精液冻融后的PM和顶体完整率(AI)显著提升,但TM和质膜完整率(MI)仅略提升; 5.0 mg/mL谷胱甘肽组精液中抗氧化指标GSH-Px和谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著高于其他试验组,同时表现出大剂量的谷胱甘肽可以导致GSH-Px和GR活性降低。Baumber等[15]将10 mmol/L(3.07 mg/L)谷胱甘肽添加到马精液中,发现对精液的TM和PM没有改善作用。本研究中,谷胱甘肽对马精子活力参数没有改善提升作用,这一结果与Baumber等[15]的试验结果相似,但不支持阿娜尔等[14]的结论。这可能是由于谷胱甘肽添加量不同和测定精子活力指标的时间不同导致。

牛磺酸是一种含硫的氨基酸,可以促进牛、猪、兔等物种胚胎的体外发育[16]。作为一种抗氧化剂,主要通过参与清除自由基、维持生物膜稳定性、抑制ROS产生酶类等方面发挥作用。在猪精液保存中的应用研究证明,牛磺酸可提高精子总抗氧化能力,降低丙二醛浓度,从而达到提高精液活力参数的目的[17]。牛磺酸还被应用于牛、羊、狗和鱼的精液冷冻中,能改善提高精子活力指标[18]。Lone等[19]指出,小鼠精浆40 mmol/L牛磺酸组公羊的精子质量显著提高,丙二醛含量显著低于对照组,说明牛磺酸可作为一种有效的抗氧化剂用于公羊精液的冷冻保存。徐文慧等[10]报道,25 mmol/L牛磺酸处理对种公马精液的TM和PM提升不显著,但RAP显著高于对照组。本试验结果与徐文慧等[10]的结果相似,与对照组相比,添加牛磺酸的试验组2的TM和PM没有显著提升,但RAP和LIN有显著提高,说明牛磺酸对维护马精子授精能力和功能完整性有帮助。

维生素C是一种非酶类的抗氧化剂,作为水溶性的维生素,它主要搭配在动物日粮中,具有明显的清除ROS的能力[1]。以人类精液为例,维生素C在精浆中的浓度是血清的10倍[1]。这种高浓度表明其在保护DNA完整性方面具有重要作用,饮食中增加维生素C摄入与精浆中浓度升高相关。此外,维生素C具有中和特定自由基如羟基、超氧化物和H2O2的能力,可防止内源性氧化损伤[1]。Rakha等[20]报道,在冷冻过程中添加2.0 mmol/L维生素C可以使冻融后的印度红禽精子活力、质膜和顶体完整性均显著提高。Sampaio等[21]报道,维生素C和维生素E单独使用并不能提高马精液的活力参数,但可以降低精液中MDA含量,二者混合使用可以显著提高冷藏马精子(5 ℃)的运动能力。徐文慧等[10]研究发现,添加维生素C能够显著改善精液低温保存后的活力,但对冻融后精液运动能力、质膜完整性、线粒体膜电势及顶体完整性均无显著影响。本试验中,添加维生素C的试验组3 PM、TM、VAP、RAP均显著提高。此外,对几种抗氧化剂进行比较,发现试验组3的VAP值较高,仅次于试验组5,说明维生素C对于精子活力有促进作用。本研究结果与徐文慧等[10]的报道略有不同,这可能是由于试验所用的精子分析仪对于PM、TM和RAP的评判标准和冻融后精子活力指标测定时间不同导致的。

蛋氨酸是谷胱甘肽的前体氨基酸之一,可以通过促进细胞内谷胱甘肽的形成而发挥抗氧化作用, Coyan等[22]报道,1 mmol/L蛋氨酸组山羊精液低温保存后的精子活力显著高于对照组。Bucak等[23]报道,在5 ℃低温保存条件下,添加2,4 mmol/L蛋氨酸的稀释液可使羊精液保存(5 ℃)至96 h,精子存活率和精子线粒体活性百分比均显著高于对照组。Toker等[24]报道,在羊精液冷冻过程中,2.5,5.0 mmol/L蛋氨酸组各项指标均优于对照组。徐文慧等[10]报道,2.5 mmol/L蛋氨酸组的马精子冻融后活力指标没有明显提高,但马精子的线粒体膜电势显著提高,质膜完整性也有提高。说明蛋氨酸对质膜完整性、线粒体起到了保护作用。本试验中,添加蛋氨酸的试验组4 TM、PM、RAP及VAP显著高于对照组,但LIN提升不显著。

原花青素是一种天然多酚,广泛存在于自然界,具有保护细胞免受H2O2诱导的氧化应激的作用,并具有抑制细胞凋亡、抗癌、抗衰老、抗氧化等多种生物活性[25]。在精液抗氧化方面,Wang等[26]报道,添加50 mg/L OPC能提高冷冻精子的质量,与2 mg/L 竹叶黄酮联合使用显著提高了精子的运动能力,提高了精子过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的水平,降低了精子的MDA浓度。Li等[27]报道,在17 ℃保存条件下,50 μg/mL OPC组关中黑猪精液的精子活力、顶体完整性、膜完整性和线粒体膜电位显著提高,同时试验组的MDA和ROS含量降低。在本试验中,原花青素处理的试验组5 TM、PM、RAP、VAP和LIN都显著优于对照组,其中RAP和LIN还优于其他试验组,说明原花青素(OPS)的添加对马精子在冻融过程中维持授精能力和顶体完整率有保护作用。

氧化应激可以损害精子质膜、DNA结构等,添加或补充抗氧化剂可以抵抗细胞损伤,这一做法已经得到了广泛的认可。但研究表明,过量加入抗氧化剂可能会破坏氧化和还原之间的平衡,导致一种还原性压力状态[28]。Halliwell等[29]提出的一个术语“抗氧化悖论”,强调了过度使用抗氧化剂的潜在负面影响。稀释液中抗氧化剂添加的目的应该是建立精子生存小环境内的氧化还原平衡,不同的抗氧化剂发挥作用的方式和途径是不一样的,因此依据种公马精子产生活性氧的特点,将不同的抗氧化剂进行组合添加,这将有助于建立更完善、平衡的氧化还原小环境。Olfati等[30]报道,在种公牛稀释液中组合添加谷胱甘肽和超氧化物歧化酶,与对照组相比,降低了MDA含量,改善了精液解冻后的品质。Nogueira等[31]测试了抗氧化剂辅酶Q10 (CoQ10)和褪黑激素单独和联合应用对马精液冻融后精子质量的影响,发现与对照组相比,单独或联合使用抗氧化剂在任何时候都降低了脂质过氧化水平,但单独处理组和联合处理组之间无显著差异。Kumar等[32]在种公驴精液冷冻的试验中发现,与单独添加谷胱甘肽和维生素C相比,组合添加(0.9 g/L维生素C+2.5 mmol/L 谷胱甘肽)组的质膜、顶体完整性和染色质完整性均显著提高。本试验中,以牛磺酸为基础抗氧化剂,组合搭配其他抗氧化剂的3个试验组,精液的活力参数多数低于对照组,说明牛磺酸不适合组合其他抗氧化剂。谷胱甘肽与蛋氨酸搭配的组合,精液活力参数与对照组相比无显著差异,但在数值上表现出了优于对照组的趋势。另外,试验组7,9同样是搭配蛋氨酸组成抗氧化剂组合,谷胱甘肽+蛋氨酸组合显著优于牛磺酸+蛋氨酸组合,说明谷胱甘肽更适合与其他抗氧化剂搭配,更有助于氧化还原稳态的建立。

马精液在冷冻处理过程中,由于温度和所处环境的变化,容易受到氧化机制不平衡而导致的氧化应激反应的影响。Castro等[33]发现,马精子在冰冻温度下时,ROS水平会显著增加,这是因为细胞中可用的抗氧化酶不足以维持氧化平衡。这是由于精液在冷冻预处理过程中,精子细胞质的体积减少,其中含有的少量抗氧化酶不足以抵消ROS显著增加而产生的不良影响。Burnaugh等[34]报道,当种公马精子暴露于低渗或高渗环境时(解冻或者冷冻初始),会产生大量的超氧阴离子。大多数的研究都在强调冷冻前后ROS水平会增加,那么在冷冻程序的不同时间添加抗氧化剂是否会影响到种公马精液冻融后的活力参数呢?Contreras等[35]报道,在马精液在冷冻前后二次添加抗氧化剂的锰卟啉(MnTBAP)处理组和n-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组,两个组精子活力都有明显下降,其中NAC处理组精子活力显著下降,表明二次添加抗氧化剂对马精子保存有毒害作用。在本试验中,离心前和冷冻前添加抗氧化剂在精子活力参数上明显优于冷冻前后二次添加,其中RAP数值降了一半还多,说明二次添加抗氧化剂不仅不利于氧化还原平衡,而且可能对精子有毒害作用。这一结果与Contreras等[36]的试验结论一致。