黄芩素对EAM模型小鼠心肌组织纤维化的影响

王甜甜 王爽 李玲

［摘要］  目的探讨黄芩素对自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）模型小鼠心肌组织纤维化的影响及其机制。

方法将20只BalB/C小鼠随机分为空白组、EAM组、黄芩素组、地塞米松组，每组5只。在饲养至第0、7天时，除空白组小鼠外余均皮下注射200 μL完全弗氏佐剂与α-MyHC肽混合乳剂，饲养至第8天时开始对EAM组、黄芩素组及地塞米松组小鼠分别给予羧甲基纤维素钠、黄芩素、地塞米松灌胃，给药至第21天时行超声心动图检测各组小鼠左心室射血分数（LVEF）、缩短分数（LVFS）、舒张末期内径（LVIDd）及收缩末期内径（LVIDs）。第21天时将各组小鼠脱颈处死后取心脏组织进行HE染色和Masson染色；采用流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例；采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹法检测各组小鼠心脏组织中的胶原Ⅰ（CollagenⅠ）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、白细胞介素17A（IL-17A）、Treg转录因子（FOXP3）及白细胞介素10（IL-10）的mRNA及蛋白表达水平。

结果超声心动图显示，黄芩素组小鼠LVEF、LVFS显著高于EAM组（F=51.55、35.38，q=8.08、5.97，P<0.05），LVIDd、LVIDs显著低于EAM组（F=4.64、17.72，q=2.88、4.77，P<0.05）。HE及Masson染色结果显示，黄芩素组及地塞米松组小鼠心脏组织炎症细胞的浸润和胶原纤维的沉积较EAM组有所改善。流式细胞术检测结果显示，黄芩素组及地塞米松组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例显著低于EAM组（F=6.80，q=3.60、3.06，P<0.05）。RT-qPCR结果显示，黄芩素组小鼠心脏组织中CollagenⅠ、IL-17A mRNA水平显著低于EAM组（F=112.40、77.49，q=14.57、8.27，P<0.05），MMP-1、FOXP3、IL-10 mRNA水平显著高于EAM组（F=19.05～144.60，q=5.37～11.21，P<0.05）。免疫印迹法检测结果显示，黄芩素组小鼠心脏组织中CollagenⅠ、IL-17A蛋白表达显著低于EAM组（F=13.70、13.97，q=4.72、5.64，P<0.05），MMP-1、FOXP3、IL-10蛋白表达显著高于EAM组（F=6.77～17.21，q=3.32～6.14，P<0.05）。

结论黄芩素通过调控脾脏中Th17/Treg平衡减轻EAM小鼠心肌损伤，进而减轻心肌组织纤维化进程。

［关键词］  心肌炎；自身免疫疾病；纤维化；黄芩苷；Th17细胞；T淋巴细胞，调节性；基因表达调控；小鼠

［中圖分类号］  R542.21;R593.2

［文献标志码］  A

Effect of baicalein on fibrosis of myocardial tissue in EAM model mice

WANG Tiantian， WANG Shuang， LI Ling

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ Objective To explore the effect of baicalein on myocardial fibrosis in experimental autoimmune myocarditis （EAM） mice and its mechanism.

Methods Twenty BalB/C mice were divided into blank group， EAM group， baicalein group， and dexamethasone group， with 5 mice in each group. On days 0 and 7， all the mice except those in the blank group were subcutaneously injected with 200 μL of complete Freunds adjuvant and α-MyHC peptide emulsion. Starting from day 8， the mice in the EAM group， baicalein group， and dexamethasone group were intragastrically administered sodium carboxymethyl cellulose， baicalein， and dexamethasone， respectively. Echocardiography was performed on day 21 of administration to determine left ventricular ejection fraction （LVEF）， shortening fraction （LVFS）， left ventricular end-diastolic internal diameter （LVIDd）， and left ventricular end-systolic internal diameter （LVIDs） in mice across all groups. On day 21， the mice from all groups were euthanized by cervical dislocation and their heart tissues were collected for HE staining and Masson staining. Flow cytometry was used to detect the proportion of Th17/Treg cells among the splenocytes. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） and Western blot were used to analyze the mRNA and protein expression of Collagen Ⅰ， matrix metalloproteinase-1 （MMP-1）， interleukin 17A （IL-17A）， Treg transcription factor （FOXP3）， and IL-10 in the cardiac tissue of mice.

Results Echocardiographic results showed that the LVEF and LVFS of mice in baicalein group were significantly higher than those in the EAM group （F=51.55，35.38，q=8.08，5.97，P<0.05）， while LVIDd and LVIDs were significantly lower than the EAM group （F=4.64，17.72，q=2.88，4.77，P<0.05）. HE and Masson staining showed that infiltration of inflammatory cells and deposition of collagen fibers in the cardiac tissue of mice were significantly mitigated in the baicalein and dexamethasone groups as compared with the EAM group. Flow cytometry showed that the proportion of Th17/Treg cells was significantly higher in the EAM group than in the baicalein and dexamethasone groups （F=54.75，q=3.60，3.06，P<0.05）. RT-qPCR showed that the mRNA levels of Collagen Ⅰ and IL-17A in the heart tissue of mice were significantly lower in the baicalein group than in the EAM group （F=112.40，77.49，q=14.57，8.27，P<0.05）， while the mRNA levels of MMP-1， FOXP3， and IL-10 were significantly higher in the baicalein group than in the EAM group （F=19.05-144.60，q=5.37-11.21，P<0.05）. Western blot showed that the expression of Collagen Ⅰ and IL-17A was significantly lower in the heart tissue of mice in the baicalein group than that in the EAM group （F=13.70，13.97，q=4.72，5.64，P<0.05）， while the expression of MMP-1， FOXP3， and IL-10 was significantly higher in the baicalein group than in the EAM group （F=6.77-17.21，q=3.32-6.14，P<0.05）.

Conclusion Baicalein alleviates myocardial damage in EAM mice by regulating the balance between Th17/Treg in the spleen， thereby reducing the progression of myocardial tissue fibrosis.

［KEY WORDS］ Myocarditis; Autoimmune diseases; Fibrosis; Baicalein; Th17 cells; T-lymphocytes， regulatory; Gene expression regulation; Mice

心肌炎是指以心肌局限性或彌漫性炎症病变为主要表现的疾病［1］。在心肌炎发病期间，炎症细胞的持续浸润可引起心肌损伤［2］，炎症后期会导致心肌纤维化。目前国内外对于心肌纤维化的治疗以减轻心肌组织炎症损伤为主，以求减少心肌组织纤维化。Th17和Treg是CD4+T细胞的两个亚群，其中Th17细胞主要起促炎作用，Treg细胞与抑炎反应相关［3］。Th17通过分泌白细胞介素17（IL-17）促进炎症反应，而Treg则通过分泌白细胞介素10（IL-10）抑制炎症反应。在心力衰竭患者的外周血中，Th17细胞的比例增加，Treg细胞的比例减少，Th17/Treg细胞的比例失衡从而加重了心肌纤维化［4］。黄芩素是传统中药黄芩的主要生物活性物质，具有抗炎、抗纤维化等多种药理作用和生物活性［5-6］。研究发现，黄芩素可以通过调控Th17/Treg的平衡缓解结肠炎的进展［7］，并通过调控TGF-β1和p-Smad2/3的表达减轻肺纤维化［8-9］。目前关于黄芩素抑制心脏组织纤维化的研究较少，本研究通过构建自身免疫性 心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）小鼠模型，并使用黄芩素对小鼠进行治疗，以探讨黄芩素对EAM模型小鼠心肌组织纤维化的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

完全弗氏佐剂（CFA）购买于上海Sigma公司，α-MyHC肽购自生工生物工程（上海）股份有限公司，黄芩素购自大连美仑生物技术有限公司，地塞米松、苏木精伊红（HE）染色试剂盒、山羊抗兔IgG以及山羊抗鼠IgG购买于上海碧云天生物技术有限公司，Masson染色试剂盒（G1346）购买于北京索莱宝生物科技有限公司，蛋白转运抑制剂BFA、鼠抗CD4、鼠抗CD3、鼠抗CD25、鼠抗Treg转录因子（FOXP3）、鼠抗IL-17A购自美国Biolegend公司，兔抗Ⅰ型胶原α1抗体购自美国Cell Signaling公司，兔抗基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、IL-10抗体购自北京Bioss公司，兔抗FOXP3抗体购自成都正能生物技术有限公司，GAPDH KC-5G5购自上海Aksomics公司，PAGE快速凝胶试剂盒购自上海雅酶生物技术有限公司，MolPure细胞/组织总RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒、2×q3SYBR qPCR Master Mix试剂盒及ECL化学发光超敏显色试剂盒购自上海翌圣生物技术有限公司，BalB/C小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司。

1.2 EAM小鼠模型构建及分组

将雄性6～8周龄的BalB/C 小鼠（体质量18～20 g）随机分为空白组、EAM组、黄芩素组、地塞米松组，每组5只，饲养在青岛大学SPF级别鼠房，保持恒温恒湿环境，12 h/12 h昼夜光照。饲养至第0、7天时，除空白组小鼠，余均将CFA和α-MyHC肽混合乳剂200 μL于腹股沟及腋窝处皮下注射。饲养至第8天开始，EAM组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠0.1 mL灌胃，黄芩素组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠+黄芩素150 mg/kg共0.1 mL灌胃，地塞米松组小鼠给予0.5%羧甲基纤维素钠+地塞米松0.5 mg/kg共0.1 mL灌胃，持续给药至第21天。

1.3 超声心动图检测各组小鼠心功能指标

第21天麻醉小鼠使其镇静，使用小动物超声成像系统（VINNO6LAB）对小鼠进行经胸超声心动图检查。通过胸骨旁短轴和长轴视图获得二维和M型超声心动图图像，测量小鼠左心室舒张末期内径（LVIDd）和左心室收缩末期内径（LVIDs），并计算左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（LVFS）。

1.4 各组小鼠心肌组织HE及Masson染色

进行超声心动图检测后将所有小鼠脱颈处死，取心脏部分固定脱水、透明、浸蜡包埋、切片并烘干后，按照HE及Masson染色试剂盒说明书要求的步骤进行染色，封片后在正置显微镜下拍照。

1.5流式细胞术检测各组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例

将各组小鼠脱颈处死后取出脾脏，无菌条件下研磨制成单细胞悬液，细胞按1×106个/孔接种到96孔板中，每孔加入0.2 μg α-MyHC肽、0.12 μg BFA及100 μL含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃含体积分数0.05二氧化碳的培养箱中培养11 h，随后1 000 r/min离心5 min，弃上清液。进行Th17染色，鼠抗CD4、鼠抗CD3胞外染色共30 min，再次以1 000 r/min离心5 min后，弃上清液。使用4%多聚甲醛固定细胞，0.2% Triton X-100破膜，然后鼠抗IL-17A胞内染色30 min。进行Treg染色，鼠抗CD4、鼠抗CD3以及鼠抗CD25胞外染色共30 min，胞外染色结束以后，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液。以4%多聚甲醛固定细胞，0.2% Triton X-100破膜，然后鼠抗FOXP3胞内染色1 h。染色结束以后使用200目铜网过滤收集细胞，使用Beckman CytoFLEX进行上样检测，最后再采用FlowJo V10软件进行数据分析。

1.6实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测各组小鼠的心脏组织中胶原Ⅰ（CollagenⅠ）、MMP-1、IL-17A、FOXP3及IL-10的mRNA表达水平使用MolPure细胞/组织总RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒提取各组小鼠心脏组织的总RNA并且转录成cDNA，根据说明书使用2×q3SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行RT-qPCR检测，以GAPDH为内参，数据分析采用2－△△CT法。引物序列见表1。

1.7免疫印迹法检测各组小鼠心脏组织中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10蛋白相对表达量用电子秤分别称取各组小鼠心脏组织20 mg，组织剪剪碎后加入200 μL RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的混合物，在研磨管中进行研磨，結束后静置5 min，将液体吸出至新的1.5 mL EP管中，以11 832 r/min离心5 min，取上清液。加入蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，得到蛋白样品。用15.0%或12.5%的SDA-PAGE将蛋白质电转移到PVDF膜上，在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，用TBST洗3次，将膜分别与一抗CollagenⅠ（1∶1 000）、MMP-1（1∶1 000）、IL-17A（1∶500）、FOXP3（1∶1 000）、IL-10（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）在4 ℃下孵育过夜，用TBST洗3次后与二级HRP偶联抗体（1∶1 000）在室温下孵育2 h，使用ECL化学发光超敏显色试剂盒配制显色液，将条带置于VILBER显影仪进行曝光拍照并分析条带的灰度值，结果取3次重复实验的均值。

1.8 统计分析

采用GraphPad Prism 8.0.1软件对数据进行统计学分析，符合正态分布计量资料以 ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较比较采用Dunnett t检验。以P<0.05为差异具有显著性。

2 结  果

2.1 黄芩素对EAM小鼠心功能的影响

超声心动图结果显示，空白组、黄芩素组及地塞米松组的LVEF、LVFS均显著高于EAM组（F=51.55、35.38，q=5.96～11.00，P<0.05）；空白组及黄芩素组的LVIDd、LVIDs明显低于EAM组（F=4.64、17.72，q=2.88～6.30，P<0.05），地塞米松组的LVIDs明显低于EAM组（F=17.72，q=6.27，P<0.05），但LVIDd与EAM组无明显差异（P>0.05）。见表2。

2.2 黄芩素对EAM小鼠心肌组织炎症反应和纤维化的影响

HE及Masson染色结果显示，空白组小鼠心肌组织中无炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，EAM组小鼠心肌组织有大量炎症细胞浸润及胶原纤维沉积，黄芩素组和地塞米松组心肌组织中炎症细胞浸润及胶原纤维沉积较EAM组明显减少（图1）。

2.3黄芩素对EAM小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例的影响

流式细胞术检测结果显示，空白组、EAM组、黄芩素组、地塞米松组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例分别为（0.29±0.10）%、（0.30±0.07）%、（0.16±0.03）%、（0.08±0.04）%。黄芩素组、地塞米松组小鼠脾细胞Th17/Treg比例明显低于EAM组（F=6.80，q=3.60、3.06，P<0.05）。见图2。

2.4黄芩素对EAM小鼠心脏组织中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10 mRNA水平影响

RT-qPCR检测结果显示，空白组、黄芩素组、地塞米松组小鼠心脏组织中CollagenⅠ、IL-17A水平明显低于EAM组（F=112.40、77.49，q=8.27～15.91，P<0.05）；黄芩素组MMP-1、FOXP3、IL-10水平明显高于EAM组（F=19.05～144.60，q=5.37～11.21，P<0.05）；地塞米松组FOXP3、IL-10水平也明显高于EAM组（F=19.05、144.60，q=4.36、10.32，P<0.05），MMP-1水平与EAM组无明显差异（P>0.05）。见表3。

2.5黄芩素对EAM小鼠心脏组织中CollagenⅠ、MMP-1、IL-17A、FOXP3、IL-10蛋白表达水平影响

免疫印迹法检测结果显示，空白组、黄芩素组、地塞米松组小鼠心脏组织中CollagenⅠ、IL-17A蛋白表达水平显著性低于EAM组（F=13.70、13.97，q=4.61～5.95，P<0.05）；黄芩素组MMP-1、IL-10、FOXP3蛋白表达水平明显高于EAM组（F=6.77～17.21，q=3.32～6.14，P<0.05）；地塞米松组小鼠心脏组织中FOXP3、MMP-1、IL-10蛋白水平与EAM组比较无明显统计学差异（P>0.05）。见表4、图3。

3 讨  论

心肌纤维化的特征是心肌中成纤维细胞募集介导的细胞外基质蛋白进行性积累，心肌纤维化主要发生在心力衰竭后期［10-12］。有研究认为炎症细胞通过分泌细胞因子和趋化因子形成炎症微环境，激活成纤维细胞，导致心肌纤维化的形成［13］。既往研究表明，黄芩素可通过调控Th17/Treg细胞比例减轻结肠炎临床症状［7］，还可抑制不同原因导致的肺纤维化和肾纤维化进展［14-15］，而黄芩素是否可以抑制EAM小鼠心肌组织纤维化研究较少。心肌纤维化与心功能障碍紧密相关，判断心功能障碍的指标包括LVEF、LVFS、LVDId、LVIDs等，LVEF、LVFS降低以及LVIDd、LVIDs升高均表明左心室收縮功能的减弱。WANG等［16］通过采用超声心动图检测EAM小鼠上述指标，证明巴西多芬可以减轻EAM引发的小鼠心功能障碍。本实验中，EAM组小鼠的LVEF以及LVFS明显低于黄芩素组，LVIDd、LVIDs则明显高于黄芩素组，表明黄芩素可以明显减轻EAM小鼠心功能障碍。HE及Masson染色结果显示，黄芩素组及地塞米松组小鼠心肌组织炎症细胞浸润和胶原纤维沉积较EAM组明显减少，从组织学上体现了黄芩素对EAM小鼠心肌组织纤维化的缓解作用。在心肌纤维化小鼠中，心肌成纤维细胞过度激活后分泌较多胶原蛋白，以Collagen Ⅰ为主，而具有胶原蛋白降解功能的MMP活性下降，引起胶原降解减慢，导致心肌细胞中大量胶原纤维沉积，从而导致心肌细胞发生纤维化。本研究中RT-qPCR及免疫印迹结果显示，EAM小鼠心脏组织中CollagenⅠ表达水平较高，而黄芩素及地塞米松干预后CollagenⅠ的表达明显下降，EAM小鼠心脏组织中MMP-1的mRNA及蛋白表达较低，而黄芩素干预后其表达明显上调，地塞米松干预后MMP-1的mRNA及蛋白表达与EAM组则无明显差异。因此，黄芩素干预可以降低EAM小鼠心脏组织中CollagenⅠ的表达，增加MMP-1的表达，进而减少EAM小鼠心肌组织纤维化。

炎症细胞的浸润与心肌纤维化发生有着密不可分的关系。EAM小鼠心肌组织中炎症细胞的浸润主要和CD4+T细胞有关［17］。Th17与Treg细胞之间平衡紊乱发生在多种疾病中，如Th17/Treg比值在类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化症和自身免疫性结肠炎患者中显著升高［18-20］。为探讨黄芩素干预后EAM小鼠心肌纤维化减轻机制，本研究于小鼠饲养后第21天检测各组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例，结果显示黄芩素组及地塞米松组小鼠脾细胞中Th17/Treg细胞比例相较于EAM组明显降低。RT-qPCR和免疫印迹实验结果则显示，黄芩素组小鼠心脏组织中IL-17A mRNA及蛋白水平较EAM组明显下调，FOXP3、IL-10 mRNA及蛋白水平明显上调。有研究发现IL-17RA和IL-17RC在小鼠心肌成纤维细胞中呈高表达，进一步研究还发现IL-17可以诱导心肌纤维化［21］，而体内和体外实验都显示Treg产生的IL-10显著抑制了心肌成纤维细胞的胶原合成，Treg细胞已被证明可通过产生免疫抑制细胞因子IL-10从而介导免疫反应［22-24］。因此黄芩素干预后EAM小鼠心脏组织中促纤维化因子IL-17A水平明显下调，抗纤维化因子IL-10水平明显上调，说明黄芩素抑制了心肌成纤维细胞激活，减轻了心肌组织纤维化。

综上所述，黄芩素干预可通过调控Th17/Treg细胞比例的平衡减轻EAM小鼠的心肌纤维化，本研究结果为延缓EAM患者心肌纤维化进程提供了治疗新思路。

伦理批准和动物权利声明： 本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学医学部伦理委员会审核批准（文件号QDU-AEC-2023-417）。所有实验过程均遵照《实验动物管理守则》的条例进行。

作者声明： 王甜甜、王爽参与了研究设计；王甜甜、李玲参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文，且均声明不存在利益冲突。

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（本文編辑 范睿心 厉建强）