中度脂肪肝对原位自体肝移植模型大鼠心脏功能的影响

王楷文 董河 吕琳 刘欢 蔡金贞

［摘要］  目的  探究中度脂肪肝對原位自体肝移植模型大鼠心脏功能的影响。

方法将60只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为3组（每组20只）。A组喂养普通饲料6周，开腹后游离肝脏周围血管及韧带后关腹；B组喂养普通饲料6周，实施原位自体肝移植手术；C组喂养高脂饲料6周，实施原位自体肝移植手术。比较各组大鼠饲养6周后的体质量、肝湿质量、肝指数及血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）的水平，比较各组大鼠术中血压、脉搏、呼吸频率、新肝期心律失常发生比例以及新肝期0、5、10、60 min时血清乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、高敏肌钙蛋白（hs-cTn）等指标水平。

结果C组大鼠的体质量、肝湿质量、肝指数、血清AST水平、血清ALT水平及术中收缩压、舒张压、脉搏、呼吸频率、新肝期心律失常发生比例显著高于A、B组（F=36.40～4 060.54，χ2=10.91，P＜0.05），A、B组大鼠上述指标无明显差异（P＞0.05）。C组大鼠新肝期不同时刻血清LDH、α-HBDH、CK、CK-MB、hs-cTn水平均显著高于A、B组（F=14.11～1 057.08，P＜0.05），且B组显著高于A组（F=12.59～279.94，P＜0.05）。

结论中度脂肪肝可能导致肝移植新肝期心律失常的发生，降低心脏功能，加剧术中应激反应。

［关键词］  肝移植；移植，自体；脂肪肝；肝功能试验；心律失常，心性；乳酸脱氢酶类；羟丁酸脱氢酶；肌酸激酶；同工酶类；肌钙蛋白

［中图分类号］  R657.3

［文献标志码］  A

Effect of moderate fatty liver on cardiac function in orthotopic autologous liver transplantation model rats

WANG Kaiwen， DONG He， LYU Lin， LIU Huan， CAI Jinzhen

（Department of Anesthesiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

;［ABSTRACT］ Objective To explore the effect of moderate fatty liver on cardiac function in orthotopic autologous liver transplantation model rats.

Methods Sixty SPF-grade healthy male SD rats were randomly divided into three groups （20 rats in each group）. Group A was fed ordinary diet for 6 weeks and underwent laparotomy followed by separation of the blood vessels and ligaments around the liver and abdominal closure; group B was fed ordinary diet for 6 weeks and underwent orthotopic autologous liver transplantation; group C was fed high-fat diet for 6 weeks and underwent orthotopic autologous liver transplantation. The body mass， liver wet mass， liver index， and serum levels of aspartate aminotransferase （AST） and alanine aminotransferase （ALT） after 6 weeks of feeding， as well as intraoperative blood pressure， pulse rate， respiratory rate， proportion of arrhythmia occurring in the new liver stage， and serum levels of lactate dehydrogenase （LDH）， α-hydroxybutyrate dehydrogenase （α-HBDH）， creatine kinase （CK）， creatine kinase isoenzyme （CK-MB）， and high-sensitivity cardiac troponin （hs-cTn） at 0， 5， 10， and 60 min in the new liver stage were compared.

Results The body mass， liver wet mass， liver index， and serum AST and ALT levels， as well as intraoperative systolic blood pressure， diastolic blood pressure， pulse rate， respiratory rate， and proportion of arrhythmia occurring in the new liver stage in group C were significantly higher than those in groups A and B （F=36.40-4 060.54，χ2 =10.91，P<0.05）， with no significant differences between groups A and B （P>0.05）. The serum levels of LDH， α-HBDH， CK， CK-MB， and hs-cTn at different time points in the new liver stage were significantly higher in group C than in groups A and B （F=14.11-1 057.08，P<0.05）， and were significantly higher in group B than in group A （F=12.59-279.94，P<0.05）.

Conclusion

Moderate fatty liver may lead to the occurrence of arrhythmia in the new liver stage in liver transplantation， reduce cardiac function， and exacerbate intraoperative stress response.

［KEY WORDS］ Liver transplantation; Transplantation， autologous; Fatty liver; Liver function tests; Arrhythmias， car-

diac; Lactate dehydrogenases; Hydroxybutyrate dehydrogenase; Creatine kinase; Isoenzymes; Troponin

近年来，随着肝移植治疗患者数量的日益增加及肝移植技术的不断进步，供肝来源拓展已经成为肝移植临床研究热点［1］。临床中将“边缘供肝”纳入移植供肝的选择范围内，在一定程度上可缓解移植肝供需矛盾［2］。脂肪肝为“边缘供肝”的常见类型之一，目前临床公认轻度脂肪肝不会对移植物及受者产生明显影响，但有关中重度脂肪肝是否产生不良影响的相关报道较少［3］。鉴于非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）供者比例日益增多，如何提高脂肪变性供肝的使用率至关重要［4］。既往有学者指出，原位肝移植手术中门静脉开放肝血流恢复时常出现血流动力学异常，这种再灌注后综合征的发生率近年逐渐升高，甚至造成术中心脏停搏，危及生命［5-6］。已有研究表明，中度脂肪肝供肝是再灌注后综合征导致心脏停搏的危险因素之一［7］。脂肪肝缺血-再灌注损伤的病理特点与正常肝脏存在差异，其表现出肝细胞坏死，极易造成原发性移植物功能失调，进一步导致门静脉开放肝血流恢复时心功能受损。因此，分析脂肪肝对肝移植手术受者心功能的影响，对降低受者新肝期心脏停搏发生比例、保护心功能、改善临床预后具有重要意义。本研究通过建立原位自体肝移植大鼠模型，观察中度脂肪肝对该模型大鼠心功能的影响，旨在为相关手术患者心功能保护提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择SPF级健康雄性SD大鼠60只，体质量为（205.39±7.83）g。饲养环境：温度20～23 ℃，湿度50%～55%，明暗周期为12 h/12 h，大鼠自由摄食饮水。将大鼠适应性喂养1周后随机分为3组，每组20只。其中A组大鼠喂养普通饲料（质量分数0.25麸皮、质量分数0.20面粉、质量分数0.20豆料、质量分数0.20玉米、质量分数0.10米粉、质量分数0.03骨粉、质量分数0.02鱼粉）6周，开腹后游离肝脏周围血管以及韧带后关腹；B组喂养普通饲料6周后，行原位自体肝移植手术；C组喂养高脂饲料（质量分数0.88普通饲料、质量分数0.10猪油、质量分数0.02胆固醇）6周后，行原位自体肝移植手术。

1.2 术前指标收集

饲养6周后检测3组大鼠的体质量、肝湿质量、肝指数及血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。具体操作为：①对各组大鼠进行称体质量；②使用西门子螺旋CT检测肝湿质量、肝指数；③禁食12 h后采集腹主动脉血约4 mL，以3 000 r/min离心10 min，用全自动生化分析仪检测血清AST及ALT水平。

1.3 手术方法及术中指标收集

术中需收集指标包括3组大鼠的脉搏、呼吸频率、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、新肝期心律失常的发生情况，以及新肝期0 min（T0）、5 min（T1）、10 min（T2）及60 min（T3）时血清心肌酶水平。将B、C组大鼠禁食12 h，使用瑞沃德动物麻醉机给予2%七氟烷诱导麻醉，待其进入麻醉状态，再腹腔注射40 mg/kg的1%戊巴比妥钠。麻醉成功后，大鼠颈动脉插管并连接Medlab生物信号采集系统，四肢掌心粘贴电极贴片，连接心电监护仪，连续监测术中血压、脉搏、呼吸频率及心电图。将大鼠仰卧位固定于自制动物手术台，备皮消毒，经腹做正中切口进入腹腔，充分暴露手术视野，遵循尽量少翻动肝脏的准则，顺时针游离肝脏周围韧带、包膜及血管并充分止血，轻轻捻转湿棉签翻动肝叶，暴露第一肝门［8］。使用微血管夹夹闭门静脉、肝下下腔静脉和肝固有动脉，将黄色24 G留置针刺入门静脉，拔出针芯连接延长管及5 mL注射器，推注4 ℃肝素生理盐水（3×104 U/L）1～2 mL，将肝内血液充分排至体循环，再夹闭肝上下腔静脉，使肝脏处于无血供状态。钳夹固定留置针套管，在肝后下腔静脉微血管夹上方剪开约1 mm开口作为灌注液流出道，用输液泵经门静脉将4 ℃乳酸钠林格液以6 mL/min流量缓慢持续灌注60 min，至肝脏逐漸变为土黄色，触之冰凉为止。灌注完毕后缝合流出道开口，拔除留置针并棉棒压迫门静脉穿刺点止血，确认无出血点后依次开放肝上下腔静脉、肝后下腔静脉、门静脉及肝固有动脉，实现肝脏血流再灌注，肝脏逐渐恢复鲜红色［9］，于新肝期T0～T3时采集下腔静脉血，利用全自动生化分析仪检测大鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）及高敏肌钙蛋白（hs-cTn）水平。用温生理盐水冲洗腹腔并使肝脏快速复温，最后逐层缝合腹壁，手术结束。A组大鼠开腹前操作同B、C组，开腹后仅游离肝脏周围韧带、包膜及血管，按B、C组相同时间点检测心肌酶后关腹。术后采用吸入二氧化碳法使各组大鼠安乐死。

1.4 统计学分析

使用SPSS 23.0对资料进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以 ±s表示，同一时间点组间比较采用单因素方差分析，不同时间点组间比较采用重复测量设计的方差分析；计数资料以例（率）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 中度NAFLD大鼠模型验证

经过6周喂养，术前观察到C组大鼠体质量较A、B两组更高，肝脏体积略肿胀增大，包膜紧张光滑，边缘变钝，质地柔软，色棕黄，有油腻感。术后于肝左叶边缘相同位置取0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm肝组织，置于4%多聚甲醛之中固定，石蜡包埋、切片、HE染色，于光学显微镜下观察肝组织病变情况及肝细胞形态结构。根据肝细胞中脂肪含量比例判断，C组大鼠肝组织可见肝细胞脂肪变性、肿胀，细胞核位于肝细胞边缘，肝血窦变窄，整个肝小叶中有35%～55%左右肝细胞发生脂肪变性，符合肝中度脂肪变性［10］，提示造模成功，未达标大鼠的数据舍弃，并进行补充实验。实验结果示A、B组大鼠肝组织病理检查正常，未见脂肪变性的肝细胞。见图1。

2.2 三组大鼠的体质量、肝湿质量、肝指数、血清AST及ALT水平比较

与A、B组相比，C组大鼠的体质量、肝湿质量、肝指数以及血清AST、ALT水平显著升高（F=79.38～4 060.54，P＜0.01）；A、B组大鼠上述指标无明显差异（P＞0.05）。见表1。

2.3 三组大鼠术中血压、脉搏、呼吸频率及门脉开放后心律失常比例比较

C组5例大鼠新肝期发生心律失常，分别为窦性心动过缓2例，房颤1例，室上性心动过速1例，室性心动过速1例。与A、B组相比较，C组大鼠术中SBP、DBP、脉搏、呼吸频率及新肝期心律失常发生比例均显著升高（F=36.40～297.39，χ2=10.91，P＜0.05）；而A、B组大鼠上述指标比较无明显差异（P＞0.05）。见表2。

2.4 三组大鼠新肝期各时刻血清心肌酶及hs-cTn水平比较

方差分析结果显示，时间、组别、时间与组别交互作用对大鼠血清心肌酶水平均有显著性影响

（F时间=261.99～1 426.03，F组别=289.05～2 110.02，F时间*组别=42.94～673.74，P＜0.05）。单独效应结果显示，与T0时相比，C组大鼠在T1～T3时血清LDH、α-HBDH、CK、CK-MB及hs-cTn均有显著差异（F组内=7.06～347.51，P＜0.05）；在T0～T3时间点，C组大鼠血清LDH、α-HBDH、CK、CK-MB以及hs-cTn水平均显著高于A、B组（F组间=14.11～1 057.08，P＜0.05），且B组大鼠上述指标均显著高于A组（F组间=12.59～279.94，P＜0.05）。见表3。

3 讨  论

既往已有较多关于肝移植后心血管并发症的相关研究，且多数研究集中于探讨术中发病机制，肝移植围手术期心肌损伤的发生机制较复杂，已明确其与原发终末期肝病、术中缺血、过多补液、内毒素和酸性代谢产物大量进入体循环等因素相关［11-13］。且肝移植手术中受者下腔静脉被长时间阻断，可导致回心血量减少、氧供降低，进而诱发低血压及低心排综合征等，造成心肌缺血性损伤［14］。同时，新肝再灌注时酸碱平衡失调、电解质紊乱、心肌抑制因子生成、低温等因素也会造成不同程度的心肌损伤，此时心肌细胞缺血缺氧信号通过颈动脉化学感受器刺激脑干血管收缩中枢兴奋，增强交感神经传出纤维活性，促进机体分泌大量内源性儿茶酚胺，造成门脉开放后室性心律失常，损伤心功能［15-16］。另外，近年来有研究指出肝移植受者合并心律失常与供肝功能不全相关［17］，脂肪肝缺血-再灌注损伤多发肝细胞坏死和原发性移植物功能失调，因此推测脂肪肝可能影响肝移植手术后肝血流恢复，降低心脏功能，影响受者预后［18］。

本研究中，C组大鼠的体质量、肝湿质量、肝指数及血清AST、ALT水平均显著高于A、B组，结合病理切片HE染色结果，提示中度NAFLD大鼠模型建立成功。C組大鼠术中血压、脉搏、呼吸频率及新肝期心律失常发生比例均显著高于A、B组，而A、B组间上述指标无明显差异。另外，与T0时相比，C组大鼠在T1、T2、T3时血清LDH、α-HBDH、CK、CK-MB及hs-cTn水平均差异显著；而在新肝期的不同时间点，C组大鼠的血清LDH、α-HBDH、CK、CK-MB、hs-cTn水平均显著高于A、B组，且B组显著高于A组。心肌细胞损伤后，细胞膜完整性和通透性改变，细胞内LDH、α-HBDH、CK、CK-MB以及心肌肌钙蛋白Ⅰ等物质可渗漏入外周血循环中［19］，因此，本研究结果提示肝移植手术中中度NAFLD供肝的使用可能对术后心功能造成一定损伤［20］。

以往研究指出，轻度NAFLD供肝能够被安全地用于肝移植手术，且受者能够获得与正常供肝相类似的围手术期结局及短期预后［21］。与此同时，大部分移植中心认为轻度NAFLD供肝与受者预后不良并无相关性，但中度NAFLD供肝与受者预后不良的关系目前仍有争议［22］。近年来，越来越多研究表明，NAFLD可能是导致心脏结构及功能受损致病因素之一，NAFLD可能通过引起胰岛素抵抗导致心肌细胞代谢受损、自主神经功能障碍及心外膜脂肪组织增厚等，最终致心脏结构及功能受损［23-24］。另有研究表明NAFLD与左心室舒张功能不全的发生密切相关，而肝脏脂肪分数与左心室心肌收缩期整体纵向峰值应变率（GLPSSR）以及收缩期整体轴向峰值应变率（GCPSSR）呈中度负相关，随着NAFLD严重程度增加，GLPSSR、GCPSSR降低，左室舒张功能更易受损［25］。

综上所述，中度NAFLD可能导致肝移植新肝期心律失常的发生，降低心功能，加剧术中应激反应，NAFLD作为供肝时其脂肪变性程度对受者心功能及预后有一定影响。这提示肝移植手术面对NAFLD供肝的选择时，应尽量选择轻度NAFLD，同时在供肝为中度NAFLD的手术中，应加强对受者心功能的保护。

伦理批准和动物权利声明： 本研究涉及的所有动物实验均已通过青岛大学附属医院实验动物福利伦理委员会的审核批準（文件号AHQU-MAL20200925）。所有实验过程均遵照《实验动物福利伦理原则》的条例进行。

作者声明： 王楷文、董河、吕琳、刘欢参与了研究设计；王楷文、董河、蔡金贞参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文，且均声明不存在利益冲突。

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（本文编辑 范睿心 厉建强）