基于膝关节软骨损伤探讨自体软骨细胞植入术的相关研究进展

王宁,王广积,杜秀藩

(1.海南医学院,海南 海口 570311;2.海南医学院附属海南医院,海南省人民医院运动医学科,海南 海口 570300)

膝关节软骨是覆盖双关节末端的无血管和非神经结缔组织,其功能主要是实现润滑的关节运动,在日常活动中其承受重复的高冲击和负荷,所以膝关节软骨损伤是常见的骨科疾病之一[1]。由于其无血管结构,再生能力较差,因此对于它的修复和再生具有很高的挑战性。临床上对于修复关节软骨损伤的手术已有多种方法,比如微骨折(microfracture,MF)、骨软骨自体移植(osteochondral autograft transplantation,OAT)、同种异体骨软骨移植(osteochondral allograft transplantation,OCA)、自体软骨细胞植入(autologous chondrocyte implantation,ACI)以及组织工程技术等。

目前关节软骨缺损的理想治疗方法是恢复有组织的透明软骨,降低其再发病率。目前ACI、OAT与OCA以及组织工程技术理论上能提供透明软骨的几种手术方案,然而OAT存在供体区发病率的问题,并且与移植物的面积大小成正比,即软骨损伤区域越大,应用OAT治疗软骨损伤后引发供体区发病率的可能性越大[2]。OCA作为替代OAT的治疗手段,目前是临床研究的热点之一,但OCA作为异体移植物,可能存在宿主-移植物反应,这可能导致移植失败。除此以外OCA还存在着疾病传播、移植物轮廓匹配以及从移植物获取到植入的时间有限等因素的影响[3]。

1 ACI的进化过程

20世纪60年代末,Chesterman和Smith[4]发表了一篇具有里程碑意义的文章,描述了成功地将分离的软骨细胞移植到兔子身上。他们的发现为后续ACI的发展做了良好的铺垫,直到1994年ACI技术被Brittberg等[5]首次报道。ACI技术主要分为两个步骤:(1)在关节镜检查过程中获得软骨细胞,然后将其送去培养;(2)在获得的软骨细胞培养2～3周后,将骨膜贴片用可吸收缝线固定在周围的软骨上以形成一个储液器,并在其下方注射培养的软骨细胞悬浮液。最早的ACI技术也被称为第1代ACI,基于骨膜的自体软骨细胞植入(periosteum-based autologous chondrocyte implantation,ACI-P)。随着技术的发展,研究者也对第1代ACI技术进行了新的改进,比如应用胶原膜替代骨贴膜、使用支架等;第2代ACI在悬浮培养的软骨细胞表面覆盖一层由I型或Ⅲ型胶原组成的膜;第3代技术涉及细胞外基质或临时支架的创造,旨在诱导细胞在体外生长和成熟。软骨细胞附着在支架上,从而避免了将细胞注射到病变部位的需要。这些第2代和第3代技术也被称为基于胶原膜的自体软骨细胞植入(collagen membrane-based autologous chondrocyte implantation,ACI-C)、膜相关自体软骨细胞植入(membrane-associated autologous chondrocyte implantation,MACI)和基于支架的ACI[6]。

2 关于3代ACI

三种ACI技术均以软骨细胞培养以诱导透明软骨形成为目的,三者的区别主要在于贴膜性质与承载软骨细胞的介质不同。虽然ACI-P的短期和中期结果可观,但可能发生多种并发症,包括骨膜肥大、骨膜钙化、分层和关节内病变等[7]。

ACI-C与MACI的发展相当迅速,其目的是解决与ACI-P相关的局限性。ACI-C目前经过至少一项前瞻性研究已被证实持久有效。比如在一项前瞻性实验中,Ossendorf等[8]使用一种基于自体聚合物的三维软骨细胞移植物,可以很好地修复局灶性关节软骨缺损。这种聚合物名为BioSeed-C,是一种第2代ACI组织工程软骨移植物,它能将自体软骨细胞与凝胶样基质的组织二者特性结合在稳定的生物可吸收聚合物支架中。该研究结果报告认为这种第2代ACI方法与ACI-P相比具有许多优势,具体表现在通过使用稳定的生物贴膜,使接种的软骨细胞更有效地保留在植入部位,减少关节腔细胞丢失,从而促进新软骨与周围宿主关节软骨组织之间更充分的整合。Gooding等[9]比较了ACI-P和ACI-C的短期疗效,随访2年中试验结果差异无统计学意义。然而,ACI-P组的并发症发生率较高,因为多例患者因移植物(骨膜)肥大或出现分层需要进行翻修手术。Samuelson和Brown等[10]则对ACI-P和ACI-C进行了成本效益分析,他们发现虽然这两种方法都具有成本效益,但是基于移植物肥大风险而言,发现ACI-C比ACI-P更具成本效益。在一项针对第1代和第2代ACI技术临床治疗效果长达10年随访的研究中,与ACI-P相比,ACI-C将胶原膜与自体软骨细胞结合使用可带来更好的临床长期结果。基于这些结果,ACI-C应优先于ACI-P[11]。

MACI出现于20世纪90年代和21世纪初,提倡使用MACI的研究者们认为该技术消除了与ACI-P和ACI-C相关的某些并发症和困难[12]。例如,当使用带骨膜或胶原蛋白贴片的ACI时,很难均匀分布软骨细胞或在不规则骨软骨连接处形成安全贴片。ACI-P和ACI-C二者都需要缝合和行关节切开术,会延长手术时间,与贴片技术相关的常见并发症包括移植物肥厚、贴片剥离以及缝合线对周围软骨的损伤等。与ACI-P和ACI-C不同,MACI中自体软骨细胞是在膜上植入的。MACI膜由含有软骨细胞的Ⅰ型/Ⅲ型胶原双分子层组成,双分子层的一侧有间距很大的胶原纤维,这就形成了一个粗糙的表面,双分子层的另一侧由紧密排列的胶原纤维组成,这就形成了一个光滑的表面。软骨细胞分布在双分子层粗糙的一侧。在手术过程中,用纤维蛋白胶将膜直接固定在软骨损伤处,从而避免了缝合膜的需要。由于其粘附性,这种膜可以植入困难的部位,细胞也均匀分布在整个膜上。MACI的另一个优点是它可以作为成纤维细胞移入软骨细胞的屏障,否则会导致纤维软骨的形成[12]。

Ebert等[13]用MACI治疗膝关节软骨损伤,并在移植后5年用临床症状和MRI进行评估治疗效果。在接受治疗的45例患者中,膝关节损伤和骨关节炎结局评分(knee injury and osteoarthritis score,KOOS)以及健康调查简表(the MOS item short from health survey, SF-36)均有显著改善,MRI评分显著提高,67%患者的移植物显示完全填充,89%患者的移植物显示良好到极好的填充。同样,Marlovits等[14]报告了用MACI治疗软骨缺损的临床和放射学的5年随访结果,MACI术后患者的KOOS评分均有显著改善,不仅如此,患者国际膝关节文献委员会(international knee documentation committee,IKDC)评分、辛辛那提膝关节评分和膝关节Lysholm评分也取得了显著改善,而在治疗5年后大多数患者观察到移植物完全填充(83%)。在一项Ⅱ级研究中,Zeifang等[15]比较了MACI和ACI-P的2年预后,该研究纳入了21例软骨受损平均面积为4.1 cm2的患者,虽然术后IKDC的差异不大,但ACI-P组Lysholm的评分却较高。此外,术后MRI的评估显示,ACI-P组的软骨修复组织MRI观察评分较MACI组更高,但随访2年后结果差异无统计学意义。而Bartlett等[12]在ACI-C与MACI治疗效果的Ⅱ级随机研究中共纳入91例患者,结果两组辛辛那提膝关节评分、国际软骨修复协会评分、疼痛视觉模拟评分表的差异均无统计学意义,且两组患者并发症发生率接近,均发生移植物肥厚。

3 ACI与其他手术的差异

3.1 ACI与MF 以MF为代表的骨髓刺激技术因为其简易、成本低、短期效果好而常常做为软骨损伤后的首选治疗方式。但有证据提示在接受MF治疗5年后,特别是应用MF治疗大面积软骨缺损治疗时,膝关节功能会发生恶化[16]。在一项多中心前瞻性试验中,Saris等[17]将118例患者随机分组,分别进行MF和ACI治疗(ACI-P或ACI-C),随访3年后发现两组KOOS、疼痛视觉模拟评分表以及生活质量上比较,ACI组明显高于MF组。而Kon等[18]进行了一项前瞻性队列研究,比较了ACI-C与MF治疗膝关节软骨损伤的疗效。该研究应用了一种名为Hyalograft C的聚合物,发现随着时间的推移,植入Hyalograft C组在2～5年后观察到良好的结果,而MF组在治疗4～6年后逐渐恶化。在Kon[19]的另一项研究中,在高水平的男性足球运动员中发现了类似的结果:虽然MF组较早恢复运动,但随着时间的推移结果有所下降,所以他认为基于胶原贴膜的软骨细胞植入技术(Hyalograf-C)较MF能提供更持久的临床结果。Basad等[20]进行了一项前瞻性随机对照试验研究,将MACI与骨髓刺激技术进行了比较,其中20例患者接受MACI手术,20例患者接受MF手术,两组在Lysholm评分、国际软骨修复协会评分方面均有显著改善,但手术后2年内MACI优于MF。而在Dhillon等[21]一篇关于MACI与MF治疗膝关节局灶性软骨缺损的meta分析也支持这种观点,他认为在短期随访中,MACI治疗成功率高于MF。

3.2 ACI与OAT/OCA 既往研究已经表明[22-23]关节软骨缺损区域在2～4 cm2可以使用ACI或OAT,当缺损区域>4 cm2则可以使用ACI或OCA。OAT是一种能立即用透明软骨填充关节软骨缺损的手术治疗方式,这种技术需要从患者自己的关节收集软骨(通常是同侧膝盖的非承重区域),收获一个或多个骨软骨移植物,并将其移植到软骨缺损区域,但这将导致收集软骨区域发生软骨缺损的概率增大[2]。在一项关于ACI与OAT随访时间至少10年的前瞻性研究中发现,与OAT相比,接受ACI治疗功能结局明显更好[24]。

关节软骨缺损太大而无法成功自体移植时,OCA可作为OAT的替代疗法。研究表明[25],这种技术可改善功能,用于治疗局灶性和弥漫性软骨病变以及高需求患者。在一项队列研究中[26]对比了OCA与ACI治疗局灶性关节软骨缺损的临床和功能结局差异,研究结果表明,ACI在所有病变部位治疗症状性关节软骨缺损的结局与OCA相似。

4 ACI相关并发症

虽然ACI技术从短期和长期结果来看都有不错的成绩,但伴随ACI的并发症问题不容小觑,一篇关于研究膝关节软骨缺损自体软骨细胞植入后的特征性并发症认为,ACI的并发症主要诊断可归纳为四种:症状性肥大、融合紊乱、分层和移植失败[27]。(1)症状性肥大即前文所述的移植物肥厚,最常见于骨膜瓣覆盖ACI(ACI-P)的患者,常引起的临床症状如持续疼痛或膝关节功能障碍。Harris等[28]在一篇囊括了13项Ⅰ级和Ⅱ级研究报告的关于ACI系统综述中发现移植物肥厚发生率在ACI-P中占22%、ACI-C中占5%、MACI中占4%。(2)融合紊乱是指再生软骨不能与周围的健康软骨融合。Niemeyer等[27]发现融合不足的发生率为23.1%。以MACI组(4.8%)中发生干扰融合最为常见,其次是ACI-C组(3.7%),而ACI-P组无干扰融合病例。(3)分层是ACI后的并发症之一,指的是软骨与软骨下层骨的分离。这是由剪切力引起的,在两层融合发生之前,导致软骨层在软骨下骨层上滑动,这可能因不顺应或过早恢复负重而发生[27]。(4)在系统综述[28]中对移植失败最常见的定义是再次手术,在13项研究报告604例病例中,有17例需要再次手术,总体失败率为2.8%。而在Harris的另一篇单独对82项Ⅰ～Ⅳ级系统研究的综述中[29],囊括了5 276例患者,使用了不同代的ACI和手术技术,总体来说ACI治疗后失败率较低(1.5%～7.7%),与前面的系统综述[28]不同。这篇文献中将失败率与再手术率分开来描述结果,在3代ACI技术中,以ACI-P的术后失败率和非计划再手术率最高分别是7.7%和27.0%。其中以移植物肥厚和分层后进行清创为最常见的再手术原因。除此之外,还存在再生软骨不足、关节纤维化、深静脉血栓形成、伤口感染以及脓毒性关节炎等少见的并发症[27]。针对这些并发症,Welton等[2]认为选用ACI之前应从年龄、贴膜类别、软骨缺损位置等去考虑,比如老年人群及ACI-P治疗的患者容易出现再生软骨不足、移植物肥大等并发症,而髌骨软骨缺损可会导致移植物肥大的风险增加。分层的治疗方法是清除已经发生分层的软骨层后,根据剩余缺损的大小进一步治疗,较小的缺损(<2 cm2)可以通过MF或OAT进行二次治疗,而较大的缺损则考虑通过ACI或OCA来进行补救[2]。

5 ACI球状体的应用

2002年,Anderer和Libera[30]首次提出了源自自身聚集软骨细胞的球状体的概念,通过在琼脂糖包被的孔中培养扩增的软骨细胞来制造球状体是可行的,在内含自身血清的培养基中进行完整的细胞培养,不使用额外的生长因子、抗生素或其他异种产物。

基于球状体的概念,科研人员在早期进行了一系列临床前和非临床研究。在一项临床前实验中,Schubert等[31]进行了球状体的原理验证试验,该实验首次证明了软骨细胞球状体填充软骨病变的预期功能。而在另一项研究中,针对于骨骼成熟的雄性猪进行评估大型动物模型软骨细胞球状体的体内疗效[32]。在进行人为软骨缺损形成及球状体治疗后2个月后,对缺损区域进行组织学评估,结果发现在进行球状体治疗后表现出较未处理缺损更高程度的填充,并伴有更光滑的再生表面。除此之外,研究人员通过根据良好实验室管理规范评估免疫缺损型小鼠的生物分布和致瘤性,解决了植入球状体ACI后的安全性问题[33]。在随后的Ⅱ、Ⅲ期临床实验中研究了球状体剂量对治疗膝关节软骨缺损的安全性和有效性,以及对比了球状体与MF治疗膝关节软骨缺损的效果,结果显示随访数据得到改善,且较MF治疗水平高[34]。

在进行了一系列研究确保该技术的安全性和有效性后,球状体在近几年逐渐应用于临床。目前临床上应用的球状体是德国制造的产品,又称为Spherox。在这种技术中,软骨细胞在单层中培养,然后进行三维培养,形成由软骨细胞及其自合成的细胞外基质组成的球状体,在使用前球状体被放入NaCl溶液中。其可以自粘在软骨下骨和软骨上,与其他ACI技术相比,这去除了任何外源性基质、胶水或缝合线的需要[35]。在最近一项研究中,研究人员将球状体与MF进行了治疗对比研究,并进行了5年随访,发现球状体ACI治疗在5年随访期间的IKDC、KOOS、Lysholm以及软骨修复组织的磁共振观察等评分均有良好改善。其中球状体ACI的KOOS评分优于MF且没有发现安全隐患[35]。除了临床数据以外,在组织学结果上,研究人员对球状体ACI修复膝关节软骨缺损后的患者进行穿刺活检,并对标本进行组织学染色,发现在所有患者的再生组织中都观察到具有完整软骨-骨边界界面的缺血性软骨组织。再生组织内的细胞显示出圆形和软骨细胞表型,并形成簇状。该研究发现基于球状体的ACI治疗后再生的软骨组织在组织学和免疫组织化学上与透明关节软骨非常相似,这表明了基于球状体的ACI在以透明关节软骨为主的再生方面产生了有意义的组织学结果[36]。

6 总结与展望

目前常用的骨软骨病变治疗方法对于软骨缺损均有不同程度的疗效,ACI是一种有效的关节软骨再生方法,目前ACI/MACI被英国国家卫生与临床优化研究所推荐作为适用患者的一线手术[37]。

对于历代ACI技术,ACI-C较ACI-P的区别就在于贴膜的性质,能够更好的使软骨细胞溶液储存在缺损区域。虽然目前已经有研究证明ACI-C较ACI-P有短期至长期的优势,但大多数是基于ACI-P并发症多且高发来当做证据,这也将可能导致得出研究结论的依据过于单一以至于证据等级可信度不高。而现在尚未有有力的证据去证明MACI较前两代ACI技术存在优势,且阐述历代ACI之间比较的文献也较少。除此之外,对于移植失败的定义与再手术率的相关性在三种ACI技术中尚未得到共识。所以在三种ACI技术之间差异的问题上,未来可能需要通过设计良好且长期的随机对照试验研究来进一步探讨。

球状体ACI是一项相对较新的技术,多项研究报告已经确定了其安全性和有效性,甚至是相较于MF技术的优越性。而在与传统ACI技术的比较上,根据球状体ACI应用原理与传统ACI技术相关的并发症发生率可能会下降。比如有文献表明缝合线固定会永久性损伤周围的软骨[38],此外因为含有抑肽酶,导致使用人纤维蛋白封闭剂粘合移植物可能会引发免疫反应[39]。基于目前对球状体ACI技术的研究报告,球状体ACI治疗软骨缺损的效果似乎很有潜力,但目前关于球状体软骨细胞最佳培养时间和剂量还有待进一步研究,除此之外球状体ACI不良反应包括关节积液、关节痛和关节肿胀[40]。未来还需要更多且精心设计的随机对照实验去对比球状体ACI与传统ACI技术之间以及与其他软骨治疗方法的差异,才能得出其在治疗关节软骨缺损上证据等级更高的临床结论。