组织培养法保存新鲜同种异体骨软骨移植物的研究进展

马永胜,刘洋,杨文铭,邢煜刚,林啟泰,李泽昊,段王平,卫小春

(山西医科大学第二医院骨科,骨与软组织损伤修复山西省重点实验室,山西 太原 030001)

关节软骨(articular cartilage,AC)因无血管和神经的解剖学特性而具有免疫特权,非常适合同种异体移植手术[1]。同种异体骨软骨移植(osteochondral allograft,OCA)技术治疗由骨坏死、剥脱性骨软骨炎和创伤性损伤等引起的软骨缺损疗效显著[2-3]。传统上,OCA技术是在移植物获取后7 d内植入的,具有较高的软骨细胞活性,新鲜的同种异体骨软骨移植物(osteochondral allografts,OCAs)5年生存率已经超过80%[2-4]。然而,OCAs从尸体标本获取到植入,需要经过取材、处理、保存、细菌学检测、供体病原检测等过程,这些至少需要14 d时间,如果涉及到移植物运输、手术安排等问题,时间窗口会延长到21 d甚至更长时间[5-6]。OCA的临床结果很大程度上依赖于植入时存活的软骨细胞量,但软骨细胞存活率会随OCAs保存时间的延长而下降[7-9]。有研究表明,移植物细胞存活率70%以下时,术后效果很不理想[10]。如何延长和提高OCAs在体外保存过程中软骨细胞的活力成为OCAs保存的最大困难。目前,体外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷冻法和组织培养法等,其中组织培养法能够保持软骨细胞活力,所以广受临床医生的欢迎[11]。组织培养法保存OCAs缺乏系统性的综述,本文通过对近年来组织培养法保存OCAs的文献进行回顾和展望,为OCAs的临床应用提供参考。

1 组织培养法保存OCAs的优势

目前,体外保存OCAs的方法有玻璃化法、冷冻法和组织培养法。玻璃化保存法是将移植物置于特定的玻璃化溶液中快速降温固化,通过玻璃化冻存液与水分子发生强烈的水合作用,增加溶液黏性,从而防止移植物细胞内外冰晶形成,有效避免软骨细胞在降温和复温过程中的多种损伤。近年来,OCAs的玻璃化保存已成为日益流行的有效延长离体组织体外保存时间的一种方法[12]。然而,与组织培养法相比,玻璃化保存的OCAs在同种异体骨软骨移植时表现出较低的软骨细胞活力[13]。冷冻法可通过冷却至极低温度(-80 ℃)有效阻止任何可能对移植物造成损害的化学活动,保存移植物6个月甚至是1年的时间[14]。但软骨细胞存活率低和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的丢失是其重要的缺陷[15]。低温冷冻限制了软骨细胞的活力,OCAs通过组织培养法保存能够维持软骨细胞的活力,更适用于临床[8-9,16]。组织培养法是人工培养具有活性组织的方法,指将移植物放入含营养成分的培养基内,于适宜温度下保存,以保持OCAs的新鲜水平。组织培养法相对于玻璃化法和冷冻法保存AC,其主要优势是有效避免了细胞因冷冻而产生的损伤,能保持较高的软骨细胞存活率和基质含量[13]。由于软骨细胞活力和ECM含量是同种异体骨软骨移植成功的关键,所以组织培养法保存OCAs具有明显的临床优势。

2 组织培养法保存溶液及各种介质

2.1 保存溶液的选择

目前,常用的组织培养液有乳酸林格液(ringer lactate solution,RLS)、Eagle最低必需培养液(eagle’s minimum essential medium,EMEM)、Dulbecco改良Eagle培养液(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、威斯康星大学溶液(university of Wisconsin,UW)、RPMI 1640培养液和X-VIVO培养液等。RLS是最早用于保存OCAs的保存液,是由电解质和乳酸盐组成的等渗溶液,虽然在RLS和4 ℃无菌环境保存是最基本的新鲜组织保存方法,但缺乏维持细胞生长的营养,不能有效地支持软骨细胞新陈代谢,无法长期维持软骨细胞活性[17]。有学者比较RLS和DMEM/F12基础培养基保存OCAs,实验数据表明,OCAs在RLS中保存1周后软骨细胞存活率显著下降至70%以下;然而,保存在培养基中的OCAs有较高的软骨细胞存活率,14 d后软骨细胞存活率>85%[18]。将OCAs保存液从RLS改进为基础培养基可以提高移植物软骨细胞存活率,延长保存时间,具有更好的临床效果。

2.2 营养介质

为了使软骨细胞存活更长的时间,基础培养基必须补充多种营养成分。血清中含有细胞生长所必需的营养成分,在细胞培养和软骨组织的保存中都有应用。有研究表明,在保存液中加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)可以显著提高软骨细胞的存活率[19]。此外,Onuma等[20]从大鼠股骨远端采集的骨软骨组织样本,在含有0、1%、10%和50%同种异体血清的UW溶液中保存14 d,结果显示在含有10%或更高浓度血清的UW溶液中,具有最高的软骨细胞活力和最低的软骨细胞退行性变化。也有研究显示,在富含人血清蛋白的培养基中保存人类的OCAs可以显著减少软骨细胞的死亡率[14]。然而,不同批次的血清之间缺乏一致性,存在潜在的免疫反应以及传染病传播的风险[21]。

生长因子是存在于生物体内,对生物的生长、发育具有广泛调节作用的活性蛋白质或多肽类物质。它可以代替培养基中血清高分子物质促进细胞生长,是具有刺激细胞生长活性的细胞因子[22-23]。Mickevicius等[24]发现在培养基中添加胰岛素样生长因子可以提高软骨细胞的活力,改善软骨的机电和组织学性能。Sprifermin是一种新型的重组人成纤维细胞生长因子18(human-recombinant fibroblast growth factor-18,rhFGF18),在体外刺激软骨细胞增殖和基质生成,在体内增加关节软骨的新生基质形成[25]。Meloni等[25]使用含有rhFGF18的培养基保存牛的OCAs,3周后进行力学检测和生化分析发现,rhFGF18能促进细胞外胶原蛋白和抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)的产生,保持关节软骨固有的力学特性。在OCAs保存过程中,营养物质的重要性是毋庸置疑的,添加什么样的营养介质和如何添加营养介质还需要进一步研究。

2.3 抗凋亡介质

软骨细胞死亡,尤其是由细胞凋亡引起的软骨细胞死亡,与软骨基质降解和骨关节炎的发生有关[24]。细胞凋亡也是OCAs获取、保存和植入过程中软骨细胞活力下降的原因之一[26]。研究发现,OCAs保存过程中存在与细胞凋亡相关的靶点,如半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase),Fas受体和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等,这些凋亡相关受体在保存阶段的基因表达显著上升[27]。软骨细胞有不同的凋亡调节途径,一氧化氮(NO)途径在其中占主导地位[26]。有报道称,N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可预防NO诱导的软骨细胞凋亡和退行性改变[28]。Calvo等[26]在NAC富集培养基中保存OCAs,4周后,软骨细胞存活率高达83.8%。此外有研究表明,AC浅表层细胞凋亡表达最高,在软骨保存液中添加凋亡抑制剂依那西普,它可以通过抑制TNF-α来阻断凋亡途径,增强浅表层软骨细胞的活力[29]。因此,明确促凋亡基因在OCAs保存过程中的机制,并抑制其表达,保护浅表层细胞,减少移植后软骨退化,是增强软骨细胞活力的有效方法。

2.4 抗炎介质

炎症因子在软骨移植的作用机制尚未得知,但早有研究提到,在OCAs保存中炎症因子的表达会显著升高[27]。Ding等[30]实验证实,OCAs保存过程中软骨细胞死亡水平的上升可能导致基质降解及MMP-1,MMP-3,MMP-13等蛋白酶的上调,并提出可以在OCAs保存过程中添加抗炎介质,提高软骨细胞存活率。从结构上看,AC由ECM和软骨细胞组成,它们通过平衡MMP及其组织抑制剂(tissue inhibitors of MMP,TIMP)的产生来维持ECM的稳态。在软骨保存液中加入抗炎介质可能是增强软骨细胞活力的又一发展途径。

3 组织培养法的保存环境

3.1 温度

温度的选择一直是众多学者争论的话题,不同温度产生不同的OCAs保存效果。组织培养法保存OCAs常用温度主要为4 ℃、25 ℃和37 ℃,根据不同的保存方案选择不同的保存温度,可以延长软骨细胞活力,得到更好的长期保存效果。

4 ℃保存一直是组织库中OCAs的标准保存方法,具有微生物感染风险低、细胞代谢率低、保存成本低等优点[31]。de Sousa等[14]把人软骨组织保存在培养基中,分别存放在4 ℃和37 ℃环境中,14 d后发现37 ℃保存的软骨细胞死亡率是4 ℃保存的2倍。Harb等[32]实验同样证实,4 ℃保存比37 ℃保存有更好的软骨细胞存活率。但移植过程中,OCAs从保存温度向体温转变的代谢反应也可能是导致移植失败的机制之一,相比于37 ℃,在4℃长期保存并植入体内,细胞环境变化巨大,可能会对软骨细胞产生意料之外的损伤[33]。

膝关节运动时的生理温度大约为33 ～39 ℃,因此37 ℃保存OCAs对软骨组织的长期维护可能更适合[34]。有研究表明,4 ℃冷藏保存的OCAs,软骨细胞生存能力低于37 ℃保存,因此生理温度更有利于软骨细胞存活[7]。AC浅表层是软骨最敏感和脆弱的区域,早期软骨退化最明显,特别是浅表层软骨细胞的丧失,可能会导致临床移植失败[4]。有研究发现37 ℃保存OCAs不仅提高了软骨细胞活力和基质含量,而且保护了软骨浅表层细胞,因此37 ℃环境下保存OCAs可能会成为未来组织保存的优先选择[35]。然而,37 ℃环境下保存OCAs具有细胞代谢率高,营养需求多及细菌感染风险高等缺点。

Stoker等[10]认为4 ℃保存不利于软骨细胞生长,37 ℃保存可能会增加细菌和真菌的污染,25 ℃更有利于OCAs的保存,并以此开发了密苏里州同种异体骨软骨移植的保存系统(Missouri osteochondral allograft preservation system,MOPS)。MOPS保存方案与标准保存方案相比,保存时间明显延长,保存效果更好[10]。但是25 ℃保存OCAs研究较少,未知领域较多。

3.2 气体

外部环境对OCAs保存具有很大的影响,在不同的气体环境下,OCAs保存效果也有显著的差异性。相关研究报道了CO2、H2和O2在OCAs保存中的不同作用[7,36-37],为OCAs的保存环境提供更多的选择。

CO2在OCAs保存过程中是影响培养基pH的重要变量,5% CO2能将培养基的pH值维持在7.35～7.45之间,如果没有足够的CO2,会导致培养基酸碱失衡,从而影响软骨细胞活力[24,35]。Dontchos等[36]将牛的OCAs放入已添加DMEM培养基的圆底试管中,试管分别在大气环境或5% CO2环境中孵育20 min,密封后于4 ℃冷藏室保存。14 d后数据显示,OCAs预先在5% CO2中的平衡可使pH正常化,并降低浅表层软骨细胞的死亡率,而大气环境中预平衡,冷藏期间培养液pH升高,导致软骨细胞存活率降低。因此,添加CO2可能是减少保存期间软骨细胞死亡的有效选择[24,35-36]。

另一种有前途的保存OCAs软骨细胞活性的方法是在保存液中添加H2,这种气体具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的特性[38-39]。有实验研究证实,保存液中加入氢分子可以提高心脏、肾脏等器官或组织的体外保存效果,同时氢分子减轻冷藏期间同种异体移植物的缺血再灌注损伤,并改善早期移植的组织功能,提高移植后的细胞存活率[40]。Yamada等[37]采用富含氢的无血清培养基在4℃环境下保存大鼠的骨软骨移植物,21 d后数据显示,富含氢的培养基可以提高软骨细胞的活力。Han等[5]比较不加氢气的DMEM溶液,和分别添加氢气浓度为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L的DMEM溶液,4 ℃保存28 d,实验数据显示添加氢气的DMEM组软骨细胞存活率更高,其中氢浓度为0.8 mmol/L保存效果最好。因此,H2对离体组织培养具有保护作用,是保存OCAs的新选择。

O2是人体进行新陈代谢的关键物质,是人体生命活动的第一需要。Denbeigh等[7]在无血清的培养基中放入人的OCAs,然后分别保存在21% O2和2% O2的环境中,实验结果显示氧含量的变化没有显著影响软骨细胞的活力。在人体内OCAs缺乏血液供应,关节腔相对密闭,导致软骨细胞处于一个低氧环境,为了适应这种环境,软骨细胞产生了一系列的低氧相关分子[10]。有研究发现,关节腔O2微环境改变,是骨关节炎发生的关键环节,维持软骨下骨低氧微环境可有效延缓骨关节炎进展[41]。因此,O2浓度是否在OCAs体外保存时对软骨细胞产生影响,还需要进一步研究。

4 组织培养液的更换频率

合适的OCAs保存液更换频率可以维持保存过程中软骨细胞的活性,同时有利于降低组织库保存的成本及组织污染的概率。Stoker等[10]比较了保存期间7 d更换一次培养基和不更换培养基对软骨细胞存活率和ECM的影响,结果提示,培养基的更换没有对软骨细胞活力和ECM产生影响。然而,Qi等[31]发现2 d更换一次保存液,可以明显提高软骨细胞存活率。保存溶液的更换频率和OCAs的体积及保存液的容积密切相关,不同的移植物体积与培养液容积比,会产生不同的更换频率,但关于这一点目前还没有更进一步的研究。不同动物之间及动物和人类之间,软骨细胞需要的营养环境是否相同值得深思。在OCAs保存期间不更换保存液会降低细菌感染率,但可能会导致软骨细胞所需营养缺乏和代谢废物堆积,从而降低软骨细胞活性[31]。OCAs保存液合理更换是维持软骨细胞活力的重要因素。

5 浅表层软骨细胞在OCA中的重要性

OCA技术修复大型动物模型时,冷冻OCAs在移植术后6个月关节表面明显不规则,而新鲜OCAs表面平滑[42]。这种现象可能与软骨软化和浅表层细胞减少有关[43]。因此,软骨表面的健康状况可能是术后功能恢复的一个关键指标,在骨软骨组织新鲜保存过程中维持浅表层软骨细胞活力至关重要。此外,软骨浅表层还拥有抵抗关节腔内剪切应力和降低关节摩擦力的作用[44]。浅表层软骨细胞的丢失增加了退行性变的速度,相应的软骨基质蛋白的丢失也随之增加[29]。因此,体外保存时,保护浅表层软骨细胞的活性将有利于提高OCAs移植后的生存率,维持软骨的生理功能和机械性能的完整性。

6 总结与展望

OCAs保存液的研发可以延长保存期间软骨细胞活性,使其达到手术前移植的标准(存活率>70%)。目前,已有OCAs保存液进入临床或商业应用[45-49]。尽管该领域取得了一些研究进展,但尚不清楚软骨保存的最佳方案。而且,OCAs的最佳保存条件缺乏临床证据,需要进行更多的基础实验和临床转化研究分析如何保持软骨细胞的活性和软骨基质的完整性,增强OCAs的体外保存效果,提高OCA手术成功率[7,10]。

浅表层软骨细胞的存活与否,与移植软骨的整体细胞活力息息相关。有研究发现,浅表层的软骨细胞会分泌一种润滑素——蛋白多糖-4(proteoglycan 4,PRG4)来维持低摩擦的关节表面,该区域软骨细胞的死亡可能会在OCAs植入后产生有害影响[50-52]。软骨细胞活性存在区域差异,在保存时,与中层和深层相比,浅表层的软骨细胞最先发生死亡[13]。Ball等[18]也观察到类似的趋势,移植物的浅表层细胞活力在保存7 d时已经开始下降。考虑到浅表层具有抵抗剪切应力和分泌蛋白多糖-4将关节摩擦降至最低水平的作用,该区域软骨细胞丢失的影响不可低估[35,51]。因此,在OCAs保存过程中,软骨细胞浅表层区域损伤或退变后,其分泌的蛋白多糖-4减少,可能是导致OCAs移植失败的关键因素。目前已有研究发现,不同的温度、气体和保存液介质对浅表层软骨细胞的保存效果均有影响且各不相同[29,35-36],在未来,组织培养法保存OCAs应该从不同的方向,对软骨浅表层细胞的存活率及ECM的完整性进行研究,即从浅表层着手解决OCAs植入后软骨退化问题,增加其植入后的存活率,使同种异体骨软骨移植更广泛应用于临床。