宏基因组病原学测序在下呼吸道感染的诊断价值和应用进展

孙佳佳 王伟

下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)因其高发病率、重症率和死亡率,迄今仍是全球关注的重大卫生问题。准确及时地诊断出感染病原体,是有效治疗该类疾病的关键环节。现有众多微生物检测技术尚存各自短板,难以满足当前日益发展的临床病原学诊断需求。宏基因组下一代测序技术(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)是一种新型的病原学检测技术,以其广覆盖、高通量、无先验、无偏倚、精准快速等突出优势,被逐步推广应用于感染性疾病的病因诊断。本文拟对该技术在下呼吸道病原学诊断的临床应用和未来发展作一综述。

一、下呼吸道感染(LRTI)的流行病学和诊疗现状

LRTI通常指包括急性气管、支气管以及肺部的感染性炎症,影像学可呈渗出、实变影、脓肿、空洞甚至胸膜炎等多种表现,其致病病原体涵盖细菌、真菌、病毒、非典型病原体甚至寄生虫等多种微生物[1],目前仍是全球发病率和死亡率均高的疾病之一,尤其幼儿和老年患者,转为重症者屡不鲜见[2-3]。WHO报告2019年即有260万LRTI患者死亡,并警告该病已成为人类死亡的第四大病因[4]。

LRTI的防治形势之所以严峻,其关键原因在于许多患者的感染病原学诊断不明。呼吸道作为人体开放性器官,存在常态化微生物群,维持着复杂的微生态平衡[5],当机体免疫力下降、外感病原时,该平衡即易被打破而发生LRTI的一系列症候群和并发症,甚至转为重症或死亡。

沿用至今的经验性抗感染仍是LRTI的主要对因治疗,针对常见菌多能奏效,但在处理特殊、重症、难治或罕见病原体感染时,疗效常不理想;事实上,随着社会发展、人们生活习性改变、广谱抗菌药物的一些不当应用和免疫缺陷/异常患者数量的增多,近年来非普通病原体所致的LRTI发病率不降反升[6-7],使得精准的抗感染治疗成为亟待解决的关键环节。惟有尽可能快速、准确地检出LRTI的致病病原体,才有望突破诊疗困境,大幅提高患者治愈率和改善预后[8]。

二、下呼吸道感染(LRTI)的病原学检测现状

按技术原理和发展过程,目前LRTI的病原学检测方法主要分为传统的培养/涂片法和现代的血清学、分子生物学检测法。

培养/涂片法直观明确,简便经济,但总体而言,阳性检出率低[9];尤其对于部分苛/厌氧菌[10]、培养耗时长的分枝杆菌[11]和诸如放线菌等一些罕见疑难病原体,该方法均难以确诊[12],易导致临床误诊误治。

随着免疫学的发展和多种抗原抗体的发现,血清酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)通过结合抗原和测出抗体表达,已成为LRTI感染病原检测的重要手段[13]。然而,受感染窗口期、抗体存在时间以及个体免疫状态强弱的不同影响,ELISA也存在早期感染不易检出、无法判断是否现症感染、结果假阴性、漏检等可能。

分子生物学技术近年来发展迅猛,在各类病原学检测方面发挥了重要作用。不仅实时定量PCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction, q-PCR)现已应用广泛,数字PCR(Digital polymerase chain reaction, dPCR)、多重PCR微球探针(Luminex)、环介导恒温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification Technology, LAMP)[14]和核酸即时检测(point-of-care testing, POCT)[15]等各新型扩增方法也在不断更新。它们均具高灵敏度与特异性,扩增效率和仪器性能不断优化,系统操作十分便捷,部分甚至可在床旁即时得出结果。然而即便如此,上述这些新型方法仍需临床上的先验预判,故仍仅能检出数量有限的意向潜在病原体;同时,引物设计和产物分析的复杂繁琐,也增加了结果判读错误的几率[16]。

除以上技术之外,电脑自动化也促进了微生物检测平台的改进。比如:全自动微生物鉴定分析仪(VITEK-2) ,可通过编码转换为生物信息编码模式,由电脑程序自动扫描、读数,分析和报告鉴定病原及药敏[17],但该法仅限于检测细菌。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[12]可快速、简便地检测到活跃状态的病原微生物,但前提是需要该病原体已有明确蛋白谱。

综上可见,现有各类病原检测方法虽各有所长,但都无法克服一个共性化的弱点,即:它们都属于在临床预判背景下的“验证性检测”,病原学覆盖面有限,且无法检测未知的微生物[18]。这种固有的不足,削弱了它们的诊断效能,以致对复杂、少见、疑难的LRTI会有漏误诊之虞。

三、宏基因组下一代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)的概念及其在非呼吸道感染中的诊断应用

mNGS的概念是指通过样本采集、处理、核酸提取、文库构建、上机测序,生物信息分析等,一次性对表征样品中全部数千～数百万条DNA/RNA片段同时、独立地进行高通量随机测序的技术,它克服了Sanger测序(即荧光标记核苷酸碱基,产生不同长度核苷酸,电泳检测获得DNA碱基序列的方法)[19]只能对具有一致性或低多样性(单一或最多三种微生物)的样本进行靶向测序的局限性,无需临床预测,可快速、高效、准确地分析获取样品中的微生物和宿主遗传物质(DNA/RNA)信息。mNGS以其显著的广覆盖优势,能一次性识别病毒、细菌、真菌、寄生虫、甚至罕见或新发的大量各类病原体[20],从根本上弥补了以往检测手段的不足。2014年,《新英格兰杂志》报道了首例mNGS诊断了一例各种传统检测手段均无法确诊的神经系统钩端螺旋体病例[21],自此mNGS开始应用于临床并逐步展现出对感染性疾病的诊断潜能。Ren等回顾性统计了2015～2019年确诊的193名脓毒血症患者和他们的305份、含血液、BALF和脑脊液各类标本的病原学检测资料,结果发现,对比传统检测法,mNGS的诊断阳性率明显提高。其中,鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的最佳诊断reads数分别达2893、1825.5和892.5,因此认为mNGS能够更敏感地识别脓毒症患者标本中的多种病原体,而微生物的reads读数可能有助于鉴别疑似和确诊病原体[22]。复发性尿路感染(Recurrent Urinary Tract Infection,RUTI)是影响肾移植患者预后的关键因素之一,Duan等研究19例RUTI的肾移植受者尿液的mNGS和传统培养,比较结果提示:mNGS在总阳性率(100.0%vs31.6%;P<0.01)和细菌鉴定率(89.5%vs31.6%,P<0.01)、病毒鉴定率(57.9%vs0;P<0.01)及真菌鉴定率(42.1%vs0;P<0.01)方面,均显著高于培养法;且更容易发现混合感染(89.5%vs10.5%;P<0.01),该研究中14例患者因mNGS指导,调整了抗感染方案,病情得到缓解[23],故认为mNGS具有更高的病因诊断价值。人工关节感染(Prosthetic Joint Infections,PJI)是全关节置换术后的常见严重并发症,早期确诊病原诊断至关重要。Jun Tan等[24]对纳入955名PJI患者的380项已发表研究进行Meta分析,发现mNGS对PJI的综合诊断敏感性和特异性分别为0.93(95%CI, 0.83～0.97)和0.95(95%CI, 0.92～0.97),阳性、阴性似然比分别为18.3(95%CI, 10.9～30.6)和0.07(95%CI, 0.03至0.18),曲线下面积为0.96(95%CI, 0.93至0.97),得出结论:mNGS对PJI的诊断具有高准确性,尤其适用于感染标本培养阴性的患者。上述报道均展示了mNGS在病原微生物诊断鉴定领域的显著优势。

四、mNGS技术在下呼吸道感染(LRTI)诊断中的应用

细菌是LRTI中最常见病原体,但传统培养法阳性率并不理想,mNGS的出现,有望突破培养困难的藩篱[25]。2018年Langelier等运用mNGS成功在26例LRTI患者中检测出全部38种致病病原体以及升高10倍以上的气道微生物,以此为导向的针对性抗感染使得患者迅速改善,治疗时间和费用明显降低[26]。2019年上海瑞金医院发表了13位免疫缺陷的难治性重症社区获得性肺炎(Treatment resistant severe community acquired pneumonia, TR-sCAP)患者的致病微生物结果,其中传统法检出6例(4例细菌、1例真菌和1例病毒),而配对的mNGS法检出了12例(4例细菌、7例真菌和1例病毒),故认为mNGS在此类重症机会性感染有明显诊断优势[25]。

病毒也是LRTI中常见的病原种类[27],且易引发公共卫生事件。以免疫学和PCR检测为主的检测技术诊断效能有限,而mNGS广覆盖的检测却可提升病毒检出率。Langelier等[28]对22例LRTI住院患者支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)进行传统培养、多重PCR和 mNGS检测,结果表明:培养和PCR共检出7例患者的病原体;而mNGG却检出所有22位患者各自的病原微生物,包括在6例传统检测均为阴性患者样本中,检出了合胞、冠状、轮状等多种RNA病毒,以及人类疱疹、单纯疱疹、巨细胞、EB和人乳头瘤等多种DNA病毒,显著丰富了病原学信息,为制定综合抗感染治疗方案提供了强有力证据。对于广受全球关注的新型冠状病毒(new coronavirus disease 2019, COVID-19)肺炎,mNGS也发挥了独特的诊断作用,Wang[29]等应用mNGS对82例 COVID-19 患者进行测序,发现部分 HLA 等位基因可能与 COVID-19 的发生有关,表明mNGS还可对传染性强的流行性病毒感染进一步行基因型鉴定,从而为更新防控策略提供重要的实验依据。

对于下呼吸道的特殊感染,mNGS也展现出令人鼓舞的优势。Jin等人于2020年发表了一项mNGS诊断活动性结核病的研究,共纳入确诊结核病61例,临床诊断者64例。结果发现:mNGS的诊断敏感度为49.6%,特异度98.3%,高于培养法;同样在该研究中,mNGS也将诊断时间从2～6周缩短到了32～36小时[30]。下呼吸道真菌感染的涂片或培养检测,往往敏感度偏低[20],而真实世界中,也不难见到综合六胺银染色、1,3-β-D葡聚糖(Glucan, G)和半乳甘露聚糖(Galactomannan, GM)试验、以及影像学检查等方法仍无法确诊的LRT真菌感染,属于呼吸科临床难题之一,而mNGS的应用为此提供了有效解决途径。Yang等人分析106例疑似肺部真菌感染的病例,发现与病理、G、GM试验等比较,mNGS特异性虽相似,但诊断敏感性显著提升(84.4%vs44.4%,P<0.05)[31]。 Shen等报道了1例经多种传统检测均未确诊的重症肺炎患者,最终通过BALF的mNGS确诊为罕见的马尔尼菲青霉菌感染,调整治疗后转危为安[32]。鹦鹉热衣原体(C.psittaci)是一种相对罕见人畜共患病原体,肺部感染表现各异,重症和死亡率高,传统病原检测多为假阴性,诊疗难度极大。Wu等对13例病初均需机械通气的重症肺炎患者行mNGS,均在48～72小时内明确检出鹦鹉热衣原体,调整治疗,最终11例完全康复,2名因并存耐多药铜绿假单胞菌感染死亡[33]。该研究提示mNGS有助于鹦鹉热肺炎的早期诊断和正确治疗,也丰富了sCAP的病因学认识。侯婕等报道了1例肺恙虫病感染患者,查外斐试验、血液、BALF培养均呈阴性,最终经由mNGS检出恙虫病东方体,仅予多西环素单药,4天后患者症状和感染指标即恢复正常[34]。

上述报道也不难发现,mNGS无偏倚、广覆盖的“宏”检测优势,在LRTI混合感染的诊断方面也极具价值[35],仍以上文瑞金医院研究为例,在13位免疫缺陷的难治性sCAP患者的病原检测中,mNGS还检出5例卡氏肺囊虫肺炎和1例烟曲霉菌感染,而此6例对应的传统检测法均为阴性结果[25]。

五、mNGS面临的挑战和应对措施

mNGS的高敏感和广覆盖优势虽多有体现,但它在真实世界中的应用也不免遇到挑战。mNGS的终极目的是确定责任病原体,但在报告中,我们常遇见检出病原体的序列数低和致病病原和背景病原难以区分鉴别的困难。现将此二者发生原因及可能的应对措施分述如下。

第一,mNGS报告中,检出病原体序列数低,可能原因如下:①标本采集于患者疾病早期/恢复期/抗感染药物暴露后,或仅为局灶性感染(病变部位少菌状态)等,使得标本病原体的载量低。②标本采样、保存、运输环节中病原微生物核酸破坏和降解[25]。③病原体核酸提取效率低,比如结核菌、真菌等胞壁硬、厚,破壁困难;而胞内微生物如衣原体、立克次体因体积微小,本身核酸提取困难。④DNA/RNA核酸文库构建不够完备,感染病原体仅能比对部分短序列。

为应对上述挑战,可能采取的措施有:①选取合适时机,如在已有症状但未用药时,进行标本采样,排除干扰因素,局灶性感染尽量在病灶内采样。②标本采样和后处理过程中保持无菌化。③通过“去宿主”方法,显著减少宿主核酸数量[36]来有效提升病原核酸获取率。④海量病原体的庞大基因组极易和人类基因组混淆,在尽量减少后者宿主干扰同时,也需不断扩大、优化病原体基因组的文库构建,以期更准确地明确责任病原。比如具有一次性获得兆(Mbyte, Mb)以上级别的长读长序列的三代mNGS,相比二代mNGS,即可大大减少拼接组装,更有益于获取优质的微生物序列[37]。

第二,mNGS报告中致病菌与背景菌的区分困难,是导致临床误诊的另一个原因。mNGS无偏倚、高敏感、广覆盖的特性也犹如“双刃剑”,也可能误将LRTI标本中的常态微生物、定植菌及环境中污染成分等,报为责任病原,造成假阳性误诊。因此,送检标本的来源和质控至关重要。理论上,血、痰液、胸腔积液、肺组织、BALF都可作为LRTI的mNGS标本,BALF有“液体肺活检”之称,被认为是LRTI患者标本的合适选择[38],但目前对于BALF,以及镜下针吸刷检(bronchial needle brushing, BB)和支气管肺活检(transbronchial lung biopsy, TBLB),这些标本哪种最为优选,尚无定论[39]。一般而言,采样越接近或位于病灶内部,诊断率将越高。随着径向支气管腔内超声(Radial Endobroncheal Ultrasonography, R-EBUS)和支气管镜导航技术的临床应用,临床上将更有望获得代表感染病变特征的LRTI标本。Feng等[40]分析2018～2019年疑似肺部感染的213例患者,经虚拟导航(virtual bronchoscope navigation system,VBN)获得BALF标本,比较mNGS与传统方法对肺外周感染的诊断价值。结果发现:在94.49%接受传统病原检测均为阴性结果的肺部感染患者中,其BALF的mNGS都检出了与疾病相关的微生物,mNGS的检测灵敏度明显高于传统法(88.30%vs25.73%,P<0.05),而特异度则相当(81.16%vs88.41%);mNGS同时也体现出了诊断混合感染的优势。该团队的另一项121例患者入组的前瞻性研究[41]中,R-EBUS引导取材TBLB标本的mNGS阳性检出率明显高于常规TBLB组 (78.7%vs60.0%,P<0.05) ,提示了导航定位下精准取材对确诊肺外周感染的价值。 Wang等[38]也开展了20例肺外周感染患者肺穿刺标本mNGS与传统病原检测的比较研究,结果提示:mNGS的敏感度和特异度在细菌和真菌中不尽相同(细菌:100% 和76.5%;真菌:57.1%和61.5%);mNGS阳性预测值(细菌:42.9%,真菌:44.4%),远低于阴性预测值(NPV)(细菌:100%,真菌:72.7%)。该研究表明肺感染性病变穿刺组织的mNGS在病原诊断速度和灵敏度方面较传统病理培养方法更具优势,当然,mNGS的结果解读需要综合分析。

六、mNGS诊断LRTI的小结及展望

综上所述,mNGS作为一种无需先验的高通量检测技术,因具有“宏”的优势,可快速敏感地识别LRTI的病原信息,指导对因治疗,扭转改善患者临床结局,降低医疗资源消耗。因其具有难以匹敌的优势,现已被认为是对LRTI病原诊断方法的有效补充[42]。但同时也应看到,mNGS对LRTI的诊断仍可能面临低序列数致病原和与背景菌区分困难的挑战,这表明该技术仍有待进一步优化。去宿主[36]、正向富集病原体[43]、联合靶向mNGS(t-mNGS)[44]有望成为解决方法。对于临床呼吸科医师而言,除了应熟知mNGS适应证、患者临床表现、感染学指标、传统病原检测结果和用药应答等各种信息,以期高效解读mNGS报告外,也应强化“优质取材”意识,尽可能借助各类导航定位技术,获取可能最大程度地代表疾病特征的标本。相信多方共进的策略,必将进一步提升mNGS的诊断价值,令更多LRTI患者获益,也有助于推动“微生物导向”[45]的精准医疗策略的临床实现。