肝素结合蛋白在脓毒症诊断中的研究进展

姜春如,张春媚,王 帅,赵忠岩

(吉林大学中日联谊医院 重症医学科,吉林 长春130033)

感染性疾病具有较高的发病率及死亡率,因其临床表现及相关诊断标准缺乏特异性[1],使得该类疾病的早期识别及评估工作被延误。在此过程中,中性粒细胞过度激活,宿主对感染的免疫反应失调,进而导致严重的器官功能障碍——即脓毒症的发生[2]。脓毒症是机体严重感染的结果,是医院中常见的死亡原因,然而大约20%～30%的严重脓毒症患者在入院时没有表现出器官功能障碍等典型临床体征,相反,在入院后的24 h内,患者病情逐渐恶化为严重脓毒症[3-4],因此脓毒症早期的诊断及治疗显得尤为重要。近期研究表明,肝素结合蛋白(heparin binding protein,HBP)可作为预测感染及脓毒症导致器官功能障碍的有力因子[5-7]。本文根据当前研究现状,对HBP分子结构、作用机制及其在脓毒症诊断中的研究进展等方面进行综述。

1 HBP分子结构及作用机制

1.1 HBP分子结构

HBP拥有221或222个氨基酸残基,被认为是丝氨酸蛋白酶家族中的一员,然而因催化3联体中的2个残基发生突变,使得HBP通常被认为缺乏丝氨酸蛋白酶活性。最初,HBP因其独特的抗菌活性而受到人们的关注,随后大量的研究表明HBP在炎症和感染中均发挥着重要作用。HBP41位上的组氨酸向丝氨酸突变的过程可影响其抗菌作用及与单核细胞结合的能力,同时HBP也可通过切割某些胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-1、IGFBP-2和IGFBP-4)来调节炎症反应及伤口愈合。HBP上有3个潜在的N端糖基化位点,N端糖基化的去除降低了脂多糖诱导单核细胞释放白细胞介素-6的能力,而这种N端糖基化的去除并未影响HBP的结构。构成HBP的16个碱基组成高阳离子区域,此阳离子区域被证明与配体结合及抗菌活性有关[8]。

1.2 HBP作用机制

1.2.1HBP的释放机制 HBP是炎症感染反应中的重要介导因子,在抗原、细胞因子、炎症因子等多种因素的刺激下,大部分于中性粒细胞(polymorphonuclear,PMN)的嗜苯蓝胺颗粒及分泌囊泡中释放[9]。通常情况下,HBP的释放是钙离子内流动员中性粒细胞脱颗粒的结果,此过程涉及p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen -activated protein kinase,p38 MAPK)和磷酸肌醇3激酶phosphoinositide 3-kinase,PI3K)[10-11],β2整合素作为中性粒细胞表面最重要的细胞间黏附分子之一,也参与此过程[12]。白三烯B4(LTB4)、M蛋白、链溶血素O(SLO)等多种介质可刺激HBP的释放,白三烯B4与白三烯B4受体1(leukotriene B4 receptors 1,BLT1)结合,触发PI3K途径,进而释放HBP[13]。链球菌M蛋白与纤维蛋白原和β2整合素结合形成复合物,刺激中性粒细胞激活和脱颗粒,促进HBP释放[14]。金黄色葡萄球菌毒力因子-酚溶性调节蛋白α4(phenol-soluble modulin α4,PSMα4)可与甲酰基肽受体2(ormyl peptide receptor 2,FPR2)结合,激活PI3K途径,使得中性粒细胞脱颗粒,HBP释放[10]。中性粒细胞对不同的细菌刺激反应不同,有研究表明,与链球菌相比,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和脂多糖均为较差的诱导剂[15]。以上研究结果均基于HBP只由中性粒细胞释放的假设,最近一项研究发现,恶性髓系细胞和单核细胞也可能是HBP的来源,且HBP主要分布在肝脏的肝细胞中,仅少量分布于脾脏的单核/巨噬细胞中[16]。综上所述,HBP作为一种有前途的提示脓毒症发展和严重程度的生物标志物,其释放机制较为复杂,需进一步研究阐明,以便于其在临床中应用。

1.2.2HBP的趋化作用 炎症、感染导致的机体免疫应答,以早期中性粒细胞的聚集及随之而来的单核细胞募集为特点。HBP作为单核细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞的趋化剂,将更多的白细胞带到感染部位,因此来增强机体免疫反应[17]。HBP交替的疏水和亲水结构域,疏水延伸与脂质双分子层的结合,使得HBP对细胞膜具有较好的亲和力并具有较强的白细胞趋化作用。HBP可直接激活单核细胞上的C-C基因趋化因子受体2(CCR2)来激活介导单核细胞的招募[18],也可通过激活内皮细胞FAK/PI3K/AKT通路和p38 MAPK/NF-κB轴,来促进CCR2 配体单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的分泌,进而诱导单核细胞迁移[19]。HBP的趋化作用也体现在其他类型的细胞中,如成纤维细胞、角膜上皮细胞及平滑肌细胞的迁移和增殖。

1.2.3HBP影响血管内皮通透性 HBP是具有促炎特性和诱导血管高通透性能力的中性粒细胞来源的颗粒蛋白。尤其在提高血管内皮通透性方面发挥着重要作用。HBP可诱导内皮细胞上细胞间黏附分子1(ICAM1)、血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM-1)、整合素α3和整合素β1的表达,促进中性粒细胞黏附于内皮细胞表面[20],该过程启动了β2整合素信号通路,HBP从中性粒细胞中释放,释放出来的HBP与内皮细胞上的糖胺聚糖结合,激活蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶,诱导钙离子内流入细胞,使得细胞骨架结构改变,细胞间隙生成,最终导致血管内皮细胞通透性增加[21-22]。上述过程可认为是通过旁分泌的方式刺激内皮细胞屏障开放,然而最近的一项研究更为详细的阐述了这一信号通路中涉及的作用机制。该研究指出[23],HBP可干扰激肽原(HK)与内皮细胞上的糖胺聚糖结合,并与中性粒细胞蛋白酶协同使其裂解为活性非肽缓激肽(BK),即通过激活激肽激酶-激肽系统来增强血管内皮细胞通透性。血管内皮细胞通透性改变诱发的血管渗漏、血浆渗出是最终导致脓毒症休克发生的罪魁祸首,HBP作为该过程中的重要媒介可能是降低血管高通透性治疗的一个有趣靶点。

2 HBP在脓毒症诊断中的研究进展

因血管通透性的增加,进而导致的低血压、微循环紊乱、缺氧和器官功能障碍是严重脓毒症的主要特征,也是最终导致患者死亡的主要原因。HBP具备的促炎作用及诱导血管渗漏的能力,使其在脓毒症诊断及预后评估中具有较好的潜力[24]。最近一项包含371名急诊入院患者的多中心横断面研究结果显示[25],入院第一小时内的血浆HBP大于19.8 ng/mL时,其诊断脓毒症的敏感性、特异性分别为66.3%、44.9%,对早期死亡预测的敏感性、特异性分别为100%、41.0%,这与LINDER等[26]的研究结果相近。作为脓毒症生物标志物的HBP在脓毒症早期即持续升高,且不易受采样时间的影响,既往一系列研究[27-28]表明血浆HBP与30 d死亡率相关,DOU等[5]将血浆HBP采集时间细化,发现48 h HBP变化(HBPc-48 h)对脓毒症患者30 d死亡率预测价值的AUC为0.82(95% CI 0.75～0.89),其次分别为入院HBP(0.79)、PCT(0.72)、乳酸(0.71)、CRP(0.65)和24 h HBP变化(0.62),提示HBPc-48 h在预测脓毒症患者死亡率方面最为准确,48 h HBP下降大于50%的患者有超过90%的生存机会,而48 h HBP下降小于4%的患者30 d全因死亡率接近90%。不仅如此HBP在严重脓毒症、脓毒症休克中也被证明具有良好的诊断及鉴别特性。YANG等[29]的研究表明,脓毒症休克组HBP显著高于脓毒症组(120.33±43.49 μg/L vs.68.95±54.15 μg/L,P<0.05),SOFA评分预测脓毒性休克的AUC为0.715(95%CI 0.540～0.890,P=0.012),当最佳截止值为7.5时,敏感性为64.3%,特异性为76.6%。HBP的AUC为0.814(95%CI 0.714～0.913,P<0.001),当最佳截止值为89.43 μg/L时,敏感性为78.6%,特异性为76.6%;当两者结合时,AUC为0.829(95%CI 0.724～0.935,P<0.001),敏感性为92.9%,特异性为61.9%。目前尚少有研究调查结合临床评分系统和HBP在预测脓毒症死亡率方面的价值,此种预测模型有望成为临床工作中的有益工具,但在广泛应用之前尚需在不同患者群体中进一步验证。

2.1 HBP在脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)诊断中的研究进展

大部分严重脓毒症患者可同时伴有呼吸衰竭、心血管功能障碍、肾功能恶化等器官功能障碍的表现[30]。急性肺损伤(ALI)/ARDS是ICU中发生急性呼吸衰竭危及患者生命的常见原因。以全身性炎症,内皮和肺泡上皮屏障破坏,微血管通透性增加,最终导致肺水肿和呼吸衰竭为特征,目前已有大量临床研究聚焦于HBP与ARDS之间的联系,HBP因其增强内皮通透性的特点被认为是脓毒症诱导的急性肺损伤的潜在中介因子。LIN等[28]研究结果表明,ALI/ARDS患者的HBP中位水平明显高于心源性肺水肿(CPE)患者[17.15(11.95～ 24.07)ng/mL vs.9.50(7.98～12.18) ng/mL,P<0.001]。HBP最终将ALI/ARDS从CPE中鉴别诊断出来AUC为0.815±0.040。在截断点>11.55 ng/ml时,HBP诊断ALI/ARDS的特异性为78.2%,敏感性为75.0%。其中ALI/ARDS组分为感染组和非感染组,感染组又分为无脓毒症组(除外全身炎症反应综合征的感染)、严重脓毒症组和脓毒症休克组。严重脓毒症组患者的HBP水平明显高于无脓毒症感染组患者[18.14(11.79 ～ 22.95)ng/ml vs.9.56(6.34～12.92) ng/ml,P=0.015]。然而,严重脓毒症组和脓毒症休克组患者的HBP水平差异无统计学意义[27.12(16.03～36.01)ng/ml vs.18.14(11.79 ～ 22.95) ng/ml,P=0.090]此外,该研究发现脓毒症休克和非脓毒症休克患者的HBP水平无显著差异[27.12(16.03 ～ 36.01)ng/ml vs.21.07(11.98 ～ 31.54) ng/ml,P=0.7]。即无论是否患有脓毒症,休克患者的HBP水平显著升高。在ARDS中HBP释放导致内皮细胞通透性被改变的确切机制尚不清楚。有研究表明[31]血管高通透性与β2整合素有关,β2整合素可促进中性粒细胞激活、脱颗粒,进而促进HBP的释放,LIU等[12]深入研究发现,HBP和β2整合素在肺血管通透性中都起重要作用,外源性炎症可通过β2整合素来激活中性粒细胞,进而介导PI3K信号通路促使HBP释放,最终诱发肺水肿。肝素和抗HBP抗体都可以阻断中性粒细胞上的β2-整合素受体,抑制HBP的释放,从而减轻肺水肿及肺损伤[22];静脉注射β2整合素亚基CD18抗体(IB4)可抑制中性粒细胞的募集、黏附及向组织的迁移[32];一种干扰纤维蛋白原和β2整合素相互作用的肽(Gly-Pro-Arg-Pro),可抑制链球菌表面M蛋白对中性粒细胞的激活[14]。近年来,HBP对血管通透性的影响及其诱导ARDS的作用机制一直是研究热点,HBP在脓毒症并发ALI中的效应可通过加剧氧化应激、促进巨噬细胞M1极化释放促炎因子,激活NF-κB信号通路来实现[33],HBP作为配体亦可与转化生长因子-β受体2(TGF-β-R2)结合,通过激活TGF-α/SMAD2/3信号通路来诱导急性肺损伤和血管渗漏[34]。

2.2 HBP在脓毒症并发循环衰竭诊断中的研究进展

HBP显著增加血管通透性的特性,被认为是预测严重脓毒症及脓毒症休克患者循环衰竭的早期生物标志物[35]。一项关于脓毒症休克期间血浆HBP的动力学研究[36]中,通过每4 h分析连续采集的患者血浆HBP水平、去甲肾上腺素速率、全身血管阻力指数(SVRI)、平均动脉压(持续72 h或直至死亡或ICU出院)发现,随着时间的推移,血浆HBP浓度与循环系统功能障碍严重程度相关。此外,该研究还发现随着患者血浆HBP水平的增高,SVRI反而减小,进一步证实HBP通过调节细胞结构、间隙,使得血管内皮细胞通透性增加,最终导致循环系统功能障碍甚至循环衰竭的理论。

2.3 HBP在脓毒症并发AKI诊断中的研究进展

脓毒症病情发展导致的多器官系统功能障碍是AKI发生的重要原因之一,因此对脓毒症相关AKI的早期诊断及治疗尤为重要。HBP可改变肾小管管周细胞结构间隙使得毛细血管发生渗漏,也可诱导肾小管上皮细胞发生炎症反应,该过程可能与HBP激活M1巨噬细胞,抑制肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素-6(IL-6)的分泌有关,是脓毒症诱导AKI发生的关键所在[37]。一项包含245名ICU住院患者(包括59名严重脓毒症患者)血浆HBP水平的纵向观察研究表明,入院时的血浆HBP浓度与严重肾损伤的发展相关[38]。黄亚军等[39]对脓毒症诱导AKI患者的血浆HBP水平进行动态监测,多次采集检测不同时间点的血浆HBP水平,发现在脓毒症诊断后12 h时,血浆HBP水平对脓毒症诱导AKI的诊断性能最好。HBP肾脏清除率较低,但在肾功能受损时HBP的肾脏清除率却明显增加,肝素可阻断HBP诱导的内皮细胞通透性增加和肾小管细胞炎症反应[40],进而降低肾损伤严重程度,该过程可能与限制早期巨噬细胞的浸润或活化有关。此外,临床相关浓度的白蛋白(ALB)也可阻断凝血酶和HBP诱导的内皮细胞通透性增加,但却可能增加肾脏炎性反应风险,HBP和白蛋白之间的比率可预测脓毒症患者发生AKI的风险(HBP>30 ng/mL,HBP/ALB>3.05)[41]。

3 总结

HBP在中性粒细胞刺激后通过多种机制快速释放,HBP较强大的促炎特性和诱导血管高通透性能力,使其在检测感染性疾病,特别是在导致脓毒症的细菌感染中具有良好的诊断和鉴别特性,HBP作为一种新型生物标志物,可能为治疗脓毒症及其相关并发症提供新的靶点,然而其介导炎症反应的具体作用机制以及相关临床应用的研究仍有较多空缺,需研究者进一步探索阐明,推动HBP在临床中更为广泛的应用。