miR-338-3p通过靶向PPM1B促进口腔癌细胞凋亡

赵东强,陈 乐,李萌萌,杨 兵

(1.天津市泰达医院 口腔科,天津300450;2.天津医科大学第二医院 口腔科,天津300211;3.天津市第一中心医院 口腔科,天津300192;4.天津市海河医院 口腔科,天津300350)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)发病率呈上升趋势,尤其是年轻的患者[1-3]。手术和放化疗是OSCC的主要治疗方法,但化疗在OSCC的治疗中起着重要作用[4]。尽管临床方法有所进步,但OSCC的5年生存率仍然很低。MiRNAs是一组小的非编码RNA,通过结合靶基因的3′-非翻译区(UTR)也表现为基因表达的调控因子,已被发现在癌症的细胞增殖和凋亡中发挥重要作用[5-6]。此外,越来越多的证据表明,miRNAs在细胞发育中发挥关键作用,如细胞生长和增殖,并参与包括OSCC在内的癌症进展[7-9]。证据也表明,miR-338-3p可抑制多种癌细胞的生物学功能[10]。蛋白磷酸酶 1B(protein phosphatase 1B,PPM1B)是金属依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族的成员,在细胞信号通路中具有重要的调控功能,PPM1B作为一个潜在的致癌基因也被证明通过负调控坏死细胞死亡来防止细胞死亡[11]。本实验中,通过生物信息学软件Target scan网站的预测和荧光素酶报告基因分析的验证,探讨OSCC中miR-338-3p与PPM1B的相互作用,报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

HGF与TSCCA,CAL-27,Tb3.1细胞均购自中科院上海细胞库;胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清、Annexin V-FITC-PI 试剂盒、MTT溶液、BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天试剂有限公司);双荧光素酶报告检测试剂盒(Promega公司);miR-338-3p过表达物、PPM1B过表达物、PPM1B小干涉RNA(上海吉玛基因公司);脂质体2000试剂、TRIzolTM溶液、DMSO、逆转录试剂盒、RIPA裂解缓、ECL发光液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国赛默飞公司);兔抗剪切半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和兔抗Bcl-2相关X蛋白(Bax)、兔抗蛋白磷酸酶1B蛋白(PPM1B)、HRP偶联的山羊抗兔IgG二抗(上海艾博抗公司)。

1.2 病理标本

2020年3月至2021年3月,20例OSCC患者(男性10例;女性10例;平均年龄:55.05±9.65岁)手术后OSCC及相应的邻近正常组织,入组患者术前均未接受过化疗或放疗。入组患者的病理分期由两名以上的副高级病理学医生共同复查和确认。OSCC组织与邻近正常组织收集后立即保存在液氮中备用。本研究经医院伦理委员会审核批准,所有参与者均签署知情同意书。

1.3 细胞分组和转染

HGF与TSCCA,CAL-27,Tb3.1细胞放入含10%胎牛血清DMEM培养基中,培养条件为37°C,5% CO2。培养基每2 d更换一次。将对数生长过程中的OSCC细胞接种于6孔板中。当细胞达到30%～50%时,根据脂质体2000试剂说明书,转染培养细胞,对miR-338-3p进行过表达,分为阴性对照组(NC组)、miR-338-3p模拟组(mimics-miR-338-3p组),对PPM1B进行过表达,分为阴性对照组(NC组)、PPM1B模拟组(转染PPM1B模拟组),对PPM1B进行敲除,分为阴性对照组(NC组)、PPM1B小干涉RNA组(si-PPM1B组),各组转染步骤严格按照说明书进行。

1.4 逆转录定量聚合酶链反应法检测miR-338-3p与PPM1B mRNA的表达量

各组织和细胞中加入Trizol试剂按照试剂说明书提取总RNA。RNA被溶解在含有二乙基焦碳酸酯(DEPC)的超纯水中。使用紫外分光光度计评价样品的光密度OD(260 nm)/OD(280 nm)的比值,并对总RNA进行浓度测定和质量鉴定。使用逆转录试剂盒合成cDNA,用于后续的PCR反应。U6作为miR-338-3p的内对照,使用以下引物:miR-338-3p(正向,5’-ATCCAGTGCGTGTCGTGG-3’;反向,5’-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3’);U6(正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向,5’-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3’)。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量,实验重复3次。

1.5 双荧光素酶报告基因分析miR-338-3p和PPM1B潜在的靶向关系

将TSCCA细胞在含有10 %胎牛血清的DMEM培养基中培养,培养条件为5% CO2,37℃。将miR-338-3p在PPM1B上的野生型(WT)与匹配的突变体(Mut)对接位点克隆到pGL3-basic载体中。将PPM1B-WT或PPM1B-Mut与miR-338-3p模拟物其相应的对照共转染到TSCCA细胞中。转染24 h后,使用双荧光素酶报告检测试剂盒按照制造商的协议测定TSCCA细胞的萤火虫荧光素酶活性和海肾素荧光素酶活性,相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾素荧光素酶活性值,实验重复3次。

1.6 Western blot法检测PPM1B与凋亡相关蛋白Bax和Claved-caspase 3、Bcl-2的表达

转染48 h后,用胰蛋白酶从培养表面分离,PBS洗涤3次,收集,加入细胞裂解液。然后提取总蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,煮沸至变性。制备了10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)用于蛋白质分离。然后,用湿法转移法将蛋白质转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜2 h,用Tris-HCl缓冲盐水洗涤3次(TBS,10 min/次)。将膜加入初级兔抗人单克隆抗体:PPM1B(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Claved-caspase 3(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、FASL(ABP51328);然后用HRP标记的山羊抗兔IgG(稀释1∶5 000)在室温下培养2 h。用增强化学发光溶液检测膜上的蛋白带。以目标蛋白条带与内对照条带的灰度值比值为相对蛋白表达量,每个实验重复3次。

1.7 MTT法测定细胞增殖率

转染后生长良好的细胞被分离以获得单细胞悬液。将细胞接种到96孔板上,每组设置5个重复孔。调整细胞浓度至1×104细胞/孔,加入培养基。分别转染细胞24 h、48 h和72 h后更新培养基,每孔加入20 μL MTT溶液。再孵育4 h后,弃用上清液,每孔加入100 μL甲瓒溶液。每孔用酶标仪在492 nm波长处测定OD值,每个实验重复3次。

1.8 采用Transwell法检测细胞的迁移能力

转染后,将TSCCA细胞(1×105细胞/孔)重悬于无胎牛血清的培养基中,接种于上孔板,下室加入500 μL含有10 %胎牛血清的培养基,然后将细胞培养在含有5%的CO2的培养箱中继续培养24 h。用4%多聚甲醛在37℃下固定细胞30 min。轻轻去除滤膜上表面的剩余细胞,膜下表面的细胞用0.1%结晶紫染色10 min。用荧光显微镜在5个随机视野中观察并拍摄细胞。每个实验重复3次。

1.9 采用流式细胞术检测细胞凋亡率

收集各组细胞,用PBS洗涤细胞2次,用15 μL AnnexinV-FITC染色缓冲液在4℃下避光染色15 min,然后加入10 μL PI染色液染色10 min,混合均匀。1 h内,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,实验进行3次。

1.10 免疫组化法检测OSCC组织与正常组织PPM1B蛋白相对表达量

将组织固定、石蜡包埋、切片。切片脱蜡,再水化,然后在柠檬酸盐缓冲液中孵育20 min获得抗原修复。随后将组织用3%H2O2培养15 min,从而阻断内源性过氧化物酶活性。此后,组织切片与兔抗PPM1B抗体(1∶200)在4℃下培养过夜。随后,切片用PBS洗涤,用HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)在室温下孵育10 min,并用DAB显影。用1%苏木精对细胞核进行二次染色,以胞质染色呈棕褐色为阳性并使用光学显微镜拍照。免疫反应(IRS)评分:由2位病理学专家评分;染色强度0～3分:依次为阴性、浅黄色、浅褐色、深褐色;阳性范围0～4分:依次为0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。免疫反应评分=染色强度评分×阳性范围。实验重复进行3次。

1.11 统计分析

2 结果

2.1 miR-338-3p与PPM1B在OSCC组织中表达

结果显示,与相邻的正常组织样本相比,OSCC组织中miR-338-3p的表达显著降低(图1A,P<0.05),而PPM1B mRNA表达上调(图1B和1C,P<0.05),见图1。

2.2 OSCC细胞中miR-338-3p与PPM1B的表达量

与对照细胞HGF相比,OSCC细胞系TSCCA,CAL-27,Tb3.1中miR-338-3p mRNA表达均下降(图2A,P<0.05),PPM1B mRNA与蛋白表达均增加(图2B和2C),证明miR-338-3p 在TSCCA细胞中较HGF细胞与其他两株OSCC细胞表达最少,PPM1B表达最多,因而选择了TSCCA细胞作为OSCC的细胞实验研究对象。

图2 HGF与OSCC细胞株中miR-338-3p与PPM1B的mRNA表达量(*P<0.05)

2.3 miR-338-3p调节TSCCA 细胞增殖、凋亡和迁移

与对照组相比,mimics-miR-338-3p组细胞增殖显著增强(图3A,P<0.01)。Western blot检测显示,过表达miR-338-3p可以促进Bax和Claved-caspase 3并抑制PPM1B、Bcl-2的表达(图3C和3D,P<0.05)。与对照组相比,mimics-miR-338-3p组显著抑制细胞迁移,而si-miR-338-3p组显著促进细胞迁移(图3B,P<0.05)。

图3 miR-338-3p对TSCCA细胞增殖、凋亡和迁移的影响(*P<0.05)

2.4 miR-338-3p和PPM1B有潜在的靶向关系

Target scan的生物信息学数据库(网址www.targetscan.org/vert_72/)预测出PPM1B可能是miR-338-3p的靶基因(图4A)。为了进一步证实PPM1B是miR-338-3p的靶基因,结果发现,miR-338-3p和PPM1B-Wt共转染组的荧光素酶活性低于NC组(图4B,P<0.05),而PPM1B-Mut的荧光素酶活性差异无统计学意义(图4B,P>0.05)。

图4 miR-338-3p和PPM1B结合位点(*P<0.05)

2.5 miR-338-3p通过PPM1B调节TSCCA细胞增殖、凋亡和迁移

与对照组相比,转染PPM1B小干涉RNA后,si-PPM1B组显著抑制细胞增殖(图5A,P<0.05);si-PPM1B组显著增强细胞凋亡率(图5C)。与对照组相比,si-PPM1B组显著抑制细胞迁移(图5B,P<0.05)。与单独过表达miR-338-3p组相比,同时过表达miR-338-3p与PPM1B后,部分逆转了miR-338-3p对OSCC细胞增殖(图6A,P<0.05)、迁移(图6B,P<0.05)、凋亡(图6C)作用。

图5 下调PPM1B后对TSCCA细胞增殖、凋亡和迁移的影响(*P<0.05)

图6 miR-338-3p通过PPM1B调节TSCCA细胞增殖、迁移和凋亡(*P<0.05)

3 讨论

在过去的20年里,手术技术和化疗-放疗方案已经取得的进展,然而OSCC的生存率并没有明显下降[12]。先前的研究表明,miRNAs可以在肿瘤发生中发挥“抑癌基因”或“致癌基因”的功能,并在OSCC进展中调节多个细胞过程[13-15]。本研究的目的是弄清楚miR-338-3p影响OSCC细胞生物学功能的机制。据报道,miR-338-3p参与了各种类型癌症的进展和发展。miR-338-3p被认为在肿瘤抑制中发挥重要作用,其在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的低表达已被证实[16];miR-338-3p的失调可作为上皮性卵巢癌的预后生物标志物[17];同时,miR-338-3p通过下调Wnt家族成员2B(WNT2B)增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[18]。然而,miR-338-3在OSCC中的细胞功能及其分子机制尚不清楚。本研究评估了miR-338-3p在OSCC细胞中的功能以及miR-338-3p与PPM1B之间的相互作用。结果表明,miR-338-3p在OSCC组织中的表达显著下调。在OSCC中,miR-338-3p可能作为一种肿瘤抑制因子,通过靶向抑制OSCC的进展。当过表达miR-338-3p可抑制OSCC细胞增殖与迁移并诱导细胞凋亡。Western blot检测显示,过表达miR-338-3p可以促进Bax和Claved-caspase 3并抑制PPM1B、Bcl-2的表达,这些结果提示,miR-338-3p可能作为肿瘤抑制因子,参与了OSCC的进展。

生物信息学研究显示,PPM1B的高表达与骨肉瘤的复发呈正相关[19]。PPM1B可能通过调节TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的磷酸化水平参与肾癌的进展[20]。同时,PPM1B在胃癌和结直肠癌中发挥关键作用[21-22]。本研究检测了PPM1B在OSCC中的表达,发现OSCC组织和细胞株中PPM1B蛋白的表达水平明显高于邻近的正常组织和HGF细胞。并通过体外实验进一步检测了PPM1B对OSCC细胞的影响,用PPM1B小干涉RNA处理的TSCCA细胞中,观察到细胞增殖、细胞迁移能力变弱减少,细胞凋亡率增加。生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因检测进一步证实了PPM1B是miR-338-3p的靶基因。由于miR-338-3p与PPM1B具有靶向关系,miR-338-3p能够调节TSCCA细胞的生物学行为,故而通过下调PPM1B表达验证其对TSCCA细胞的生物学行为影响。在本研究中,转染PPM1B小干涉RNA后,与对照组相比,si-PPM1B组显著抑制细胞增殖和迁移并诱导细胞凋亡。与单独过表达miR-338-3p组相比,当同时过表达miR-338-3p与PPM1B后,PPM1B部分逆转了miR-338-3p对OSCC细胞增殖、凋亡、迁移作用。

综上所述,与邻近正常组织样本相比,OSCC组织中miR-338-3p的表达显著降低,而PPM1B的表达显著增加。PPM1B是miR-338-3p的直接靶基因。过表达miR-338-3p可抑制OSCC细胞的增殖和迁移,并诱导细胞凋亡。这些结果表明,miR-338-3p可能通过直接靶向PPM1B来调控OSCC的进展。