基于脊髓背角自噬与凋亡探讨推拿对神经病理性疼痛大鼠的作用机制

陈玲女,卢栋明,王天翊,郑玉娇,梁英业,杨 鹏,唐宏亮,庞 军

(1. 广西中医药大学,广西 南宁 530001;2. 广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;3. 防城港市中医医院,广西 防城港 538000)

神经病理性疼痛是慢性疼痛常见原因之一,表现为自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛等。据统计,2020年全球神经病理性疼痛患病率高达10%[1]。该病发病率高,病理机制复杂,且常合并失眠、抑郁和焦虑等情感障碍,严重影响患者的健康[2-3]。神经损伤和炎症是神经病理性疼痛多种生理和病理过程的基础,会导致神经元兴奋性增强,诱发疼痛形成[4]。炎症在脊髓背角激活是神经病理性疼痛形成的关键,如何控制炎症对神经病理性疼痛的影响是当下研究的热点。近年研究表明,脊髓背角自噬与凋亡均参与了神经病理性疼痛的发生发展,并与炎症密切相关,促进脊髓背角细胞自噬,可以减少促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的释放,并能抑制细胞凋亡[5];促进抗凋亡因子Bcl-2的表达可降低Caspase-3水平,在抑制凋亡发生的同时伴随着TNF-α的降低[6-7]。由此可见,促进自噬或抑制凋亡均可减轻炎症反应,缓解神经病理性疼痛,但二者之间存在相互拮抗、相互协同作用的关系[8],如何正确掌控二者的作用机制,明确二者在神经病理性疼痛中的内在联系,有助于深入了解神经病理性疼痛的发病机制和突破治疗上的困境。推拿治疗疼痛由来已久,可有效缓解疼痛,且无不良反应[9-10]。课题组前期研究表明,推拿能通过激活自噬,促进IL-1β的清除,减轻疼痛[11];还可以通过抑制大鼠神经元凋亡,缓解疼痛的发展[12]。本研究旨在通过观察推拿对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角自噬相关因子与凋亡相关因子表达的影响,进一步明确推拿对神经病理性疼痛自噬与凋亡的协同调控作用,明确推拿发挥抑炎镇痛作用的可能靶点。

1 实验材料与方法

1.1动物 健康SPF级雌性SD大鼠30只,体重250～300 g,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004,使用许可证号:SYXK(桂)2019-0001。动物饲养于SPF级别动物房,室内安静整洁,温度、光照和通风恒定适宜,垫料饲料饮用水正常供应,平均每4 d更换垫料1次,每天更换饮用水及饲料1次,适应性喂养7 d。本实验经广西中医药大学伦理委员会审核并批准(伦理号:DW20230302-021)。

1.2试剂与仪器 兔抗大鼠Beclin1、LC3、Bcl-2、Caspase-3和β-actin抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),TNF-α ELISA试剂盒(广西威诺科技有限公司),反转录试剂盒、SYB RGreen PCR荧光试剂(南京诺维赞生物科技有限公司)。按摩推拿手法模拟仪(中华人民共和国发明专利号:200710187403．1),von-Frey纤维丝(美国IITC公司),电泳仪(美国伯乐公司)。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养7 d后随机分为正常组、假手术组、模型组、推拿组、假推拿组,每组6只。模型组、推拿组和假推拿组参照文献[13]方法建立神经病理性疼痛模型:大鼠禁食12 h后按体重给予3%的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后固定,备皮消毒,沿着脊柱方向切开皮肤,分离筋膜肌肉,钳断L4～6脊椎左侧的横突,暴露L5脊神经,用可吸收性缝合线结扎。假手术组仅暴露L5脊神经不结扎,正常组不进行手术。术后第1天开始,推拿组用布袋束缚大鼠后,采用按摩推拿手法模拟仪(设置刺激强度为4N),以点、拨、揉方法依次刺激胆经上环跳、阳陵泉、悬钟穴共18 min(每侧9 min),1次/d,连续干预14 d;假推拿组用布袋束缚大鼠后,轻抚其后肢18 min(每侧9 min),1次/d,连续干预14 d;正常组、假手术组、模型组大鼠不进行干预,观察14 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1机械性刺激缩足阈值和热痛缩足反应潜伏期 术前及术后第1,3,7,14 d干预后,用von-Frey纤维丝按刺激强度由小至大垂直刺激大鼠左后足底心,每个强度重复刺激5次,间隔时间为3 s,5次中出现3次及以上的缩足或舔爪反应记为阳性,实验重复3次,取平均值作为最终的机械性刺激缩足阈值。于机械性刺激缩足阈值测定后适应1 h测定热痛缩足反应潜伏期,热板痛觉测试仪设为55 ℃,将大鼠放置于测试仪的封闭且透明玻璃盒内并启动计时器,当大鼠出现快速抬足、频繁舔足等现象时停止计时并做记录,每只共测定3次,每次间隔2 min,取平均值作为最终的热痛缩足反应潜伏期。

1.4.2血清TNF-α水平 术后第14天干预结束后,麻醉各组大鼠,采腹主动脉血,运用ELISA试剂盒检测血清TNF-α水平。

1.4.3脊髓组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况 取-80 ℃保存的各组大鼠L4～6脊髓背角组织,采用Western blot技术检测:采用BCA法蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,根据浓度用PBS稀释液进行配平,按比例加入蛋白上样缓冲液并充分混匀后100 ℃金属浴10 min;将胶板、配置好的电泳液放入电泳槽,垂直向上拔出梳子,加入3 μL Marker标记物后根据测定的蛋白浓度,每孔加入30 μg蛋白质,120 V恒压电泳,直到溴酚蓝跑到凝胶底部;将切好的电泳凝胶与PVDF膜对齐放入转膜槽中转膜,300 mA转60 min;室温封闭PVDF膜15 min,用1×TBST溶液洗涤3次,每次10 min,再放入稀释好的一抗溶液中4 ℃孵育过夜;洗涤3次后,将膜于二抗(HRP山羊抗兔IgG,1∶5 000)溶液中室温孵育1 h;均匀滴加ECL试剂后,显影仪扫描PVDF膜,并用Image J软件分析条带的光密度。参考目标蛋白条带的光密度值和内参(β-actin)计算出每个目标蛋白的相对表达量。

1.4.4脊髓组织中Beclin1、Bcl-2 mRNA表达情况 取-80 ℃保存的各组大鼠L4～6脊髓背角组织,采用RT-qPCR法检测:提取RNA并测定浓度和纯度,反转录成cDNA;以β-actin为内参,根据GenBank的基因序列设计引物(引物序列见表1),由捷尼斯生物科技有限公司合成并纯化。PCR扩增反应的总体积为20 μL,包括2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、Nuclease-Free Water 8.2 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL。反应条件:预变性95 ℃ 30 s,变性95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 30 s(40个循环),溶解曲线95 ℃ 15 s、65 ℃ 1 min、97 ℃。采用2-ΔΔCT法计算Beclin1、Bcl-2 mRNA的相对表达量。

表1 目的基因引物序列

2 结 果

2.1各组大鼠机械性刺激缩足阈值和热痛缩足反应潜伏期比较 术前各组大鼠机械性刺激缩足阈值和热痛缩足反应潜伏期比较差异均无统计学意义(P均>0.05);术后第1天、第3天,模型组、推拿组、假推拿组大鼠机械性刺激缩足阈值均明显低于同期正常组、假手术组(P均<0.05),热痛缩足反应潜伏期均明显短于同期正常组、假手术组(P均<0.05),模型组、推拿组、假推拿组之间机械性刺激缩足阈值和热痛缩足反应潜伏期比较差异均无统计学意义(P均>0.05);术后第7天、第14天,推拿组大鼠机械性刺激缩足阈值均明显高于同期模型组和假推拿组(P均<0.05),热痛缩足反应潜伏期均明显长于同期模型组和假推拿组(P均<0.05)。见图1。

图1 正常组、假手术组和神经病理性疼痛各组大鼠机械性刺激缩足阈值和热痛缩足反应潜伏期

2.2各组大鼠血清TNF-α水平比较 模型组和假推拿组血清TNF-α水平均明显高于正常组和假手术组(P均<0.05);推拿组血清TNF-α水平明显低于模型组和假推拿组(P均<0.05),假推拿组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 正常组、假手术组和神经病理性疼痛各组大鼠血清 TNF-α水平

2.3各组大鼠脊髓组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况比较 与正常组和假手术组比较,模型组Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),Caspase-3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,推拿组Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Caspase-3蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),假推拿组Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2 、Caspase-3蛋白相对表达量变化均不明显(P均>0.05)。推拿组Beclin1、Bcl-2蛋白相对表达量均明显高于假推拿组(P均<0.05),Caspase-3蛋白相对表达量明显低于假推拿组(P<0.05),推拿组与假推拿组LC3Ⅱ蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。图3及图4。

图3 正常组、假手术组和神经病理性疼痛各组大鼠脊髓组织中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达条带

图4 正常组、假手术组和神经病理性疼痛各组大鼠脊髓组织中 Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达量

2.4各组大鼠脊髓组织中Beclin1、Bcl-2 mRNA相对表达量比较 正常组和假手术组Beclin1、Bcl-2 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。模型组Beclin1 mRNA相对表达量均明显低于正常组和假手术组(P均<0.05);Bcl-2 mRNA相对表达量明显低于正常组(P均<0.05),但与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。推拿组Beclin1 mRNA相对表达量明显高于模型组和假推拿组(P<0.05),模型组与假推拿组比较差异无统计学意义(P>0.05)。推拿组和假推拿组Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),推拿组与假推组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图5 正常组、假手术组和神经病理性疼痛各组大鼠脊髓组织中Beclin1、Bcl-2 mRNA相对表达量

3 讨 论

神经病理性疼痛病理生理机制十分复杂,涉及多种细胞分子、因子以及信号通路等[14]。当神经病理性疼痛发生时,神经损伤会导致细胞释放包括炎症因子在内的各种介质,其中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子会引起炎症级联反应,通过调控各种离子通道的活性,放大并降低神经元兴奋的阈值,增加痛觉敏感性,诱发并促进疼痛的发生[15]。TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞产生,激活后可引起炎性细胞聚集和炎性细胞因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等的释放,进而介导全身炎症反应[16],是启动和维持神经性疼痛状态的关键性病理因素之一,在神经病理性疼痛的发生和维持方面起着重要作用[17-18]。TNF-α还对细胞的激活、增殖和程序性死亡的启动及维持具有重要作用,其可以促进Caspase-3、Caspase-9和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,促进细胞凋亡[19];另外其过度表达时会抑制细胞自噬作用,产生炎性产物,促进细胞凋亡[20],但自噬与凋亡也可以影响TNF-α的产生与分泌,从而介导炎症反应,所以促进自噬可以抑制TNF-α而起到抗凋亡的作用。

自噬与凋亡均是细胞维持内环境稳态的重要方式,自噬和凋亡存在共用的刺激因素和调节蛋白,联系密切而复杂,在不同的条件下,自噬与细胞凋亡之间会产生协同或拮抗作用,但二者之间的协调与转换机制目前仍未明确[21]。神经病理性疼痛与神经细胞自噬和凋亡密切相关,疼痛发生后,神经细胞会出现一系列病理反应,其中细胞产生的促炎因子引起炎症反应,并激活自噬与凋亡,而自噬激活后可以反过来通过抑制促炎因子的分泌发挥抑制炎症的作用[22-23]。既往研究报道,上调自噬相关因子Bcline1和LC3B表达和降低 IL-1β、TNF-α水平可明显减轻神经病理性疼痛,说明自噬对神经病理性疼痛的产生和维持有重要作用,自噬被激活后可通过自噬小体吞噬损伤的细胞器,清除有害的炎性因子,减少炎症因子的释放,从而缓解疼痛反应[24-26]。Hu等[27]研究证实,通过减少脊髓神经元凋亡可以减少TNF-α的产生以及下调凋亡相关基因的表达,可以抑制炎症反应和缓解神经病理性疼痛,证明神经元发生凋亡在神经病理性疼痛中起重要作用。冯涛等[28]研究报道,雷帕霉素可诱导神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经元自噬,抑制细胞凋亡,提示在促进神经病理性疼痛自噬的同时,对凋亡产生了抑制作用,表明在神经病理性疼痛中自噬与凋亡之间存在相互拮抗的关系。

Beclin1、Bcl-2是自噬与凋亡交互作用的重要调节子[29]。Beclin1是自噬体成核的关键调控因子之一,是调节自噬的关键靶点[30]。抗凋亡蛋白Bcl-2能够直接或间接地抑制Cyt C的释放,是细胞凋亡的关键蛋白,Beclin1可借由BH3结构域与Bcl-2结合进行交互,当交互作用发生时会抑制细胞自噬的发生;二者结合的破坏可以促进自噬,抑制细胞凋亡[31]。神经病理性疼痛发生后,疼痛及炎症反应与Beclin1、Bcl-2的表达密切相关。

中医认为神经病理性疼痛是由于内伤外感等所致的“痹证”“筋伤”。《灵枢·经脉》记载:“胆足少阳之脉……是主骨所生病者,头痛颔痛,目锐痛,缺盆中肿痛……诸节皆痛。”足少阳胆经循行周身筋肉骨节,若少阳胆经经络不通,气血阻滞会导致经络所过之处发生疼痛。同时《灵枢·根结》有“少阳为枢”的说法,认为通利少阳经可以使周身经络气血通畅调达。推拿治疗疼痛由来已久,推拿通过各种手法良性刺激患者的痛处以及作用于相关脏腑经络腧穴,可以疏经通络、活血化瘀、行气止痛和理筋整复。推拿少阳胆经可以促进气血调和、经络畅通,以达到治疗痹证疼痛的作用[11,32]。《针灸甲乙经》中言“腰胁相引痛急,髀筋胫,腰痛不可屈伸,痹不仁,环跳主之,筋急,阳陵泉主之”。环跳穴是足少阳胆经与足太阳膀胱经的交会点,主“筋病”的同时还主“骨病”;阳陵泉为筋会,是足少阳胆经与周身筋脉的交会点,有强经络、壮骨节之功效,主治下肢痿痹、麻木,膝肿痛等;悬钟为髓会,主治颈项僵痛、胸胁疼痛、腰膝腿痛等。故选择环跳、阳陵泉、悬钟3个穴位对大鼠进行推拿手法干预。

本实验中模型组与正常组比较,大鼠术后痛阈降低,血清TNF-α水平和脊髓组织中Caspase-3蛋白相对表达量均明显增高,脊髓组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相对表达量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显降低,这说明发生神经损伤后,促炎因子TNF-α释放增加,激活炎症反应进而诱发疼痛,且自噬受到抑制,凋亡增加。推拿组大鼠干预第7天、第14天的机械性刺激缩足阈值均明显高于同期模型组,热痛缩足反应潜伏期均明显长于同期模型组,且血清TNF-α水平和脊髓组织中Caspase-3蛋白相对表达量均明显低于模型组,脊髓组织中Beclin1、LC3Ⅱ、Bcl-2蛋白相对表达量和Beclin1、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于模型组,说明推拿可减轻神经病理性疼痛,其可能是通过上调Beclin1和Bcl-2的表达、下调Caspase-3的表达,从而激活自噬,抑制凋亡,进而减少促炎因子的释放,减轻炎症反应而缓解疼痛。但本研究尚未能完整地揭示推拿对Beclin1和Bcl-2的具体作用机制,在研究的深度和广度上尚有不足,未来需进一步完善相关研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。