陈皮多糖提取工艺及其抗氧化活性研究

唐婷范 李雪松 卢梦影 田玉红 徐紫薇 程昊

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.031

引文格式：唐婷范，李雪松，卢梦影，等.陈皮多糖提取工艺及其抗氧化活性研究[J].中国调味品，2024，49（5）：183-187，204.

TANG T F， LI X S， LU M Y， et al.Study on extraction technology and antioxidant activity of polysaccharides from tangerine peel[J].China Condiment，2024，49（5）：183-187，204.

摘要：该研究以广陈皮为原料，利用超声波辅助提取法提取陈皮多糖，采用单因素试验优化陈皮多糖提取工艺并对其抗氧化活性进行研究，建立以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定广陈皮多糖含量的定量分析方法。采用正交试验以多糖得率为指标优化工艺参数：料液比为1∶45（g/mL），提取时间为10 min，超声功率为350 W，提取温度为65 ℃，在此条件下，陈皮多糖得率高达40.06%。结果表明，广陈皮多糖对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的最大清除率为85.19%，对羟基自由基（·OH）的最大清除率为63.42%。

关键词：广陈皮；多糖；提取工艺；抗氧化活性；清除率

中图分类号：TS201.1      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）05-0183-05

Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of

Polysaccharides from Tangerine Peel

TANG Ting-fan， LI Xue-song， LU Meng-ying， TIAN Yu-hong， XU Zi-wei， CHENG Hao*

（Guangxi Liuzhou River Snails Rice Noodles Engineering Technology Research Center， Guangxi

Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources， College of Biological and Chemical

Engineering， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： In this study， with Citrus reticulata Blanco. as the raw material， the polysaccharides are extracted from tangerine peel by ultrasonic-assisted extraction method. Single factor test is used to optimize the extraction technology of polysaccharides from tangerine peel and study their antioxidant activities. A quantitative analytical method is established for the determination of polysaccharide content from tangerine peel by phenol-sulfuric acid method with glucose as the standard sample. The technology parameters are optimized by orthogonal test with the yield of polysaccharides as the index： the solid-liquid ratio is 1∶45 （g/mL）， the extraction time is 10 min， the ultrasonic power is 350 W and the extraction temperature is 65 ℃. Under these conditions， the yield of polysaccharides from tangerine peel could reach 40.06%. The results show that the maximum scavenging rate of polysaccharides to 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH·） and hydroxyl radical （·OH） is 85.19% and 63.42% respectively.

Key words： Citrus reticulata Blanco.; polysaccharides; extraction technology; antioxidant activity; scavenging rate

收稿日期：2023-10-12

基金項目：国家自然科学基金项目（22268012）；广西自然科学基金面上项目（2022GXNSFAA035490，2021GXNSFAA220067）

作者简介：唐婷范（1988—），女，高级实验师，博士，研究方向：天然产物化工。

*通信作者：程昊（1980—），男，副研究员，硕士，研究方向：应用化学。

广陈皮主要来源于芸香科植物橘的栽培变种茶枝柑和四会柑的干燥成熟果皮，其中以新会陈皮最著名[1-2]，新鲜柑橘果皮自然陈化1年以上，可称为“陈皮”[3]，其不仅有较高的药用价值，而且是传统香料和调味佳品[4]。广陈皮主要由挥发油、黄酮类化合物、生物碱、多糖等功能成分组成[5-8]。陈皮多糖由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和木糖以及少量鼠李糖组成[9]。随着陈皮贮藏时间的延长，果胶多糖中可溶性结合态酚酸的含量增加[10]。陈皮果糖具有抗病毒、抗衰老、降血糖、调节免疫力、抗肿瘤等药理活性[11-14]。

目前最常用的提取多糖的方法是溶剂提取法[15-17]，但该法pH控制不好，易破坏糖苷键，使多糖的结构受损，与溶剂提取法相比，超声波提取法[18]具有工艺简单、提取快捷、精密度高等特点。本试验采用超声波辅助法提取广陈皮多糖，考察了料液比、提取时间、超声功率、提取温度对陈皮多糖得率的影响，对广陈皮中多糖提取工艺及其抗氧化活性进行初步研究，充分利用广陈皮这种传统香料，提高调味品的营养价值和健康效益。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

陈皮：购于广东省江门市新会区；浓硫酸、L（+）-抗坏血酸：西陇科学股份有限公司；葡萄糖、苯酚、水杨酸：天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；硫酸亚铁：广东台山市粤侨化工厂；DPPH·：Wako公司；过氧化氢：成都市科龙化工试剂厂，以上试剂均为分析纯。

1.2  仪器与设备

KQ-500DE型数控超声波清洗器  昆山市超声仪器有限公司；FA124型电子分析天平、V2000型可见光分光光度计  上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅  常州国华电器有限公司；DXF-200C/D密封性摇摆式粉碎机  广州市大祥电子机械设备有限公司；BPG-9240A型精密鼓风干燥箱  上海一恒科学仪器有限公司；RE52-99型旋转蒸发器  上海亚荣生化仪器厂；SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵  郑州长城科工贸有限公司。

1.3  方法

1.3.1  陈皮的预处理

将新鲜的陈皮放在40 ℃的烘箱中烘干，经粉碎过40目筛，置于干燥处备用。

1.3.2  标准曲线的绘制

采用移液管移取1.00 mL葡萄糖标准溶液，并将其转移到10.00 mL的容量瓶中，按顺序加入1.00 mL超纯水、1.00 mL 5%的苯酚溶液，轻轻摇匀以确保其充分混合。向容量瓶中加入5.00 mL浓硫酸，并彻底混合。将混合溶液静置约10 min，再将容量瓶放入30 ℃的水浴锅中，保温20 min后，取出容量瓶，使用超纯水定容至刻度线，最后将容量瓶放入冷水中冷却至室温。以超纯水为参比，在400～600 nm范围内进行光谱扫描，确定吸收波长。分别精密吸取0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL葡萄糖标准溶液于5个10.0 mL容量瓶中，依次加入1.80，1.60，1.40，1.20，1.00 mL超纯水，摇匀，用苯酚-硫酸法[19]显色。采用可见光分光光度计测定吸光度。以葡萄糖溶液的浓度（C）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标建立葡萄糖标准曲线[20]。

1.3.3  多糖得率的测定

使用多糖的标准曲线回归方程，在波长490 nm处测定吸光度，通过计算多糖的得率来评估试验的效果。

多糖得率（%）=CVN1 000m×100%。

式中：C为粗提取液中多糖的浓度（mg/mL）；V为提取液的稀释体积（mL）；N为提取液的稀释倍数；m为样品的质量（g）。

1.3.4  单因素试验

1.3.4.1  料液比

在超声波提取试验中，固定以下试验参数进行研究：提取时间为30 min，提取温度为60 ℃，提取功率为300 W。通过改变料液比来确定其对提取效果的影响，选取了5个水平，分别是1∶45、1∶55、1∶65、1∶75、1∶85（g/mL），每个水平进行3次平行试验。

1.3.4.2  提取时间

在超声波提取试验中，固定以下试验参数进行研究：提取温度为60 ℃，料液比为1∶55（g/mL），提取功率为300 W。通过改变提取时间来确定其对提取效果的影响，选取了5个水平，分别是10，20，30，40，50 min，每个水平进行3次平行试验。

1.3.4.3  超声功率

在超声波提取试验中，固定以下试验参数进行研究：提取温度为60 ℃，料液比为1∶55（g/mL），提取时间为20 min。通过改变超声功率来确定其对提取效果的影响，选取了5个水平，分别是300，350，400，450，500 W，每個水平进行3次平行试验。

1.3.4.4  提取温度

在超声波提取试验中，固定以下试验参数进行研究：料液比为1∶55（g/mL），提取时间为20 min，提取功率为350 W。通过改变提取温度来确定其对提取效果的影响，选取了5个水平，分别是55，60，65，70，75 ℃，每个水平进行3次平行试验。

1.3.5  陈皮多糖提取条件工艺优化

研究以上4个因素对陈皮多糖得率的影响，并优化提取条件，记录相应的数据。利用Origin 2022软件对数据进行制图和正交分析，以确定各因素的主效应、交互效应和误差效应。

1.3.6  抗氧化作用

将陈皮多糖粗提液和维生素C配制成0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mg/mL 5种浓度梯度的样品溶液，然后用移液管分别吸取2.00 mL不同浓度的陈皮多糖样品溶液和维生素C溶液于试管中，编号后将2.00 mL 0.20×10-3 mol/L的DPPH无水乙醇溶液与待测样液混匀，在避光处反应30 min。在517 nm波长处采用分光光度计测定试液的吸光度，记为A1。用无水乙醇替换DPPH无水乙醇溶液，将测得的吸光度记为A2。取蒸馏水和0.20 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液各2.00 mL混匀，在避光处反应30 min。测定该混合溶液的吸光度，记为A0。每个样液进行3次平行测定。以无水乙醇溶液作为空白对照组，用于校正试验中可能引起的背景干扰。

SDPPH·（%）=1－A1－A2A0×100%。

将陈皮多糖粗提液和维生素C分别配制成0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mg/mL 5种浓度梯度的样品溶液，然后用移液管分别吸取1.00 mL不同浓度的陈皮多糖样品溶液和维生素C溶液于10.00 mL容量瓶中，并进行编号。分别加入1.00 mL 0.009 mmol/L的FeSO4溶液和1.00 mL 0.009 mmol/L的水杨酸溶液，混合均匀后加入1.00 mL 8.80 mmol/L的H2O2溶液，最后用超纯水定容，在37 ℃条件下水浴保温30 min。使用可见光分光光度计，设置波长为526 nm，测得吸光度，记为A1。将H2O2溶液换成超纯水，重复上述试验步骤，测得吸光度，记为A2。将样品溶液换成超纯水，测得吸光度，记为A0。每个样液进行3次平行测定，取平均值。以超纯水作为空白对照组，用于校正试验中可能引起的背景干扰。

S·OH（%）=1－A1－A2A0×100%。

配制成不同质量浓度的样品溶液，分别运用Fenton法和DPPH法[21-23]，测定各试样不同浓度时的A517 nm与A526 nm，并计算其对DPPH·和·OH的清除率。

2  试验结果

2.1  葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准溶液吸收光谱见图1。

在最大吸收波长（490 nm）处测量每个葡萄糖标准溶液的吸光度，绘制出葡萄糖标准曲线，见图2。

经拟合计算，葡萄糖标准曲线线性回归方程为Y=0.033 6X+0.162 3，相关系数R2=0.992 9，在2～10 μg/mL浓度范围内，吸光度值与葡萄糖浓度呈现良好的线性关系。

2.2  单因素对陈皮多糖得率的影响

2.2.1  料液比对陈皮多糖得率的影响

由图3可知，随着料液比的增大，陈皮多糖的得率呈现先增大后急剧减小的趋势。由于溶液中存在某种驱动力，当料液比为1∶55（g/mL）时，多糖得率达到最大值。随着料液比的增大，这种驱动力迫使传质速率加快，多糖的浸出量增多。当料液比增加到一定程度时，因为料液相中存有浓度差，多糖浸出量不再增多反而减少，此时其他物质的浸出量增多，导致多糖得率下降[24]。考虑到溶剂的体积增加会影响后续试验的工作量，因此，选择1∶55（g/mL）为最佳的料液比。

2.2.2  提取时间对陈皮多糖得率的影响

由图4可知，提取时间对陈皮多糖得率有较大影响，随着提取时间的延长，多糖得率先升高后降低。当提取时间为20 min时，多糖得率达到最大值。这是因为在短时间内超声波处理可以有效地将细胞破碎得非常小，从而促使多糖向细胞外扩散，提高了提取物中多糖的含量。随着提取时间的延长，超声波的剪切力和加工时间逐渐增加，导致糖苷键断裂降解，引起其他物质溶出，可能包括一些非目标成分，从而导致多糖得率下降。因此，对于提取过程中时间的控制，需要平衡破碎细胞和保护目标多糖。过短的时间可能无法充分释放多糖，而过长的时间可能导致多糖的损失和降解。将提取时间控制在20 min可实现最佳的多糖提取效果。

2.2.3  超声功率对陈皮多糖得率的影响

由图5可知，随着超声功率的增加，陈皮多糖的得率呈逐渐增加的趋势，在350 W时达到最大值，当超声功率超过阈值（350 W）时，额外的功率可能过度破坏多糖分子结构，甚至引起热效应，导致多糖的损失和降解，进而导致其他物质的浸出量增加，从而使多糖得率下降。因此，合理控制超声功率可实现多糖得率最大化。选择超声功率为350 W，不仅能有效破坏细胞壁，释放多糖，而且能避免过高的功率对多糖的损害。

2.2.4  提取温度对陈皮多糖得率的影响

由图6可知，随着提取温度的升高，陈皮多糖的得率呈现先增大后减小的趋势。在达到一定温度（70 ℃）时，陈皮多糖的得率达到最大值。如果温度过高，多糖的结构和生理活性会受到一定的影响，溶剂的渗透性和溶解度将大大提高，其他物质的浸出也将加快，同时多糖的结构和组织也会遭到严重的破坏。当温度超过70 ℃并且与超声波同时作用時，陈皮多糖的性质发生了变化。由于高温会加快陈皮多糖分子内部的热运动，导致多糖链的断裂和分解，这种热不稳定性是因为高温能够破坏多糖分子之间的键，使其失去整体结构的稳定性。其次，超声波的作用也会对多糖产生影响。超声波产生的高频振动和剧烈涡流效应会引起混合均匀性和温度梯度的变化，从而加剧多糖的降解，这是因为超声波的机械能对多糖分子施加较大压力，使其易于断裂。这两种作用的叠加导致了陈皮多糖的降解和提取得率的下降。随着温度的升高，在超声波的作用下，多糖分子逐渐失去稳定性，造成多糖链的断裂和分解，从而减少了多糖的得率。因此，选择70 ℃为最佳提取温度。

2.3  正交试验设计结果

根据上述单因素试验结果，选择料液比、提取时间、超声功率和提取温度4个因素进行正交试验，并确定了最优的相邻两组试验条件。正交试验因素水平见表1。正交试验结果及分析见表2。

通过分析表2中数据，可知不同因素对陈皮多糖得率的影响程度为料液比>超声功率>提取时间>提取温度。最佳的提取方案为A1B1C2D1，即料液比为1∶45（g/mL），提取时间为10 min，超声功率为350 W，提取温度为65 ℃。根据最佳工艺条件，测得多糖得率为40.06%，表明该试验条件使多糖得率达到最高。

2.4  抗氧化作用试验结果

由图7可知，陈皮多糖的浓度与其对DPPH·的清除率成正比。随着陈皮多糖浓度的增加，DPPH·清除率也随之增加。而维生素C与之不同，随着维生素C浓度的增加，其对DPPH·的清除率一直呈平缓趋势，无较大波动。在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，维生素C表现出比陈皮多糖更高的清除率。在浓度为1.0 mg/mL时，陈皮多糖对DPPH·的清除率最高，为85.19%，而维生素C对DPPH·的清除率有所下降，这是因为在试验过程中操作不当造成的误差。在浓度为0.6 mg/mL时，维生素C表现出最佳的抗氧化活性，能够有效地清除DPPH·，清除率为95%。维生素C对DPPH·的清除率高于陈皮多糖。

由图8可知，陈皮多糖和维生素C的浓度与其对·OH的清除率成正比。在浓度增大的情况下，·OH清除率也随之增大。在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内，维生素C对·OH的清除率大于陈皮多糖。在浓度大于0.6 mg/mL后，维生素C对·OH的清除率逐渐趋于平缓，而陈皮多糖对·OH的清除率继续增大。在浓度为1.0 mg/mL时，陈皮多糖对·OH的清除率达到63.42%，而维生素C对·OH的清除率达到99.72%。陈皮多糖对·OH的清除率一直小于维生素C。

3  结论

本试验利用超声波提取法研究了料液比、提取时间、超声功率和提取温度对广陈皮多糖提取工艺的影响，并初步讨论了广陈皮多糖的抗氧化活性。经过试验得出以下结论：广陈皮中含有具有抗氧化活性的多糖类成分。试验结果表明，在最佳提取工艺条件下，多糖的得率为40.06%，说明该方法具有较高的提取效率，为进一步研究奠定了基础。在试验所选的浓度范围内，广陈皮多糖提取液对羟基自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除率分别达到63.42%和85.19%。综上所述，通过超声波提取法提取广陈皮多糖并评估其抗氧化活性，发现广陈皮中含有多糖类抗氧化成分，并且具有较高的提取效率和一定的自由基清除作用，这为进一步研究广陈皮多糖在食品科学及医药领域的应用提供了基础。

广陈皮中的多糖具有良好的抗氧化活性，但本试验对陈皮多糖的提取还未精细化，未来研究将对多糖进一步分离纯化，确定其种类和结构性质。在天然多糖研究领域，一些方面还未涉及，例如多糖的抑菌性研究、抗辐射研究等。广陈皮对人体的毒副作用小，药用价值高，具有重要的生物活性，在医药、食品等领域具有广泛的应用和发展前景。通过利用陈皮多糖的抗氧化活性，可以开发出更多高效的药物和功能性食品，不仅能够满足人们对美味食品的需求，而且能提供额外的保健功效，促进人体健康。

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