富硒油菜粉抗氧化特性及其与化学成分相关性

杨 迪，闵立风，张 睿，张涵鸣，熊 坤，庄 洋，傅 琴，莫开菊,*

（1.湖北民族大学生物与食品工程学院，湖北 恩施 445000；2.国家富硒产品质量检验检测中心，湖北 恩施 445000；3.恩施硒圣植物科技有限公司，湖北 恩施 445000）

硒（Se）是一种微量元素，具有重要的生物学功能，对人体健康具有重要意义[1]。硒通过修饰谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶和碘甲状腺原氨酸脱碘酶等至少30 种蛋白的表达影响着人体的生理功能[2]。这些硒代酶能够作为抗氧化剂调节人体的生理功能、调节甲状腺激素代谢和免疫系统功能、预防癌症等[3]。因此，硒具有较高的营养和医疗价值。

此外，硒可以通过参与植物体内的物质和能量代谢影响植物体内化合物的合成[4-6]，进而改变植物体系的抗氧化活性及功能特性。如不同种类的富硒茶在茶多酚、茶多糖、黄酮、总氮等化学成分含量上与相对应的普通茶具有显著差异[4]，而这些化学成分含量的不同可能会带来抗氧化能力的差异。因此，富硒植物提取物可能比未富硒植物提取物具有更强的抗氧化活性[7]。有研究表明油菜具有较强的富硒能力[8]，并且用油菜粉（以硒质量计0.36 mg/kgmb）喂养大鼠30 d后没有受到明显毒害作用[9]，因此食用富硒油菜粉可能成为补硒的一条有效途径。然而，富硒油菜粉是否具有抗氧化活性及存在何种抗氧化活性物质鲜见研究，因此本研究测定了富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物中的总氮、总糖、多酚、黄酮、皂苷、总硒、多糖和多糖硒的含量以及抗氧化活性，并分析其相关性和偏相关性，进一步了解各物质独立的抗氧化活性，以期为开发富硒油菜粉产品提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物由恩施硒圣植物科技有限公司提供。

苯酚、冰醋酸、福林-酚试剂、过硫酸钾、过氧化氢、邻苯三酚、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸、硫酸钾、硫酸铜、没食子酸、氢氧化钠、三氯化铁、无水醋酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖 美国Sigma公司；2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-甲酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）东京化成工业株式会社；芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）山东西亚化学工业有限公司；齐墩果酸 上海源叶生物科技有限公司；香草醛 天津光复精细化工研究所；硫酸亚铁 天津市北方天医化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷天津市博迪化工有限公司；高氯酸 天津市东方化工厂；水杨酸 天津市福晨化学试剂厂；无水碳酸钠天津市永大化学试剂开发中心；硼酸、无水乙醇和盐酸武汉市中天化中有限责任公司。所有试剂均为化学纯。

1.2 仪器与设备

Infinite M200 Pro多功能酶标仪 瑞士帝肯公司；RC-HH-6数显恒温水浴锅 北京睿诚永创科技有限公司；GL224I-1SCN电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 总氮含量的测定

采用凯氏定氮法[4]测定总氮含量。

1.3.2 总糖和多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法[4]测定样品溶液中的总糖含量。以葡萄糖为标准品在490 nm波长处测定吸光度并计算样品中总糖含量。提取液加入无水乙醇使乙醇终体积分数为80%，4 ℃静置过夜后4 000 r/min离心得沉淀，将沉淀用无水乙醇洗两次得到多糖，得到的多糖同样用苯酚-硫酸法测定并计算提取液中的多糖含量。

1.3.3 多酚含量测定

采用福林-酚法[4]测定样品溶液中多酚含量。以没食子酸为标准品于765 nm波长处测定吸光度，并计算样品中多酚含量。

1.3.4 总黄酮含量测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝体系测定样品溶液中的总黄酮含量[4]。以芦丁为标准品，在510 nm波长处测定吸光度，并计算样品中总黄酮含量。

1.3.5 总皂苷含量测定

采用香草醛-高氯酸法[10]测定总皂苷含量。以齐墩果酸为标准品，在560 nm波长处测定吸光度，并计算标准曲线和样品中总皂苷含量。

1.3.6 总硒和多糖硒含量测定

采用原子荧光法[4]测定样品溶液中总硒和多糖硒的含量。

1.3.7 总铁离子还原力测定

采用铁离子还原/抗氧化能力法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）[11]测定总铁离子还原力。将300 mmol/L、pH 3.6醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L三氯化铁溶液以体积比10∶1∶1配制成FRAP工作液。分别取150 μL FRAP工作液和50 μL样液于酶标板中，37 ℃孵育10 min后于593 nm波长处测定吸光度，同时以蒸馏水为对照，以Trolox标准液绘制标准曲线y＝0.003 4x+0.005 5，R2＝0.999 1，并计算小藻提取物的总铁离子还原能力。

1.3.8 提取物抑制氢原子转移能力测定

参考郭丽丽等[10]的方法并略作修改。取8.0 mg DPPH溶于用30 mL 70%乙醇溶液中，超声溶解5 min后转入50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容得到DPPH自由基工作液，取DPPH自由基溶液100 μL于酶标板中，再加入100 μL样液，混匀静置30 min后测定520 nm波长处吸光度，同时以纯水作为空白，测定样品底物吸光度，每个样品重复3 次。DPPH自由基清除率的计算如下式所示：

式中：A0为空白对照液的吸光度；A1为加入样品后的吸光度；A2为以纯水替代自由基工作液的吸光度。

1.3.9 提取物抑制电子转移能力测定

将浓度为7 mmol/L ABTS阳离子自由基溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，室温25 ℃避光反应12～16 h，制备ABTS阳离子自由基储备液。使用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH 7.4）将储备液稀释至适宜吸光度，备用。取各浓度样品50 μL，加入150 μL ABTS阳离子自由基溶液，于暗处反应5 min，测定其在734 nm波长处的吸光度[10]。以蒸馏水代替样品作为空白。每个样品重复3 次。ABTS阳离子自由基清除率按1.3.8节公式计算。

1.3.10 羟自由基清除能力测定

在比色管中依次先加入20 μL 9 mmol/L FeSO4溶液、20 μL 9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液、100 μL样液、40 μL蒸馏水和20 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液。37 ℃孵育15 min后于510 nm波长处测其吸光度，同时测定参比溶液吸光度，参比溶液以蒸馏水替代H2O2[10]。每个样品重复3 次。羟自由基清除率按1.3.8节公式计算。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 21.0软件对实验数据进行Pearson相关性分析与偏相关性分析；采用Duncan法进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 油菜粉提取物中基本化学成分

从表1可以看出，普通油菜粉提取物中总糖、多糖和皂苷质量浓度明显高于富硒油菜粉提取物，而富硒油菜粉提取物中含氮化合物、多酚、黄酮、总硒以及多糖硒含量明显高于普通油菜粉提取物。有研究表明富硒培养会改变植物体内化学成分的含量[4-5]，这可能是因为在植物生长过程中，硒参与植物体内的物质和能量代谢，从而促进作物对营养物质的吸收及代谢产物的生成[5-6]。总之，两种提取物中化学成分含量有所差异，且富硒油菜粉提取物中含氮化合物、多酚、黄酮、总硒和多糖硒含量更高。

表1 油菜粉提取物中各化学成分的含量Table 1 Chemical components content in rape powder extracts

2.2 油菜粉提取物抗氧化能力

机体内氧化反应产生的自由基可以穿过细胞膜，并容易与生物分子包括碳水化合物、蛋白质、脂质和DNA发生反应，导致组织损伤或细胞死亡[12]。由图1可以看出，富硒和普通油菜粉提取物还原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力均随质量浓度的增加而上升。当提取物质量浓度为0.25 mg/mL时，富硒油菜粉提取物与普通油菜粉提取物还原Fe3+的能力以及清除羟自由基的能力接近。当提取物质量浓度为4.0 mg/mL时，富硒油菜粉提取物和普通油菜粉提取物还原Fe3+的能力以及清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的能力接近。除此之外，富硒油菜粉提取物还原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力均明显高于普通油菜粉提取物。一般而言，抗氧化活性物质通过给予电子及氢原子阻断自由基的链式反应，达到抗氧化的目的[13-15]。

图1 富硒和普通油菜粉提取物与抗氧化活性的量效关系Fig.1 Concentration-dependent antioxidant activity of seleniumenriched and regular rape powder extracts

从图1可以看出，油菜粉提取物还原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力有所差异。DPPH自由基分析法适用于疏水性抗氧化系统[13]；ABTS阳离子自由基分析法可以广泛应用于亲水性和亲脂性抗氧化系统[16-17]。羟自由基清除实验是利用抗氧化剂清除由芬顿反应产生的羟自由基[18]；FRAP法的原理是在酸性条件下，抗氧化剂将Fe3+-TPTZ还原成蓝色的Fe2+-TPTZ，根据其吸光度变化测定样品的总还原能力[11]，经常被用于快速评估各种食品、饮料以及各种植物提取物的总抗氧化能力[11,19-20]。因此，两种油菜粉提取物在不同测定方法中具有不同的抗氧化活性。一般来说，体外测定可以评估特定反应系统中的抗氧化活性[21]，对某一样品可以使用多种抗氧化剂测定法确定其抗氧化活性。与天然油菜粉提取物相比，富硒样品显著提高了还原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力，具有更强的抗氧化活性。富硒油菜粉提取物中含有更多的含氮化合物、多酚、黄酮、总硒以及多糖硒等物质，这些物质都具有一定的抗氧化能力[22-24]。因此，富硒油菜粉较高的抗氧化活性可能也与这些抗氧化活性物质含量较高有关。

2.3 油菜粉提取物基本化学成分与抗氧化能力相关性分析

2.3.1 化学成分与抗氧化特性的Pearson相关性分析

由表2可知，总氮、多酚和总黄酮含量的增加均能显著或极显著增加Fe3+还原能力以及DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由清除能力，表明总氮、多酚和总黄酮可能是两种油菜粉提取物中最重要的抗氧化物质；其次，皂苷和多糖硒含量可以正相关地影响3 种抗氧化活性，表明皂苷和多糖对油菜粉提取物的抗氧化能力也有重要影响；最后，总糖、总硒和多糖含量的上升分别能显著增加1～2 种抗氧化活性指标水平，表明总糖、总硒和多糖对油菜粉的抗氧化能力具有一定的贡献。有研究表明，蛋白、多酚和黄酮与抗氧化活性之间呈显著正相关[22-26]，而皂苷和还原糖以及硒多糖都具有一定的抗氧化活性[23,27-28]。相关性分析中总氮、总糖、多酚、总黄酮、皂苷、总硒、多糖和多糖硒均与油菜粉提取物的抗氧化能力存在一定的正相关性，表明这些物质含量的增加有利于提高油菜粉提取物的抗氧化能力。

表2 化学成分与抗氧化性的Pearson相关性Table 2 Pearson correlation analysis between chemical components and antioxidant activity

Pearson相关性可以简洁地反映两个变量间的相关性和线性关系[29]。但在多变量分析中，两个变量间的关系会受到其他变量的影响，Pearson相关性可能无法正确反映两个变量间的内在联系，而偏相关分析通过控制其他变量，在多变量分析中能有效量化选定变量间的相关性[30-31]，因此采用偏相关分析油菜粉提取物中化学成分与抗氧化性之间的关系。

2.3.2 化学成分与抗氧化特性的偏相关分析

从表3可以看出，在偏相关分析中总氮、总糖、多酚、总黄酮、皂苷和总硒均被排除，Fe3+还原能力和DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除能力仅与多糖和多糖硒相关，且多糖硒与4 种能力均呈极显著正相关（P＜0.01），多糖含量与Fe3+还原能力、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力显著或极显著正相关（P＜0.05，P＜0.01）。表明油菜粉提取物的主要抗氧化活性可能与多糖和多糖硒有关。

表3 化学成分与抗氧化性的偏相关性Table 3 Partial correlation analysis between chemical components and antioxidant activity

有研究表明硒化后的多糖会增加ABTS阳离子自由基清除能力和Fe3+还原能力，但是单纯的无机硒+多糖干预并不会增强多糖的抗氧化活性[27-28,32]，这是由于硒多糖中氢硒基（SeH）或硒酸酯基团可以激活异构碳上的氢原子，基团的活化程度越高，贡献氢原子的能力越强[33-34]。糖醛酸含量较高的多糖具有更强的抗氧化潜力[35]，而硒多糖含有更多的糖醛酸并具有更高的抗氧化能力[36]。因此，硒的引入可能改变油菜粉中多糖的组成，降低多糖的分子质量，从而增加富硒提取物的抗氧化活性。总之，虽然普通油菜粉中的总糖或总多糖含量较高，但富硒油菜粉中的硒或多糖中硒含量较高，即可能含有更高含量的硒多糖，使其拥有较高的抗氧化活性。因此，油菜粉提取物中硒多糖的含量可能是影响其抗氧化活性的主要因素。

3 结论

两种油菜粉提取物中，富硒油菜粉提取物含氮化合物、多酚、黄酮和总硒以及多糖硒含量明显高于普通油菜粉提取物，但总糖、多糖和总皂苷含量相对较低。Fe3+还原能力以及DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除能力均随提取物质量浓度的增加而增大，并且富硒油菜粉提取物还原Fe3+以及清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基的能力均强于普通油菜粉提取物。相关性分析表明提取物中含氮化合物、总糖、多酚、黄酮、皂苷、多糖、总硒以及多糖硒含量的增加均能在一定程度上增强提取物的抗氧化活性，尤其是总氮、多酚和黄酮。但偏相关性分析表明多糖和多糖硒可能是油菜粉提取物抗氧化能力的主要因素，即多糖和多糖硒含量的差异可能是造成两种油菜粉提取物抗氧化能力差异的主要因素。