基于网络药理学及分子对接探讨二至丸治疗早发性卵巢功能不全的作用机制

简万妍 王艳群 陈美玲 曾 莉

1.贵州中医药大学第二临床医学院，贵州贵阳 550002；2.贵州中医药大学第二附属医院妇科，贵州贵阳 550001

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）[1]指的是女性在40周岁以前发生的一种生殖内分泌疾病，以月经稀发、频发甚至闭经，生育力下降甚至不孕或出现潮热盗汗等为主要临床症状，并伴随卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平升高（FSH＞25 IU/L）、雌激素水平降低。相关研究表明POI在育龄期女性中发生率为1%～5%[2]。目前相关的医学领域研究提出POI的发病可能与自身免疫力、感染、环境等因素相关，其临床治疗方法局限且治愈难度大[3]。

纵观书海，古代医学尚未谈及“早发性卵巢功能不全”，根据POI的临床特征，可以把它划为“月经病”“经断前后诸证”等范畴。

本研究通过网络药理学的方法与分子对接技术，阐述二至丸防治POI药物成分的作用机制，并为其提供基本生物学信息依据，为寻求POI新的治疗方法提供科学基础。

1 资料与方法

1.1 二至丸靶点筛选

在网络药理学平台（TCMSP，https://tcmspw.com）中获得复方药物的活性成分。运用蛋白数据库（http://www.uniprot.org/）将蛋白转化为标准化基因名称，建立中药-成分-靶点数据库。

1.2 POI靶点筛选及处理

通过GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://mirror.omim.org/）查找POI的靶点基因。

1.3 二至丸治疗POI的靶点预测

将POI靶点与二至丸相同靶点用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图。把共同靶点输进STRING数据库（https://string-db.org/）后构建蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI），使用Cytoscape 3.10.0数据库进行可视化，分析后根据度值（Degree）大小排序构建药物-疾病PPI图。

1.4 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将最终筛选出的共有靶点输入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），分别将GO的生物学过程（biological process，BP）、分子功效（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）KEGG富集通路引出并整理。通过微生信（www.bioinformatics.com.cn）平台进行可视化处理。

1.5 药物-成分-疾病-通路-靶点网络图构建

将二至丸中对应的活性成分、成分靶点和富集的通路等数据导入Cytoscape 3.10.0软件中，绘制出“药物-成分-疾病-通路-靶点”网络图。

1.6 分子对接

通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）选出核心小分子结构，使用PDB数据库（http://www1.rcsb.org/）获取相应靶点蛋白文件。运用AutoDockTools 1.5.6进行对接，并采用Pymol软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 二至丸活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库筛选两味中药材的活性成分，共筛选出二至丸中药活性成分墨旱莲10个，女贞子8个，共同者有2个（Luteolin、Quercetin），基本信息见表1。将TCMSP数据库和UniProt信息匹配，最后得到二至丸对应靶点为198个。

表1 二至丸活性成分

2.2 二至丸活性成分和靶点的网络构建

运用Cytoscape 3.10.0软件进行网络可视图的构建（图1），整个网络图由212个节点和405条边构成。A1、A2代表两个药物的共同成分，NZZ1-6表示女贞子的6个有效成分；MHL1-8表示墨旱莲的8个有效成分。

图1 “二至丸-活性成分-靶点”网络图

2.3 POI靶点筛选

将GeneCards和OMIM数据库中获取到的疾病关联基因归纳后，共获取POI基因1815个。利用Venny 2.1.0对198个靶点基因和1815个靶点分析制图，取交集后共获得107个共同基因（图2）。

图2 二至丸-POI靶基因Venny图

2.4 二至丸治疗POI的靶点预测

把处理后的信息导入Cytoscape 3.10.0以建立PPI网络（图3），其包括节点107个，边线1695条。节点越大代表其在网络中的作用越重要，再使用CytoHubba插件筛选前十位的靶点（图4）。

图3 PPI网络图

图4 PPI中的关键蛋白

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

将二至丸治疗POI的核心靶点基因导入DAVID进行GO富集分析，分别取BP、CC、MF的-lgP值前十位构建条形图（图5）。GO分析结果表明，BP主要包括转录的正向调控、正向调控细胞增殖等。CC的结果显示主要与细胞核、细胞外间隙等关联。MF主要包含与蛋白结合、酶结合等。KEGG富集分析得到的信号通路有肿瘤相关通路、液体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等（图6）。

图5 二至丸治疗POI的GO富集分析

图6 二至丸治疗POI的KEGG富集分析

2.6 药物-成分-疾病-通路-靶点网络图构建

使用Cytoscape 3.10.0软件，形成药物-成分-疾病-通路-靶点网络图（图7）。A1、A2代表两个药物的共同成分，NZZ1-6表示女贞子的6个有效成分；MHL1-8表示墨旱莲的8个有效成分。圆形为靶点基因，POI外的八边形为通路。

图7 “二至丸-活性成分-疾病-通路-靶点”网络图

2.7 分子对接验证

根据分子对接方法对结果进行研究，选取degree值靠前的槲皮素、木犀草素2种关键活性成分与degree值较大的关键靶点PTGS2、PTGS1进行对接，见表2，结果显示槲皮素与PTGS2，木犀草素与PTGS2、PTGS1存在较好的亲和力（图8）。其中木犀草素与PTGS2结合最为密切，结合能为-5.87 kJ/mol。结果显示二至丸核心成分与靶蛋白具有较好的亲和力，可能通过这些靶点治疗POI。

图8 二至丸有效成分与核心靶点的分子对接情况

表2 二至丸主要成分靶点和分子对接结果

3 讨论

POI是指女性在40周岁以前出现月经稀发、频发甚或闭经、FSH＞25 U/L，雌激素水平降低等卵巢功能下降的疾病[1]。相关研究显示，其主要与遗传性因素、免疫因素、医源性因素、环境因素等有关[4]。当前现代医学治疗POI更多选择激素替代治疗，长期使用激素替代疗法会增加罹患女性相关癌症（如乳腺癌）的可能，故用药过程需定期评估，因而在临床应用中受限。历代名医指出妇女在经断时期体内肾气亏损，阴阳失衡，最后引起各脏腑功能下降，肾虚为该病的基本病机[5]。女贞子有滋阴益寿、补益肝肾等功效；墨旱莲具有温补肝肾、凉血的功效。以上药物味平，补而不腻，是平补肝肾之经典名方。

本研究共筛选出16个二至丸潜在活性成分，根据拓扑出的核心节点，槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素是二至丸作用于POI的4个主要成分。槲皮素是人体饮食中最丰富的类黄酮之一，而近年来的科学研究也证实了其具有优异的抗氧化功能，表现在能够控制氧化呼吸链的扩散和抑制自由基产生等[6]。既往实验表明，槲皮素的抗氧化活性主要是经过调整身体中谷胱甘肽的剂量、氧化反应相关酶的活性和氧化应激信号通路来实现的[7]。黄长盛等[8]的研究数据说明槲皮素有益于人体各阶段卵泡的正常生长发育，通过刺激可分泌雌激素的颗粒细胞繁殖以此改善卵巢功能。木犀草素属于天然黄酮类化合物，据近年来的科学研究证实，木犀草素经常以糖苷的形式出现于各种药物成分和蔬菜水果中，如金银花、菊花等[9]。研究显示，其兼顾抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等药理活性[10-11]。研究表明，山柰酚是因为激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路，从而降低氧化应激和炎性反应。刺槐素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，有许多生物功能，包括抗氧化、抗病毒、抗炎抑菌，并且能够通过各种方式治愈多种癌症疾病。故本研究预测二至丸通过槲皮素、木犀草素、山柰酚、刺槐素等有效成分改善POI。

PPI网络涉及基因节点107个，通过拓扑分析检测出重要节点为AKT1、TP53、VEGFA、TNF等。作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，AKT1），基于研究数据，指出AKT1在卵巢支持细胞的代谢、凋亡及细胞周期的环节中发挥作用[12]。肿瘤抑制蛋白（tumor protein，TP53）通过减少卵巢中颗粒细胞的生成及类固醇激素的产生、加速其颗粒细胞的凋亡，从而致使卵巢功能衰退[13]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）程度与卵巢细胞生长、分解和萎缩密切相关，调控卵泡生长与萎缩、卵母细胞成熟及排卵[14]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）包含了VEGFA，VEGFA亚型的均衡调控着卵泡的发展和黄体产生，亚型的表露能调控哺乳动物的生育能力。

KEGG通路富集分析主要涉及的信号通路有癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、液体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等。细胞中经典的信号通路是PI3K-Akt，该信号通路异常表达时，在影响原始卵泡规律发育的前提下，改变卵巢的正常生理功能，导致卵巢衰老的进展迅速。流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路能够改变血管内皮细胞的分解、形态及血管壁的通透性，是由于内皮细胞中基因和蛋白的表达被破坏而造成的[15]，从而对血流动力学产生影响。借此可猜测该通路损坏卵巢功能的原因是可能是卵巢中的部分血流受损。

综上所述，本文通过网络药理学和分子对接的方法，分析了二至丸的活性成分和靶点以及疾病的重要靶点，并对其进行分析、构建作用网络及通路。关键的核心蛋白可以促使原始卵泡和卵母细胞的发育成熟，该作用是通过调节与之相关的信号通路实现的。除此之外，它还可能改善卵巢部分血流情况，该作用是通过改变卵巢内皮细胞中基因和蛋白的表达实现的。由此得出，二至丸是从多成分、多靶点和多通路的角度出发，通过彼此之间的相互协作来干预POI，以此为临床工作中二至丸治疗POI的进一步研究提供方法及理论依据。