中性粒细胞外诱捕网、纤溶酶原激活抑制剂1对早产急性呼吸窘迫综合征患儿预后的影响

张 敏 杨 立

北京市通州区妇幼保健院新生儿科，北京 101100

早产儿急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是新生儿重症监护中常见的严重并发症之一，其发病率和病死率极高，主要病理特征为细胞免疫和凝血系统异常引发肺泡膜损伤、肺水肿，导致氧合功能严重受损，严重影响早产儿的生存和发育[1]。中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）是由中性粒细胞释放的一种特殊细胞外陷阱，由游离DNA（cell free-DNA，cf-DNA）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等组成[2]。当中性粒细胞受到感染或激活时，NETs 会形成并释放，起到限制病原微生物扩散的作用。然而，过度活化的NETs 可能导致炎症反应的过度放大和组织损伤，在多种疾病中发挥着不可忽视的作用[3]。纤溶酶原激活抑制剂1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一种调节凝血和纤溶平衡的重要蛋白质，其可抑制纤溶系统的活化，导致血栓形成和肺泡膜微循环障碍，与肺细胞损伤和纤维化进程相关[4]。NETs 和PAI-1 可能参与了ARDS 的发生、发展，但二者与早产儿ARDS 的研究相对缺乏。因此，本研究旨在探究早产ARDS 患儿血浆NETs、PAI-1 的水平变化与患儿预后结局的关联，以期为临床早产儿ARDS 的诊断、个体化治疗提供新思路。

图1 cf-DNA、PAI-1 预测早产ARDS 患儿预后不良的ROC 曲线

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020 年1 月至2022 年12 月北京市通州区妇幼保健院收治的早产ARDS 患儿125 例作为研究对象（ARDS 组），其中男71 例，女54 例；胎龄28～36周，平均（30.69±3.17）周。纳入标准：①ARDS 的诊断符合《“新生儿急性呼吸窘迫综合征”蒙特勒标准（2017年版）》[5]相关标准；②胎龄28～37 周；③需行气管插管有创通气；④监护人对收集新生儿资料进行研究具有知情权。排除标准：①合并先天性血液系统疾病；②合并其他先天性呼吸系统疾病；③合并染色体异常、遗传代谢性疾病、先天性心脏病等；④合并心、肝、肾功能严重损害。本研究经北京市通州区妇幼保健院伦理委员会的审批同意（2022-TZFY-010-01）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料 收集并统计患儿的基本资料，包括性别、孕龄、Apgar 评分、出生方式、出生体重、ARDS 分级、孕妇产前激素使用情况及妊娠糖尿病情况。

1.2.2 样本采集 采集入组对象出生1 d 内静脉血2 ml，静置1 h，3 500 r/min 离心8 min（离心半径为14.5 cm），分离血浆，置于-80℃冷藏器中保存备用。

1.2.3 生化指标的检测 常温溶解样本，基于PicoGreen荧光染料法，使用荧光酶标仪测定血浆cf-DNA 水平，DNA 检测试剂盒购于美国Invitrogen 公司（货号：UA20200100595）；双抗体酶联免疫吸附试验法检测NE、TNF-α、PAI-1 水平，NE 检测试剂盒购于深圳晶美生物技术有限公司（货号：SZBD20153768），TNF-α检测试剂盒购于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司（货号：SZBD20204783），PAI-1 检测试剂盒购于上海杏宜生物科技有限公司（货号：SZBD2018034765）。

1.2.4 患儿预后监测 收集并统计患儿预后信息，预后不良定义为患儿死亡、病情无好转而转院治疗、有创通气＞10 d，其余情况为预后良好。并据此进行分组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验；相关性分析使用Pearson 检验；早产ARDS 预后不良的影响因素采用logistic 回归分析；cf-DNA、PAI-1 对早产儿ARDS 预后不良的预测价值采用受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估，曲线下面积比较采用非参数秩和检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

125 例早产ARDS 患儿预后不良47 例，预后良好78 例。

2.1 两组一般资料和生化指标比较

预后不良组cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 水平高于预后良好组（P＜0.05）。两组Apgar 评分、出生体重、ARDS 分级、分娩方式、产前激素使用、妊娠糖尿病比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料和临床资料比较

2.2 早产ARDS 患儿cf-DNA 与NE、TNF-α 的相关性

早产ARDS 患儿cf-DNA 与NE、TNF-α 呈正相关（r=0.645、0.687，P＜0.001）。

2.3 早产ARDS 患儿不良预后的影响因素

以早产ARDS 患儿预后为因变量（不良=1、良好=0），cf-DNA、NE、TNF-α、PAI-1 为自变量（原值带入）进行logistic 回归分析。结果显示，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早产ARDS 患儿预后不良的危险因素（OR=2.188、2.303，P＜0.05）。见表2。

表2 早产ARDS 患儿不良预后的影响因素

2.4 cf-DNA、PAI-1 对早产ARDS 患儿预后不良的预测效能

cf-DNA、PAI-1 联合预测早产ARDS 患儿预后不良的曲线下面积高于各指标单独预测（Z=3.272、2.229，P=0.001、0.026）。见图1、表3。

表3 cf-DNA、PAI-1 对早产ARDS 患儿预后不良的预测效能

3 讨论

ARDS 是各种肺内外因素导致的肺组织弥漫性损伤，以顽固性低氧血症、呼吸困难为主要临床特征，在小胎龄、低体重的早产儿中时有发生[6]。早产儿肺炎、胎粪吸入、围生期窒息、菌血症等导致ARDS 的肺内外因素更易发生，加之其免疫力低下、抗外界环境能力差，患儿病情难以控制、预后极差[7]。ARDS 的主要病理机制是肺泡上皮、内皮细胞受损，引起终末微血管-肺泡屏障功能不全，体液渗入肺泡中造成肺水肿，引起肺通气、换气障碍，此过程与中性粒细胞过渡活化、炎症反应过渡激活、凝血纤溶系统失衡有关[8]。cf-DNA、PAI-1 分别是中性粒细胞激活、凝血系统失衡的重要标志物，二者可能与早产儿ARDS 的发生密切相关。

当机体受病原微生物侵袭时，中性粒细胞被激活释放出一种以DNA 为基本框架且附着大量颗粒蛋白、肽类物质的网状纤维，即为NETs[9]。cf-DNA、NE是NETs 的主要成分，二者可较好地反映机体NETs水平[10]。NETs 的形成可以捕获、消灭入侵的病原微生物，但过量产生的NETs 不仅直接损伤组织细胞，还可对炎症介质和蛋白质进行招募，进而放大炎症级联反应，导致组织上皮细胞和内皮细胞凋亡[10-11]。此外，有研究发现，急性肺损伤发生时，NETs 可激活并诱导M0 亚型巨噬细胞向M1 型转换，进而导致TNF-α 过度分泌加重炎症反应，同时TNF-α 亦可促进NETs 形成，进一步加重肺组织损伤[12]。有研究发现，急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液中NETs 形成明显增加、肺组织炎症反应明显；使用DNA 降解酶干预后NETs 显著下降，且肺组织损伤减轻[13]。提示清除NETs 有助于肺组织损伤恢复。本研究结果显示，预后不良组cf-DNA、NE、TNF-α 水平高于预后良好组。提示患儿体内中性粒细胞高反应性、NETs 生成明显，且随着NETs 生成增多，患儿肺组织损害程度越明显，病情亦越重，预后越差。本研究结果显示，早产ARDS 患儿cf-DNA 水平与NE、TNF-α 水平呈正相关。进一步说明NETs 水平越高，其对肺组织的炎症损伤越重。本研究结果显示，cf-DNA 是早产ARDS 患儿预后不良的独立危险因子。提示其与患儿预后具有较好的量化关系，也间接提示NETs 是预测早产ARDS 患儿预后不良的有效标志物之一。笔者推测，早产ARDS 患儿肺组织上皮细胞、内皮细胞损伤明显，外界病原微生物入侵后，刺激中性粒细胞活化，进而释放NETs 发挥灭菌作用，但在此过程中NE、TNF-α 等炎症因子亦大量生成，进而加重肺组织细胞上皮-内皮屏障的破坏，加速肺水肿、促进ARDS 的进展，导致患儿病情加重、预后不良[10-13]。

PAI-1 属于丝氨酸蛋白酶超家族成员之一，其可抑制链激酶和尿激酶的纤溶作用，抑制体内纤溶活性、增强凝血活性，进而促进纤维蛋白的形成[14-15]。ARDS 最为显著的组织学改变为肺血管内皮细胞、上皮细胞损伤，进而导致上皮-内皮细胞屏障破坏、通透性增加，富含蛋白质的渗出液进入肺泡造成气体交换障碍[16]。早产ARDS 患儿缺氧严重，并可继发感染、酸中毒，导致血管内皮细胞和内外源凝血途径被异常激活，患儿处于高凝状态，纤维蛋白大量产生[17]。但是，ARDS 患儿血管内皮细胞破坏明显，其产生的纤溶酶降低，加之炎症反应激活巨噬细胞释放大量PAI-1，导致体内凝血-纤溶系统平衡破坏，体内大量的纤维蛋白不能被及时溶解、消除，进而大量沉积于肺微循环血管、肺泡内，引发血液循环障碍、肺组织血气交换障碍，加重患儿病情[18-19]。此外，有研究证实，PAI-1 还可通过NF-κB 信号通路诱导小鼠肺组织炎症反应，进而加重小鼠肺纤维化程度[20]。本研究结果显示，预后不良组PAI-1 水平高于预后良好组，且可对患儿不良预后进行独立预测。提示PAI-1 可反映早产ARDS患儿病情及预测患儿预后，原因在于早产ARDS 患儿体内处于高凝状态，纤维蛋白大量形成，PAI-1 的异常释放抑制链激酶和尿激酶的纤维蛋白溶解作用，导致机体纤溶活性降低、凝血活性增高，最终导致大量纤维蛋白沉积于肺泡中而形成透明膜，加重患儿病情、引发患儿预后不良[21-25]。

本研究结果显示，cf-DNA 和PAI-1 对早产预测效能ARDS 患儿不良预后具有较好的预测效能，且二者联合进一步提升预测效能，进一步证实二者可指导临床及早评估早产ARDS 患儿病情，预测不良预后，并可据此及时制订有效干预措施。

综上所述，cf-DNA、PAI-1 水平升高是早产儿ARDS 患儿预后不良的危险因素，二者联合检测对患儿的预后具有较高的预测效能，二者有望成为评估患儿病情及预后的可靠指标。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。