血清TGR5 mRNA和BNIP3 mRNA在急性心肌梗死患者中的表达水平及临床意义

金长明,王 青

1.首都医科大学门头沟教学医院急诊科,北京 102399;2.应急总医院内科,北京 100028

急性心肌梗死(AMI)是一种严重的心脏病,通常由冠状动脉急性闭塞、持续性缺血缺氧而引起心肌坏死。AMI起病急骤,是心血管疾病患者死亡的主要原因之一[1-2]。进行经皮冠状动脉介入术(PCI)可有效降低AMI患者的病死率,在临床得到广泛应用,但由于PCI术属于创伤性操作,术后可能造成局部炎症或缺血再灌注损伤,导致患者出现不良心血管事件(MACE),进而威胁患者的身心健康[3-4]。因此,寻找能够预测AMI患者经PCI术后的预后生物标志物十分重要。G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)是一种G蛋白偶联胆汁酸膜受体,具有多种生物活性,主要参与糖脂代谢以及能量代谢,激活TGR5对于肥胖以及炎症等疾病均有改善作用[5]。Bcl-2/腺病毒QE1B-19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)主要存在于线粒体内膜上,有研究表明BNIP3参与癌症和缺血性疾病的生理和病理过程[6]。目前,关于TGR5与BNIP3在AMI疾病中的表达水平鲜有报道,因此本研究通过探讨二者在AMI患者中的表达水平情况以及二者对于AMI患者术后MACE发生的预测价值,以期为AMI患者术后发生MACE人群的筛选提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取首都医科大学门头沟教学医院(下称本院)2018年1月至2020年1月收治的98例进行PCI手术的AMI患者[包括急性非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)46例与急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)52例]为研究组,其中男46例,女52例,年龄60～80岁,平均(71.00±8.35)岁。所有患者经PCI手术后,通过门诊方式进行随访24个月,随访率为100%,随访期间出现心肌梗死、新发心力衰竭、心源性猝死等心血管事件及全因死亡可判断为MACE,根据随访结果将患者分为MACE组(46例)、非MACE组(52例)。纳入标准:(1)符合AMI诊断标准[7];(2)年龄>18岁;(3)临床资料完整;(4)依从性良好;(5)患者首次确诊,且未使用脑梗死药物治疗。排除标准:(1)合并有恶性肿瘤者;(2)有心肌病,先天性心脏病者;(3)伴有严重肝、肾功能不全者;(4)既往进行PCI者。另选取同期于本院健康体检的90例体检健康者作为对照组。其中男47例,女43例,年龄60～79岁,平均(70.00±8.64)岁。两组研究对象性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已通过本院伦理委员会批准,患者知情同意后并签署同意书。

1.2主要试剂与仪器 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪购自美国Bio-Rad公司(型号:CFX384);TRIzol试剂购自上海佰利莱生物科技有限公司(货号:BLL-Bytd0054);qRT-PCR试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司(货号:23444);M-MLV逆转录试剂盒购自北京普非生物科技有限公司(货号:PR2555)。

1.3血清TGR5 mRNA和BNIP3 mRNA水平检测 采集AMI患者入院后清晨空腹静脉血3 mL,健康体检者体检当日清晨空腹静脉血3 mL,8 000 r/min离心5 min收集上清液,置于-80 ℃冰箱内保存。应用Trizol试剂提取血清样本中的总RNA,总RNA为模板逆转录成cDNA后进行qRT-PCR反应,反应体系包括:cDNA 1 μL,上、下游引物各1 μL,2×SYBR 11.5 μL,ddH2O 8.5 μL,于冰上完成整个操作过程。qRT-PCR检测条件:94 ℃预变性5 min循环1次,94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,共38个循环。以β-actin为内源对照,以2-ΔΔCt的方法计算血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA的相对表达量。引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成,引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4术后MACE组和非MACE组临床资料收集 收集AMI患者MACE组和非MACE组临床资料,包括:年龄、吸烟史、糖尿病史、高血压史、血清肌酐(SCr)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末容量(LVEDV)、红细胞分布宽度(RDW)、血红蛋白(Hb)、白细胞计数(WBC),以及他汀类、替格瑞洛药物使用情况等,根据Killip分级标准[8]将患者分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。

2 结 果

2.1研究组与对照组血清TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA表达水平比较 研究组血清TGR5 mRNA表达水平显著低于对照组,血清BNIP3 mRNA表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 研究组与对照组血清TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA水平比较

2.2AMI患者术后MACE组和非MACE组TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA表达水平及临床资料比较 AMI患者术后MACE组与非MACE组在年龄、吸烟史、糖尿病史、高血压史、LDL-C、HDL-C、LVEDV、舒张压、收缩压、Hb、WBC等方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后MACE组SCr、LVEF、RDW、Killip分级、TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA与非MACE组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中MACE组LVEF、TGR5 mRNA显著低于非MACE组,SCr、RDW、Killip分级(Ⅲ+Ⅳ级比例)、BNIP3 mRNA显著高于非MACE组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 AMI患者术后MACE组和非MACE组TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA水平及临床资料比较[n(%)或

2.3术后MACE组血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA表达水平的相关性 经Pearson相关性分析,血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.543,P<0.05),见图1。

图1 术后MACE组血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA 水平的相关性

2.4血清TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA对术后AMI患者MACE发生的预测价值分析 ROC曲线显示,血清TGR5 mRNA预测AMI患者MACE发生的AUC为0.704(95%CI:0.601～0.808),截断值为0.803;血清BNIP3 mRNA预测AMI患者MACE发生的AUC为0.762(95%CI:0.696～0.883),截断值为1.396,血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA 联合预测AMI患者术后MACE发生的AUC为0.867(95%CI:0.783～0.932)优于二者单独预测(Z二者联合-TGR5=2.346,Z二者联合-BNIP3=1.715,P=0.019、0.043),见图2。

图2 ROC曲线分析血清TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA对 术后AMI患者MACE发生的预测价值

2.5AMI患者术后MACE发生的影响因素 以AMI患者血清TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA、RDW、LVEF、SCr均值0.78、1.26、14.04%、61.62%、72.21为截点,将连续变量转化为二分类变量,其中TGR5 mRNA≥0.78为高表达,<0.78为低表达;BNIP3 mRNA≥1.26为高表达,<1.26为低表达,RDW≥14.04 %为高表达,RDW<14.04 %为低表达,以LVEF≥61.62 %为高表达,<61.62 %为低表达,以SCr≥72.21为高表达,<72.21为低表达。以AMI患者术后MACE是否发生为因变量(是=1,否=0),以TGR5 mRNA(低表达=1,高表达=0)、BNIP3 mRNA(高表达=1,低表达=0)、RDW(高表达=1,低表达=0)、LVEF(低表达=1,高表达=0)、SCr(高表达=1,低表达=0)、Killip分级(Ⅲ+Ⅳ级=1,Ⅰ+Ⅱ级=0)为自变量进行Logistic回归分析,结果显示TGR5mRNA、BNIP3 mRNA、RDW是AMI患者术后MACE发生的影响因素(P<0.05),见表4。

表4 AMI患者术后MACE发生的影响因素

3 讨 论

AMI是一种常见的心血管疾病,其具有发病突然,病情发展迅速,致死率高等特点[9]。

有研究显示,急诊PCI目前被认为是最有效的AMI治疗手段,入院早期90 min内对AMI患者进行介入治疗可将病死率降至4%左右,且急性介入治疗后冠脉血管再通率更高也更稳定。虽然PCI术很好地解决了血管形成问题,但AMI患者仍存在较高的再发心血管事件风险,因此发现血清标志物预测AMI患者的术后效果十分重要[10-11]。

TGR5对于全身炎症以及肝脏炎症有负向调节的功能,有研究发现在巨噬细胞与单核细胞中,刺激TGR5的表达水平能够降低趋化因子和细胞因子分泌,减弱吞噬细胞功能,从而促进细胞产生抗炎作用[12]。TGR5被激活后可通过多种不同的信号通路来发挥其生物学功能,其中可通过抑制核因子-κB(NF-κB)的炎症反应以及炎症因子的分泌发挥抗炎作用[13]。动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病的常见疾病,有研究发现激活TGR5可以抑制AS的发生,而其表达缺失则可加重AS的发展[14]。线粒体自噬能够以不同的方式调节心血管活动,参与AS、心力衰竭、心肌缺血/再灌注损伤等疾病的生理过程[15-16]。BNIP3的过表达能够使线粒体被过量清除,加重心肌细胞的负担,造成心肌缺血再灌注损伤[17]。其在低氧条件下能够调节免疫细胞的功能,促进炎症的发生和发展[18]。由于血清中的mRNA来自于细胞内的转录过程,当细胞中的目的基因被转录成mRNA分子时,这些分子可以通过细胞内的RNA加工或运输机制进入血液循环系统,最终进入血清,血清中的mRNA表达水平可能反应细胞内和细胞外环境的综合影响[19],因此本研究检测AMI患者血清TGR5 mRNA和BNIP3的mRNA表达水平,结果显示AMI患者血清TGR5 mRNA表达水平明显降低,且术后MACE组血清TGR5 mRNA表达水平显著低于非MACE组,BNIP3 mRNA表达水平明显升高,且在术后MACE组中血清BNIP3 mRNA表达显著高于非MACE组,提示TGR5 mRNA的低表达和BNIP3 mRNA的高表达与AMI的发生及术后MACE有关,但具体作用机制目前尚不清楚。

RDW能够反映人体内血液循环红细胞体积的差异,近年来研究发现RDW能够预测心衰患者的短期及长期预后[20]。本研究发现RDW是AMI患者术后MACE发生的影响因素,提示RDW与AMI患者预后的不良反应有关。BYRMES等[21]研究发现TGR5与BNIP3通过调控线粒体自噬机制参与肝损伤过程,而本研究Pearson相关性分析显示,血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA水平呈负相关(r=-0.543,P<0.05),提示TGR5与BNIP3也可能通过某种调控机制参与AMI患者术后MACE的发生;ROC曲线显示,血清TGR5 mRNA与BNIP3 mRNA联合预测AMI患者术后MACE发生的AUC优于二者单独预测,提示二者联合能够较好地预测AMI患者术后MACE发生,进一步Logistic回归分析显示,TGR5 mRNA、BNIP3 mRNA是AMI患者术后MACE发生的影响因素,提示二者可作为评估AMI患者术后MACE发生的生物检测指标。

综上所述,TGR5 mRNA在AMI患者血清中呈低表达,BNIP3 mRNA在AMI患者血清中呈高表达,二者对于预测术后MACE发生具有重要意义,但血清中TGR5 mRNA和BNIP3 mRNA表达水平与特定组织间的靶向关系本研究还需继续深入探究,并进一步探究二者在心肌梗死中的具体作用机制。