基于银纳米三角片蚀刻机制区分不同产地浓香型白酒

2024-05-12贾俊杰张宿义黄张君王松涛佘远斌

食品工业科技 2024年10期

贾俊杰，张宿义，许涛，马龙，黄张君，王松涛，佘远斌

（1.泸州品创科技有限公司/国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；3.浙江工业大学化学工程学院，浙江杭州 310014）

浓香型白酒也称为泸型酒，是中国最受欢迎的白酒香型之一，市场占有量近70%[1]。浓香型白酒按酿造原料划分为两类，一类是单粮型，以泸州老窖为代表，一类为多粮型，以五粮液为代表。浓香型白酒产品种类丰富，产地分布较广，其中四川、安徽、江苏是浓香型白酒最主要的产区，尤以四川产量最大，优质酒品最多[2]。不同产地的浓香型白酒由于酿造原料、发酵工艺、地理环境、勾调技术等方面的差异，其风味特点存在多样性，也使得产品品质参差不齐，这就给浓香型白酒的品质控制带来很大挑战，也给产品市场提供了掺杂掺假的可能。因此，浓香型白酒的产地区分和鉴别对于产品质量监管和消费者权益保护具有重要意义。

近十年来陆续有报道采用不同方法和技术手段结合化学计量学方法用于不同种类白酒的区分和鉴别，包括色谱质谱技术[3-4]，如顶空固相微萃取-质谱（HS-SPME-MS）[5-6]、气相离子迁移谱（GC-IMS）[7]、气相色谱-质谱（GC-MS）[8-10]、全二维气相色谱飞行时间质谱（GC×GC-TOF-MS）[11]；光谱技术，如近红外、中红外光谱技术（NIR）[12-14]结合主成分分析、偏最小二乘判别等数据分析方法。色质谱和光谱法存在复杂费时或灵敏性较低及数据处理复杂等问题，而光学电子鼻和电子舌由于其简便快速灵敏及易实现便携化的优点近年来用于各种酒类的鉴别研究。如Suslick 团队以不同染料分子作为色敏材料对不同品牌蒸馏酒的比色传感识别[15-16]，Bunz 团队以荧光分子作为传感材料用于白葡萄酒[17]、白兰地[18]、威士忌[19]等酒精饮料的区分，国内也有学者基于电化学法和荧光传感法对不同白酒区分进行了研究[20-21]。这类比色和荧光传感方法大大简化了操作程序，提高了灵敏度，然而其便捷性、稳定性和选择性还相对较低等问题尚未得到良好解决。

局域表面等离子共振（LSPR）是基于贵金属纳米颗粒受到入射光激发引起表面电子共振的光学性质，LSPR 吸收对纳米粒子大小、形貌、表面修饰及周围介质高度敏感[22-23]，本课题组前期已报道基于金纳米粒子形貌和表面修饰引起LSPR 性质变化的机制用于不同香型和不同等级白酒的区分和识别研究[24-25]。银纳米三角片（AgNPRs）由于边缘/尖端的高反应性，容易被氧化剂等蚀刻为圆形，导致SPR 出现蓝移[26-28]。基于该机制，Li 等[29]报道了不同金属离子通过调节AgNPRs 蚀刻变化用于区分不同种类的白酒。这种具有边缘尖端的AgNPRs 不仅会因蚀刻剂不同而引起形貌不同程度的变化，而且本身不同的形貌大小也具有不同的LSPR 性质，所以蚀刻剂的不同和AgNPRs 形貌大小的差别均可作为引起差异化响应信号的阵列构建策略，基于蚀刻剂和AgNPRs形貌变化差异的传感阵列拓展策略并未用于品类繁多的浓香型白酒的产地鉴别研究。

本研究中通过合成四种不同形貌大小的AgNPRs作为传感元件，以两种不同价态的金属离子和氧化性阴离子（Fe2+、Fe3+、BrO3¯）作为蚀刻剂构建4×3 比色传感阵列，以不同产地浓香型白酒作为研究对象，通过蚀刻剂与白酒微量成分之间化学作用引起蚀刻环境的变化造成银纳米粒形貌的不同，产生不同白酒样品各自不同的颜色变化，从而进一步用于区分不同产地浓香型白酒。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浓香型白酒样品共采集41 个，包括四川产地21 个样品，江淮产地13 个样品，以及北方产地7 个样品，其中泸州老窖酒样由泸州老窖股份有限公司提供，其它白酒样品购自白酒专卖店，具体样品信息见表1～表3；硝酸银（AgNO3）、硼氢化钠（NaBH4）、柠檬酸三钠、溴酸钾（KBrO3）、氯化铁（FeCl3）、氯化亚铁（FeCl2）分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚苯乙烯磺酸钠（PSS）MW70000 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；L-抗坏血酸（AA）分析纯，萨恩化学技术（上海）有限公司。

表1 四川产地浓香型白酒样品信息Table 1 Detailed information on SAB samples of Sichuan origin

表2 江淮产地浓香型白酒样品信息Table 2 Detailed information on SAB samples of Jianghuai origin

表3 北方产地浓香型白酒样品信息Table 3 Detailed information on SAB samples of Northern origin

U3900 紫外可见光光谱仪日本HITACHI 公司；JEM-2100F 高分辨率透射电子显微镜日本日本JEOL 公司；D750 数码相机日本尼康公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AgNPRs 材料制备银纳米三角片（AgNPRs）根据Aherne 等[30]报道的种子液介导的两步还原合成方法进行制备。

银种子液制备：柠檬酸三钠溶液（5 mL，2.5 mmol/L）作为封盖剂、聚苯乙烯磺酸钠（PSS）（0.25 mL，500 mg/L）作为表面活性剂、和新配制的还原剂NaBH4溶液（0.3 mL，10 mmol/L）混合于50 mL样品瓶中，然后在磁力搅拌条件下以2 mL/min的速率逐滴加入AgNO3溶液（5 mL，0.5 mmol/L）后形成银纳米种子液。其中，PSS 在实现纳米片尺寸和形状的均匀性方面起着关键作用。

生长液制备：抗坏血酸溶液（75 μL，10 mmol/L）作为弱还原剂与5 mL 去离子水和不同量（600、400、200、90 μL）的银种子液混合，然后以1 mL/min速率逐滴加入AgNO3溶液（3 mL，0.5 mmol/L）后形成银纳米三角片溶液。种子液的添加量决定着所生长的银纳米片的形貌大小。随着种子液添加量的增加，所形成的银纳米片溶液的表面等离子共振吸收峰逐渐红移，伴随着不同的颜色变化。银纳米片合成后，加入柠檬酸三钠溶液（0.5 mL，25 mmol/L）以对银纳米溶液起进一步的稳定作用。

1.2.2 AgNPRs 传感阵列制备 AgNPRs 比色传感阵列由四种不同形貌的AgNPRs 在不同蚀刻剂存在条件下（如KBrO3、FeCl2、FeCl3）组成。传感组件加样顺序为AgNPRs（50 μL）、水（50 μL）、KBrO3（10 μL，5 mmol/L）/FeCl2（10 μL，2.5 mmol/L）/FeCl3（10 μL，5 mmol/L）、酒样（10 μL），以52%vol 乙醇作为对照。图像在反应10 min 后通过数码相机获取。所有的比色实验均在96 孔板中进行。

1.2.3 图像采集方法图像采集方法参考文献[24]报道的方法。反应10 min 后用配制EFS 18-135 mm变焦镜头的EOS 750D 相机进行拍照。96 孔板放置在15 瓦LED 平板灯上，96 孔板周边用黑布进行遮光，整个拍照过程均在暗室条件下进行。相机设置参数为曝光速度为1/125 s，光圈设置为f/11，感光度为ISO 400。

1.3 数据处理

RGB 数据提取：采用Adobe Photoshop CC2019提取图片每个反应孔中心点的R、G、B 值，RGB 值与对照之间的差值（ΔRGB）作为比色响应值，每组实验重复3 次，三次实验的ΔRGB 及其均值用于统计学数据分析，ΔRGB 均值放大4 倍生成的色差图用于比色可视化展示，欧氏距离（EDs）=用于表示AgNPRs 比色反应颜色变化值。

统计学数据分析方法：基于ΔRGB 的初始数据矩阵在Excel 2019 中进行整理。主成分分析（PCA）采用MATLAB 2018 内置的函数进行数据处理。线性判别（LDA）采用SYSTAT 13.2 进行数据运算，所有的变量采用完全模式，且公差设置为0.001，计算每个样品数据到组质心的马氏距离，根据最短马氏距离用于各样品数据的分类，采用刀切法交叉验证计算判别准确率。PCA 和LDA 数据处理结果采用内置有置信椭圆插件的Origin 2021 进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 AgNPRs 传感阵列构建原则

AgNPRs 边缘/尖端具有良好的折射率、灵敏度以及局域电场增强，赋予其独特的LSPR 性质，这种性质随其形貌大小的变化而不同。由于其边缘或尖端容易受到氧化剂的氧化而导致AgNPRs 发生蚀刻从而引起形貌的变化，这一蚀刻过程很容易受到反应环境的影响。白酒是一种复杂基质，含有非常丰富的化合物，不同种类的白酒所含化合物的种类和含量存在差异。当AgNPRs 蚀刻反应处于白酒微环境条件下时，会由于不同白酒之间的差异导致其蚀刻程度的不同，引起不同的LSPR 效应，从而伴随有不同的颜色变化。当AgNPRs 形貌大小不同时，由蚀刻效应引起LSPR 性质的变化也会不同。基于此，本研究合成了四种不同形貌大小的AgNPRs，选用了两种不同价态的金属离子（Fe2+、Fe3+）以及一种氧化性阴离子（BrO3¯）作为蚀刻剂构建一种传感组件为4×3 的比色传感阵列，比色响应机制如图1 所示。

图1 基于银纳米三角片蚀刻机制的比色传感阵列用于浓香型白酒识别研究示意图Fig.1 Illustration of colorimetric sensor array for discrimination of SAB based on etching of triangle Ag nanoprism

2.2 AgNPRs 材料表征

合成不同形貌均匀大小的AgNPRs 是构建比色传感阵列的关键策略之一，本研究合成了四种大小不一的AgNPRs。通过TEM 表征，显示了四种不同大小三角形状的银纳米片，即AgNPRs-a、AgNPRs-b、AgNPRs-c、AgNPRs-d，银纳米片的大小以三角边长计，平均长度分别为55.0、38.7、30.6、22.7 nm。紫外可见光光谱（UV-vis）显示了其因形貌大小不同从而具有不同的等离子吸收峰，典型的特征峰波长分别为655、590、528、499 nm（图2）。

图2 四种不同形貌AgNPRs 的UV-vis 光谱以及TEM 图像Fig.2 UV-vis spectra and TEM images of synthesized four kinds of AgNPRs

2.3 AgNPRs 传感阵列反应体系优化

为获得比色传感阵列较高的比色信号RGB 值变化，本研究对氧化反应条件进行了优化。由于构建传感阵列的基本原则是基于蚀刻效应，所以蚀刻反应试剂的浓度优化至关重要。图3 所示，随着蚀刻剂KBrO3/FeCl2/FeCl3添加量的增加，欧氏距离所反映的颜色变化值呈现逐渐增加的趋势，这是由于AgNPRs 形貌发生变化所致。为了探究白酒样品对这种蚀刻作用的影响，选取了每种蚀刻剂颜色发生明显变化前的浓度来探究白酒对该蚀刻剂蚀刻效果的影响。据此，在三个反应体系（均为120 μL）中三种蚀刻剂的添加量分别为10 μL 10 mmol/L KBrO3、10 μL 5 mmol/L FeCl2和10 μL 10 mmol/L FeCl3。

图3 不同浓度KBrO3、FeCl2、FeCl3 添加量对四种不同大小AgNPRs 蚀刻的比色响应及欧氏距离变化曲线Fig.3 Colorimetric response and Euclidean distances curve of addition amounts of different concentrations of KBrO3,FeCl2,and FeCl3 to etch AgNPRs with different sizes

2.4 反应机理验证

不同形貌大小的AgNPRs 其蚀刻机理相同，为进一步验证白酒对这种传感机制的影响，以四种形貌大小适中的AgNPRs-b 为例，以LZ-6 为代表样品，进行了UV-vis 和比色实验。如图4 所示，当加入三种蚀刻剂和52%乙醇之后，AgNPRs-b 吸收峰没有明显变化。当加入LZ-6 后，波峰明显降低，且发生一定程度的蓝移，说明在反应体系中三角银的尖端逐渐变钝，同时颜色从紫红色变为黄色或粉色。不同的是，在FeCl3体系中320 nm 左右的吸收峰明显增高，这可能是由于加入Fe3+生成不同的氧化产物引起。白酒中含有多种有机酸，因此白酒溶液为酸性体系，大多数白酒处于pH3.5～4.5 范围内。银纳米三角片蚀刻属于氧化还原反应过程，在氧化性离子存在的情况下，纳米银逐渐被氧化为银离子，当处于酸性条件时会促进这一氧化反应的进行。因此，白酒中最为重要的呈味物质有机酸对纳米银的蚀刻过程起着关键作用。另外，白酒是各种风味物质不断发生相互作用的平衡体系，含量较多的酯类和醇类的种类和含量的不同也会在一定程度上影响银蚀刻效应。

图4 不同反应剂组合的UV-vis 光谱及比色反应Fig.4 UV-vis spectra of different reaction systems and corresponding colorimetric image

为进一步直观地证明在白酒样品存在条件下蚀刻剂对AgNPRs-b 形貌的影响，以LZ-3 和LZ-5 为例，通过TEM 对加入两种不同白酒样品后AgNPRs-b 形貌的变化进行观察。如图5 所示，在Fe2+蚀刻体系中加入不同白酒样品AgNPRs-b 形貌发生了不同程度的变化，加入LZ-3后AgNPRs-b 形貌变化不太明显，但加入LZ-5 后AgNPRs-b 的尖端逐渐被钝化为圆形，证实了在同一反应体系中不同白酒样品促进了不同程度的蚀刻效应。

图5 不同酒样对AgNPRs-b 蚀刻形貌的影响Fig.5 Effects of different Baijiu samples on morphology of AgNPRs-b etching

2.5 不同产地浓香型白酒识别

为了验证基于AgNPRs 传感阵列用于白酒的识别性能，本研究以不同浓香型白酒样品作为研究对象进行比色响应测试。由于传感元件的构建是基于氧化反应引起的银纳米蚀刻机制，因此，氧化性的不同所诱导的蚀刻效应也会不同。银较易被氧化，很多具有氧化性的离子均可以氧化纳米银为银离子，本研究中选取了常见三种具有不同氧化性的离子（BrO3-＞Fe3+＞Fe2+）作为蚀刻剂用于构建比色传感阵列。另外，同一氧化剂对不同形貌大小的AgNPRs 产生的蚀刻效应也会存在明显差异。在本研究中选取了四种不同形貌大小的AgNPRs-a、b、c、d 为传感材料，KBrO3、FeCl2、FeCl3作为蚀刻剂，构建4×3 比色传感阵列，分别作为阵列1、2、3。该阵列进一步与41 种来自不同产地、不同品牌、不同等级的浓香型白酒进行比色响应，图6A 显示了3 种阵列在加入不同浓香型白酒样品之后的比色响应图，图6B 则是白酒样品与52%vol 乙醇对照之间的ΔRGB 差值形成的可视化色差图。从色差图可以看到，尽管绝大部分浓香型白酒具有同样的酒精度，然而却表现出每种白酒样品各自特定的色差模式，说明色差模式之间的差异由各白酒样品含有不同种类和含量的微量成分差异引起，甚至对于同一品牌之间的样品也会由于这种差异导致不一样的色差模式。其中，阵列1 由于KBrO3较强的氧化性产生了明显的颜色变化。Fe3+和Fe2+的氧化性与BrO3-相比相对较弱，产生了较弱的比色响应，但由于二者氧化性之间的差异，阵列2 和阵列3的比色响应之间仍显示了一定的差异性。这种基于蚀刻剂和纳米银形貌差异构建的比色传感阵列显示了用于识别不同种类白酒的潜力。

图6 比色传感阵列对三大产地共41 种浓香型白酒的比色响应Fig.6 Colorimetric sensor array response to 41 kinds of SAB samples of three origins

首先采用无监督的PCA 对三种比色传感阵列色差模式进行分析，如图7A 所示，PCA 结果显示三大产区的样品较为分散，没有明显的聚类趋势，但可以看到对于每个样品的4 个重复数据均可以聚一起，说明每个样品的重复性较好。进一步采用了有监督的LDA 方法进行交叉判别分析，单个阵列显示了较低的区分性能，阵列1、阵列2 和阵列3 对三大产地酒样的判别率分别为76%、84%、82%，将三个阵列组合后可以显著提高其区分性能，如图7B 显示，三大产区样品能够明显聚到一起，交叉判别准确率可达到99%，仅有川派的两个样品数据被错判到了江淮派。

图7 阵列1/2/3 对三大产区浓香型白酒的PCA 和LDA 得分图Fig.7 PCA and LDA canonical score plots of SAB samples of three origins obtained with the combined Array1/2/3

进一步对四川和江淮两大主要浓香型白酒产区不同品牌酒样进行了LDA 分析。首先采用单一阵列对两大产区进行了分析，结果显示阵列1、阵列2 和阵列3 对川派不同品牌浓香酒样的交叉判别率分别为94%、83%、79%，尽管阵列2 和阵列3 显示了相对低的判别率，但当二者组合后，区分性能明显增加，判别可达98%。当三种阵列进行组合后，交叉判别率可达99%。同样，阵列1、阵列2 和阵列3 对江淮派不同品牌浓香酒样的交叉判别率分别为90%、90%、96%，尽管阵列1 信号最为明显，但阵列3 的数据显示了对于江淮派样品之间更大的差异，当阵列两两组合和三种组合后，对于江淮派样品的判别率均为100%。图8 显示了三种阵列组合对川派和江淮派样品的LDA 分析图。另外，选取了15 个浓香型白酒未知类别的样品共60 个样品数据进行外部验证，根据最短马氏距离将未知类别的样品分配到训练模型确定的相应组别中，对于三大产地的预测分类准确率可达98%，表4 显示了不同阵列对于不同类别样品的交叉判别率以及预测准确率。

图8 组合阵列对川派和江淮派浓香型白酒样品的LDA标准得分图Fig.8 LDA canonical score plots of SAB samples of Sichuan and Jianghuai origins obtained with the combined array1/2/3

表4 Jackknifed 分类判别和未知样品验证Table 4 Jackknifed classification matrix and unknown sample identification obtained from LDA

同一厂家也存在不同等级品质的产品，因此对于不同等级白酒的区分有利于企业对于产品的质量监控。如图9 所示，采用单个阵列1 即可对10 个厂家各自不同等级的浓香型白酒进行明显区分，Jackknifed 分类判别率可达100%，进一步验证了该传感策略对于具有相似风味特征的不同等级产品良好的区分性能。

图9 传感阵列1 对5 种川派浓香型白酒样品的LDA 得分图Fig.9 LDA canonical score plots of 5 kinds of Sichuan SAB samples obtained with the array1

3 结论

本研究基于AgNPRs 蚀刻机制，采用四种不同形貌大小的AgNPRs 在三种不同氧化剂条件下构建比色传感阵列，对不同产地不同品牌以及不同等级的41 种浓香型白酒样品进行了比色响应，研究证实白酒样品对这种比色响应起到一定促进作用。采用LDA 模式判别方法组合阵列对三大产地浓香型白酒样品的区分判别率可达到99%，对川派和江淮派不同厂家浓香型白酒的判别率分别可达99%和100%，即便同一厂家不同等级产品采用单一阵列即可实现100%的判别率。这种基于纳米蚀刻机制对不同种类白酒进行区分的方法策略不仅适用于浓香型白酒，也可用于其它各种香型白酒。在今后的研究中可通过修饰或调控纳米粒子的形貌进一步提高其精准度，为白酒行业实现质量智能化和模块化控制提供研究基础和方法借鉴。