抑霉唑、咪鲜胺及其代谢物在荔枝贮藏保鲜中的残留动态及安全评价

2024-05-12吴静娜韦璐阳邓有展时鹏涛李今朝杨秀娟

食品工业科技 2024年10期

吴静娜，韦璐阳，邓有展，时鹏涛，李今朝，杨秀娟

（广西壮族自治区亚热带作物研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（南宁），农业农村部亚热带果品蔬菜质量监督检验测试中心，农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室，广西南宁 530001）

荔枝长时间保存和长距离运输一直是个未解的难题。荔枝在常温不做任何保鲜处理情况下，不超过3 d 将褐变腐烂，较短的保鲜期也限制了荔枝的远距离运输、销售和消费[1]。有研究表明，通过蛋白类多糖膜[2]、改性微球[3]和改性气调包装[4]等物理方式可以适当延长荔枝保鲜期。但实际生产中，由于缺乏完善的采收、贮藏以及运输保鲜体系[5]，大部分远销的荔枝保鲜仍然依靠化学保鲜方法为主或冷链辅助运输，在此过程中使用的保鲜剂种类、剂量及其在贮运环节的污染水平仍缺乏数据支撑。

咪鲜胺是一种广谱、高效、低毒的新型咪唑类杀菌剂，对青霉病[6]、炭疽病[7-9]、褐腐病[10]等水果贮藏期病害有明显的防治效果。抑霉唑是一种内吸性杀菌剂，对侵袭水果和蔬菜的许多真菌病害都有防效，能减缓、防治采后水果腐烂[11]。咪鲜胺在环境中的最终代谢产物为2,4,6-三氯苯酚，它是美国环保署列出的2B 类致癌物之一[12]，生物降解性差，易造成环境污染，对人体健康存在潜在威胁。抑霉唑主要代谢产物为咪唑乙醇，属于刺激性的有害化合物，吞食有害。抑霉唑和咪鲜胺是农业行业标准NY/T 1530-2007《龙眼、荔枝产后贮运保鲜技术规程》[13]中规定的保鲜用药，其中抑霉唑未在荔枝上登记，而登记用药咪鲜胺在荔枝上的用法仅为采收前喷施使用。邓义才等[14]研究了多菌灵、抑霉唑、咪鲜胺三种杀菌剂在荔枝贮藏过程中的残留动态，发现质量安全风险随着浸泡浓度增大而增大。李奕星等[15]发现芥末精油微胶囊结合咪鲜胺比单独使用微胶囊更能改善荔枝的贮藏品质。目前，抑霉唑和咪鲜胺在水果上的保鲜应用研究主要集中于防治机理[16]、贮藏效果[17-18]、消解动态及风险评估[19-22]等，咪鲜胺和抑霉唑及其代谢产物在荔枝贮藏过程中的消解转化情况和健康风险评价尚未见系统报道。我国国家标准GB2763-2021[23]规定了咪鲜胺的总量包括咪鲜胺及2,4,6-三氯苯酚，暂未对抑霉唑及其代谢物总量作出明确规定，这与美国要求的抑霉唑残留量包括抑霉唑及其代谢物的总和尚有差异，国内涉及抑霉唑代谢产物咪唑乙醇的分析检测方法也鲜有报道。因此，亟需建立检测方法用于开展荔枝保鲜剂残留、消解动态及摄入风险研究。

抑霉唑和咪鲜胺常用的检测方法有液相色谱法[24]、液相色谱-串联质谱法[25-26]、气相色谱-串联质谱法[27-28]。本研究采用GC-MS/MS 技术，建立同时测定抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚的分析方法，阐述其在荔枝保鲜中的残留规律及代谢产物积累情况，明确膳食风险隐患，为荔枝保鲜安全合理使用农药提供依据，也为建立完善的荔枝贮运保鲜体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桂味荔枝广西钦州市灵山县新光农场提供，2022 年6 月采收，八成熟；咪鲜胺乳油 250 g/L，苏州福美实植物保护剂有限公司；抑霉唑水乳剂有效成分20%，江苏剑牌农化股份有限公司；咪鲜胺、抑霉唑标准品 100 mg/L，国家环境保护监测研究中心；2,4,6-三氯苯酚、咪唑乙醇标准品 100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯色谱纯，美国赛默飞公司。

TRACE1300-TSQ9000 气相色谱-质谱仪配有电子轰击（EI）离子源及Chromeleon 7.0 分析软件，美国Thermo Scientific 公司；SIGMA-3K30 型冷冻离心机德国Sigma 希格玛离心机公司；氮吹仪美国Organomation 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荔枝中抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚的消解残留试验试验参照NY/T 788-2018《农药残留试验准则》[29]进行。

1.2.1.1 预冷选择成熟度约8 成熟的桂味荔枝，于晴天清晨采收后立即运回实验室，选择无机械伤害的果实，剪枝保留果蒂。采用冰水快速预冷，将荔枝浸泡于冰水2 min 后捞出沥干水分，以排除果实自身带来的田间热和呼吸热[30]。

1.2.1.2 残留动态试验共设空白（清水浸泡），250、500 mg/L 咪鲜胺，250、500 mg/L 抑霉唑5 个处理组，每个处理设3 个重复。其中，250 mg/L 参考柑橘浸果保鲜推荐低剂量；500 mg/L 为推荐高剂量，也是NY/T 1530-2008[13]规定的荔枝防腐处理浓度。将预冷沥干水分的荔枝果实，分别按上述处理浓度浸果1 min 后晾干果实[13]，再用聚乙烯薄膜袋按采样间隔期分装；然后放入温度为 3～5 ℃，湿度为80%～90%的冷藏库中贮藏。采样期设置为：2 h、1、3、5、7、14、21、30、35、40 d。取样时按果皮、果肉和全果（去核，计算时将果核重量折算成全果）分别制样，切碎匀浆装入聚乙烯塑料瓶，于-20 ℃冷冻贮存，待测。

1.2.1.3 最终残留试验试验共设250、500 mg/L 咪鲜胺浸泡1 次和250、500 mg/L 抑霉唑浸泡1 次4 个处理，每次浸果时间为1 min，每个处理设3 个重复。处理后的果实用聚乙烯薄膜袋按设置的采样间隔期分装并贴上标签，放入温度为3～5 ℃、湿度为80%～90%的冷藏库中贮藏。分别于14、21 和30 d采集荔枝样品，测定农药残留量。样品制备方法与消解动态试验相同。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 样品预处理分别称取10.0 g 荔枝全果、果皮和果肉样品于塑料离心管中，加入10 mL 乙腈和萃取盐包，加入陶瓷质子振荡1 min，于4200 r/min离心5 min。吸取6.0 mL 上清液加到内含900 mg硫酸镁及150 mg PSA 的离心管中，涡旋混匀后4200 r/min 离心5 min，准确吸取2.0 mL 上清液于试管中，40 ℃水浴氮吹至近干。加入1.0 mL 乙酸乙酯复溶，过22 μm 有机滤膜后转移至进样瓶，待气相色谱-质谱测定。

1.2.2.2 气相色谱-三重四级杆串联质谱检测条件色谱条件：色谱柱：赛默飞TG-5SILMS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度220 ℃；载气：高纯氦气，流速1.0 mL/min；不分流进样。升温程序：初始温度80 ℃，保持2.2 min；以30 ℃/min 升至250 ℃，保持1.0 min；以10 ℃/min 升至280 ℃，保持8.0 min。质谱条件：离子源：电子轰击（EI）；电子能量70 eV；质谱传输线温度280 ℃，离子源温度290 ℃；选择反应监测扫描模式（SRM），溶剂延迟5 min，质谱检测参数见表1。

表1 农药质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for pesticides

1.2.3 标准曲线绘制将质量浓度为100 mg/L 的抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚标准溶液用乙酸乙酯逐级稀释，分别配制成质量浓度为0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 和1.00 mg/L 的标准工作溶液。按1.2.2.2 仪器条件进行测定，以三种农药标准溶液的质量浓度（x）对峰面积（y）绘制标准曲线。

1.2.4 添加回收试验称取3 份（每份10.0 g）经测试不含供试农药的荔枝果皮、果肉和全果空白试样，分别添加抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚混合标准溶液，添加水平为：0.01、0.10、1.00 mg/kg，每个添加水平平行测定5 次，混匀静置30 min后，按照1.2.2.1 的方法提取、净化、定容，用GCMS/MS 测定，计算回收率及相对标准偏差。

1.2.5 膳食摄入风险评估

1.2.5.1 慢性膳食暴露风险慢性膳食暴露风险%ADI 按公式（1）计算，当%ADI≤100%时，表示风险可以接受；当%ADI＞100%时，表示有不可接受的风险。

式中：%ADI 为农药慢性膳食暴露风险（mg/kg bw）；STMR 为试验中获得的荔枝农药残留中值（supervised trials median residues，STMR）（mg/kg）；bw（body weight）为人群平均体重（kg），取60 kg；F 参考中国城市居民水果每日摄入量，取49.0 g[31]，中国18 岁以上成年人平均体重为64.3 kg[32]，咪鲜胺ADI 值为0.01 mg/kg bw，抑霉唑ADI 值为0.03 mg/kg bw[23]。

1.2.5.2 急性膳食暴露风险急性膳食暴露风险%ARfD 按公式（2）计算，当%ARfD≤100%时，表示风险可以接受；当%ARfD＞100%时，表示有不可接受的风险。

式中：U 为荔枝可食部分，取值16.4 g，3 岁以上普通人群荔枝大份餐LP 为263.95 g，数据采用世界卫生组织（WHO）相关数据库膳食数据表格IESTI calculation16 中的泰国数据[33]；HR 为农药最高残留量（highest residue，HR）（mg/kg）；变异因子ν取3；ARfD 为急性参考剂量，其中咪鲜胺ARfD 值为0.1 mg/kg，抑霉唑ARfD 值为0.05 mg/kg[34]。

1.3 数据处理

使用Chromeleon 7.0 软件采集数据及定量分析，采用Microsoft Office Excel 2019 和Origin 2021进行统计学分析和图形绘制，结果以平均数表示。

2 结果与分析

2.1 检测方法确证

在0.01～1.0 mg/L 标样范围内，抑霉唑、咪鲜胺及其代谢物的质量浓度与其峰面积线性关系良好，标样色谱质谱图见图1。线性方程回归方程分别为：咪鲜胺Y=49219X+914.97，r=0.9972；2,4,6-三氯苯酚Y=172047X+1441.3，r=0.9978；抑霉唑Y=120875X+346.78，r=0.9993；咪唑乙醇Y=55445X-465.66，r=0.9971。

图1 抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚标准溶液色谱-质谱图Fig.1 Chromatography-mass spectrometry of standard solution of imazalil,prochloraz,imidazole ethanol and 2,4,6-trichlorophenol

在空白荔枝全果、果皮和果肉样品中添加3 个水平浓度的标准溶液，每个添加水平5 个重复。采用基质匹配标准曲线降低基质效应。通过样品加标逐级稀释的方法信噪比为3 时，确定检出限（limit of detection，LOD），信噪比为10 时确定定量限（limit of quantitation，LOQ）。抑霉唑、咪鲜胺、咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚的LOD 分别为2.0、3.0、6.0、0.3 μg/kg；LOQ 分别为6.0、10.0、20.0、1.0 μg/kg。抑霉唑回收率为88.2%～102%，RSD 为2.7%～5.5%；咪鲜胺回收率为81.9%～95.0%，RSD 为2.6%～5.2%；咪唑乙醇回收率为78.9%～107%；RSD 为3.7%～5.8%；2,4,6-三氯苯酚回收率为91.1%～107%；RSD 为2.6%～5.5%；回收率、精密度均符合农药残留试验准则[29]的要求，结果见表2。

表2 抑霉唑和咪鲜胺及其代谢物在荔枝全果、果皮、果肉中的添加回收率（n=5）Table 2 Recovery rates of imazalil,prochloraz and their metabolites in whole fruit,peel and pulp of litchi (n=5)

2.2 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝全果、果皮和果肉的原始沉积量

荔枝采用抑霉唑和咪鲜胺保鲜剂各浸泡1 min，取出自然晾干2 h 后取样测定[13]。浸泡浓度与其在荔枝全果、果皮和果肉中的原始沉积量如表3 所示。荔枝果皮粗糙容易附着农药，保鲜剂浓度越高，果皮农药附着量越大，相应的全果和果皮的沉积量也越高，此时果肉中农药残留未检出，但随着时间延长，果皮上残留的农药会逐渐渗透到果肉中，这与邓义才等[14]的研究结果相似。因此，在保证保鲜效果的同时，选择合适的浸泡浓度是非常必要的。

表3 浸泡浓度对荔枝全果、果皮和果肉沉积量的影响Table 3 Effects of soaking concentration on whole fruit,peel and pulp deposition of litchi

2.3 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝中的消解动态

按照1.2.1.2 开展消解残留试验，监测抑霉唑、咪鲜胺及代谢物咪唑乙醇、2,4,6-三氯苯酚在保鲜贮藏过程中的残留消解动态，消解动态见图2 和图3，消解方程及半衰期见表4，表中咪鲜胺含量为咪鲜胺及其含有2,4,6-三氯苯酚部分的代谢产物之和[23]。

图2 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝全果、果皮和果肉中的残留动态Fig.2 Residual dynamics of imazalil and prochloraz in whole fruit,peel and flesh of litchi

图3 咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚在荔枝全果、果皮和果肉中的残留动态Fig.3 Residual dynamics of imidazole ethanol and 2,4,6-trichlorophenol in whole fruit,peel and flesh of litchi

表4 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝中的消解方程及半衰期Table 4 Digestion equation and half-life of imazalil and prochloraz in litchi

由表4 中数据可知，抑霉唑在荔枝全果和果肉的半衰期均比咪鲜胺短，在果肉中消解得最快；而咪鲜胺在荔枝果皮和果肉的半衰期接近，在全果中的半衰期最长。

由图2a 可知，消解全过程中果皮和全果的农药残留量远高于果肉。抑霉唑和咪鲜胺在全果和果皮中的残留浓度均随时间延长不断下降，咪鲜胺在14 d前下降趋势较快，14 d 后趋于平缓；全果中的抑霉唑残留量从25 d 后下降速率开始减慢，而在果皮中一直保持较快的下降趋势，这可能是由于附着在果皮上的抑霉唑更容易转化为咪唑乙醇。由于果皮上附着的农药会不断向果肉迁移渗透，因此果肉中抑霉唑和咪鲜胺残留量的变化则是先随储存时间不断升高，如图2b 所示，果肉中两种保鲜剂均于第7 d 达到残留峰值后再随时间不断降低。

两种保鲜剂的代谢物在荔枝全果、果皮和果肉中残留情况如图3 所示。咪唑乙醇和2,4,6-三氯苯酚的含量在0～40 d 的贮藏期呈不断上升的趋势，说明这两种代谢物在荔枝果实不同部位均有积累现象。咪唑乙醇在全果、果皮和果肉的积累量比2,4,6-三氯苯酚高，这可能是由于内吸性农药抑霉唑比咪唑类农药咪鲜胺更容易吸附渗透在荔枝上，原始沉积量大造成的，也可能是由于抑霉唑转化成咪唑乙醇的转化率更高造成的。

2.4 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝中的最终残留

按照1.2.1.3 开展最终残留试验，设置14、21和30 d 间隔期进行采样测定最终残留试验，35 d 时，荔枝果肉自溶现象严重、已经开始变质腐烂，因此为了更加合理地对膳食风险进行评估，试验仅列出30 d 前的数据，结果见表5。残留量数据分别为残留中值STMR 和最大残留量HR。

表5 抑霉唑和咪鲜胺及其代谢物在荔枝全果、果皮和果肉中的最终残留Table 5 Final residues of imazalil and prochloraz and their metabolites in whole fruit,peel and pulp of litchi

2.5 膳食风险评估

对荔枝的可食部分果肉进行风险评估。本着风险最大化原则，采用浸泡后贮藏14 d 的抑霉唑和咪鲜胺的数据进行膳食风险评估，其中2,4,6-三氯苯酚残留量按2,4,6-三氯苯酚与咪鲜胺的分子质量比197.5:376.8 换算成咪鲜胺。荔枝果肉中抑霉唑和咪鲜胺的慢性膳食暴露评估和急性膳食暴露评估见表6。慢性膳食风险值%ADI 和急性膳食风险值%ARfD 均小于100，在可接受范围之内，说明膳食风险较低，处于安全水平。

表6 抑霉唑和咪鲜胺在荔枝果肉中的膳食风险评估Table 6 Dietary risk assessment of imazalil and prochloraz in litchi pulp

3 讨论与结论

本实验采用QuEChERS 前处理技术建立了GCMS/MS 法同时测定荔枝中抑霉唑、咪鲜胺及代谢物咪唑乙醇、2,4,6-三氯苯酚的方法，在荔枝全果、果皮和果肉不同基质中的检出限、线性范围、精密度及添加回收均能满足准确定量分析的要求。

浸果保鲜剂浓度对荔枝全果、果皮和果肉的原始沉积量起主导作用，浓度越高、沉积量越大，沉积农药随着保鲜时间的延长，会逐渐渗透到果肉中，导致食用安全风险增加，因此，需要选择合理、适宜的浸果浓度进行荔枝保鲜。抑霉唑和咪鲜胺在荔枝全果、果皮和果肉中的消解均符合一级动力学方程，在实验的贮藏期内，它们的代谢物均随着时间延长不断累积，全果和果皮中的积累速度高于果肉。抑霉唑在荔枝各部位的半衰期为果皮＜全果＜果肉，咪鲜胺则为果皮≈果肉＜全果。对浸泡后14 d 荔枝果肉中的抑霉唑和咪鲜胺进行摄入风险评估发现，2 种浓度浸泡处理后，果肉的慢性和急性膳食摄入风险均在可接受范围内。荔枝的贮藏期远不如柑橘的贮藏期长，即使在30 d 内，代谢物在此贮藏期内的积累还不足以产生食用安全风险。但目前抑霉唑仍未在荔枝上登记，咪鲜胺虽然是荔枝登记用药，但仅用于种植时期，喷雾用药尚未有浸果保鲜用法，因此建议加快推进荔枝保鲜用药安全性评估及农药登记，完善用药安全间隔期，为合理规范杀菌剂的使用提供科学依据。此外，抑霉唑代谢咪唑乙醇的手性差异[35]可能产生危害风险、积累部位、毒性等差异，只有进一步开展相关研究，通过结合化学、生物学等技术，才能更真实、准确地评价抑霉唑对环境与健康的风险。