超声辅助提取油莎豆油的工艺优化及品质分析

2024-05-12刘学强赵丹丹吴彤娇郝建雄

食品工业科技 2024年10期

权煜，刘学强，赵丹丹，饶欢，吴彤娇，郝建雄

（河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050000）

油莎豆（Cyperus esculentusL.），又名铁荸荠或虎坚果，是莎草科植物的块茎，在欧洲的西班牙和非洲东北部被广泛种植，中科院植物所在1952 年时将油莎豆从苏联引进中国[1]。由于油莎豆适应性及抗逆性强，能够在干旱、沙化或酸性土壤中生长[2]，因此在中国北方种植较多[3]。油莎豆富含多种营养物质，其中油脂含量很高。油莎豆油以油酸（67.71%～74.60%）为主，因此不饱和脂肪酸含量高，与橄榄油的脂肪酸组成相似，营养价值也与其相当[4]。此外，油莎豆中的营养物质还具有一定的抗菌、抗氧化功效[5]，Shantrell 等[6]的研究结果表明，油莎豆的水提取物和甲醇提取物中含有酚类和黄酮等抗氧化活性成分，具有出色的铁还原能力，能够有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+）自由基，Jing 等[7]通过油莎豆油的体外和体内抗氧化活性试验也表明了油莎豆油具有良好的抗氧化性能。

油脂的常见提取方法可分为机械法和浸提法两种，机械法快速省时，但出油率低；近些年在普通浸提的基础之上衍生出超临界法（supercritical fluid extraction，SFE）、水酶法（aqueous enzymatic extraction，AEE）、微波（microwave assisted extraction，MAE）及超声波辅助法（ultrasonic assisted extraction，UAE）等快速方便、得油率高的方法。段蕾[3]采用SFE 提取油莎豆油，得率达到24.90%，且不饱和脂肪酸含量很高，但是实验成本较高。刘蕾等[8]利用AEE 水解植物细胞壁来获取油脂，但AEE 的瓶颈在于低采收率和长加工时间，且灭酶过程会使营养物质大量损失。Hu 等[2]使用MAE 提取油莎豆油，以石油醚和丙酮（2:1，v/v）的混合物作为溶剂，提取率为24.12%，与索式提取法（soxhlet extraction，SE）相比，油中营养成分含量更高，但是微波作用的缺点是加热不均匀。而UAE 利用超声波的空化效应、机械效应以及热效应破坏细胞，可以有效补偿微波加热不均匀的缺点[9]，且其成本低廉，对营养物质的损害较小。

前人的研究对油莎豆油的营养成分（总酚含量和总黄酮含量）报道较少，并且这些营养物质容易被提取方式、温度等因素影响。所以本试验利用超声辅助正己烷提取油莎豆油，并利用响应面法优化提取条件，从提取工艺和温度两个角度讨论其对油莎豆油中的总酚含量和总黄酮含量的影响，并测定了油脂的DPPH 自由基清除能力和脂肪酸组成，以期为油莎豆油脂的开发利用提供一定基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油莎豆河北省衡水市；正己烷、无水乙醇、亚硝酸钠、碳酸钠、硝酸铝、氢氧化钠分析纯，天津欧博凯化工有限公司；没食子酸标准品（HPLC≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）上海麦克林生化科技有限公司；福林酚试剂生物试剂，上海蓝季科技发展有限公司；芦丁标准品（HPLC≥98%）生物试剂，北京索莱宝科技有限公司。

Blue pard 生化培养箱、HWS-24 电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器有限公司；SpectraMax M2 酶标仪美国Molecular Devices 公司；HC-3018 高速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；JJ-666 磨粉机绿建家居用品有限公司；RE-5205 旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；CP114 电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；XM-P222H 无极调功超声波清洗机小美超声仪器（昆山）有限公司；Agilent 7890B 气相色谱仪美国Agilent 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油莎豆油超声辅助提取工艺油莎豆脱皮→干燥→粉碎过筛→超声辅助正己烷提取→9000 r/min，常温下离心10 min→蒸发溶剂→干燥恒重→油莎豆毛油。

操作要点：对油莎豆使用5% NaOH 在70 ℃下碱烫6 min 脱皮，清水洗净，自然风干4 h；粉碎过筛：使用研磨机将油莎豆研磨成细粉，超声辅助正己烷提取，并常温离心，保留上清液；蒸发溶剂：使用旋转蒸发仪于40 ℃下蒸发正己烷；干燥恒重：油莎豆粕的前后两次称量所得质量之差小于0.2 mg。制得的油莎豆油于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 油莎豆油得率计算将超声辅助提取得到的油莎豆毛油称重，与试验所需豆粉质量相比得到油莎豆油得率[8-10]。

1.2.3 单因素实验称取1.00 g 油莎豆粉末，按照1.2.1 的流程进行超声辅助提取。控制料液比为1:14 g/mL，超声时间为20 min，超声功率210 W，粉碎粒度40 目，考察不同超声温度（20、30、40、50、60 ℃）对油莎豆油得率的影响；控制料液比为1:14 g/mL，超声温度为40 ℃，超声功率210 W，粉碎粒度40 目，考察不同超声时间（10、15、20、25、30、35 min）对油莎豆油得率的影响；控制料液比为1:14 g/mL，超声时间为20 min，超声温度40 ℃，粉碎粒度40 目，考察不同超声功率（210、245、280、315、350、385 W）对油莎豆油得率的影响；控制超声时间为20 min，超声温度40 ℃，超声功率315 W，粉碎粒度40 目，考察不同料液比（1:8、1:10、1:12、1:14、1:16、1:18 g/mL）对油莎豆油得率的影响；控制料液比为1:14 g/mL，超声时间为20 min，超声功率315 W，超声温度40 ℃，考察不同粉碎粒度（20、40、60、80、100、120 目）对油莎豆油得率的影响。

1.2.4 响应面优化试验设计根据单因素实验结果，使用Design-Expert 13 的Box-Behnken 模型进行响应面优化试验（BBD），选择超声温度、超声时间、料液比和粉碎粒度4 个因素，进行四因素三水平的响应面设计，以油莎豆油得率为响应值，四个因素的水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Levels of independent variables in the response surface design

1.2.5 油莎豆油品质分析

1.2.5.1 基本感官指标油脂透明度、气味、滋味依据GB/T 5525-2008《植物油脂透明度、气味、滋味鉴定法》[11]中方法测定。

1.2.5.2 总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu 比色法。将0.2 mL 油莎豆油的80%乙醇提取物与1 mL 0.1mol/L 的福林酚试剂混合，静置3 min 后添加3 mL 10% Na2CO3，定容至10 mL。避光反应1 h，于765 nm 处测定吸光度。标准曲线的绘制：精密称量没食子酸对照品1 mg，用去离子水溶解并制成0.1 mg/mL 的没食子酸标准品母液。精密量取标准品母液0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，按照样品的测定流程测定并绘制标准曲线，结果以每毫升溶液中没食子酸质量表示测定样品中总酚含量[12-13]。标准曲线回归方程为：y=0.4060x+0.1845，R2=0.9961。

1.2.5.3 总黄酮含量测定取0.2 mL 油莎豆油的80%乙醇提取物，与0.5 mL 5% NaNO2溶液混合，静置7 min 后加入0.5 mL 10% Al（NO3）3溶液，反应7 min后加入5 mL 1mol/L 的NaOH 溶液，60%乙醇定容至10 mL，在510 nm 处测定样品吸光度值。标准曲线的绘制：精密称量芦丁标准品10 mg，用60%乙醇溶解并定容至100 mL，制成0.1 mg/mL 的芦丁标准品母液。精密量取标准品母液0、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，按照样品的测定流程测定并绘制标准曲线，结果以每mL 溶液中芦丁质量表示[12-14]。标准曲线回归方程为：y=0.6811x-0.0021，R2=0.9973。

1.2.5.4 DPPH 自由基清除率测定用无水乙醇准确配制浓度为4、8、12、16、20 mg/mL 的油莎豆油样品，分别取1 mL 样品，加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH-无水乙醇溶液，摇匀并避光静置30 min，于517 nm 处测定吸光度A1；用无水乙醇代替DPPH 溶液作为空白对照，测定吸光度A2；按照下式计算DPPH 自由基清除率[15-16]。

式中：A0：无水乙醇+DPPH 溶液的吸光度；A1：样品+DPPH 溶液的吸光度；A2：样品+无水乙醇的吸光度。

1.2.5.5 脂肪酸组成测定脂肪酸组成测定方法参照GB 5009.168-2016[17]。气相色谱条件：色谱柱，HP-88（100 m×0.25 mm×0.25 μm）；检测器，氢火焰离子化检测器（FID）；载气，氮气（纯度≥99.999%）；柱温：100 ℃保持13 min，10 ℃/min 升温至180 ℃，保持6 min，1 ℃/min 升温至200 ℃，保持20 min，4 ℃/min 升温至230 ℃，保持10.5 min；进样口温度，270 ℃；检测器温度，280 ℃；分流比，30:1；进样量，1 μL。

1.3 数据处理

每组实验重复3 次，数据以平均值±标准差表示。使用SPSS 26 软件对数据进行Duncan 多重比较，响应面数据使用Design-Expert 13 和Origin 2021软件进行分析与作图。显著性水平确定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

超声温度对油莎豆油得率的影响由图1A 所示，油莎豆油的得率随提取温度升高先增大后减小，在40 ℃时达到最高，为19.49%。温度的升高使油脂在溶剂中溶解度增大，溶剂密度和粘度降低，油脂扩散加快，得率增加[18-19]；但过高的温度增加了溶剂的饱和蒸气压，导致气泡闭合时缓冲作用增强，空化破坏作用减弱[20]，正己烷的沸点较低，约为69 ℃，所以温度升高对其作为提取溶剂的提取效率有较大影响，高温也会使溶剂蒸发，减少了豆粉与溶剂之间的有效接触面积，导致得率的大幅下降。Tian 等[10]提取石榴籽油与刘蕾等[8]提取油莎豆油时都在40 ℃之后得率显著（P＜0.05）下降。因此选择30～50 ℃为后续试验温度。

图1 单因素实验对油莎豆油得率的影响Fig.1 Effects of single factor experiment on the yield of oil from tiger nut oil

超声时间对油莎豆油得率的影响由图1B 所示，随着提取时间的延长，油莎豆油的得率先升高后下降，在15～20 min 之间得率增加较快，在20 min 时达到最大值19.55%。超过20 min 时开始快速下降。这是因为在提取过程开始时，由于固液主体之间的浓度梯度和超声空化效应，扩散驱动力大，溶剂良好地渗透到细胞中[21]；随着时间的延长，油莎豆中不溶性物质等杂质悬浮在提取物中，或重新吸附到破裂的组织颗粒上，降低了溶剂对细胞结构的渗透性[22]，Joven 等[23]在提取雨伞树种子油脂时也有类似的趋势。因此选择15～25 min 为后续试验时间。

超声功率对油莎豆油得率的影响由图1C 所示，超声功率从210 W 增加到315 W 时，油的得率有所增加，在315 W 时达到最大值22.97%，之后随着超声功率的增大得率大幅下降，这与胡炜东等[24]和高芳芳等[25]提取油莎豆油的研究结果趋势一致。这是由于超声功率的增大使空化和机械作用强烈，油脂渗出量随之增大[26]；当超声功率过大时，油脂可能分解或挥发，使提取率略有减少[22,27]，故选取超声功率为315 W 较适宜。

料液比对油莎豆油得率的影响由图1D 所示。随着溶剂用量的增加，油莎豆油的得率逐渐增大。当液料比达到1:14（g/mL）时，油的得率达到最高值24.48%。进一步提高液料比例并未对得率产生显著增益，继续增大液料比则会导致油得率略微下降，这与Tian 等[10]和Senrayan 等[9]提取木棉籽油的研究结果趋势一致。由于有机溶剂的介电常数大约等于甘油三酯的介电常数，因此使用正己烷等有机溶剂容易浸入细胞内部，从而有效溶解脂质[28]。在1:8～1:14（g/mL）间逐渐上升主要是由于固液主体之间的浓度梯度给予了传质过程中的驱动力[10,29]，但当溶剂过大时，对于在底部沉积的豆粉颗粒，超声产生的空化和机械等效应强度减弱，导致溶剂的浪费并增加后续工作的困难[30]，故选择液料比为1:14（g/mL）左右较适宜。

粉碎粒度对油莎豆油得率的影响由图1E 所示。在粉碎粒度为20～60 目时，随着粉碎粒度的增加，油的得率明显提高，在60 目时达到最大值23.96%，而当粉碎粒度大于60 目时，得率显著（P＜0.05）下降。唐琳琳[31]研究超声辅助提取红树莓籽油时发现，籽粒的粉碎粒度是影响油脂得率的关键因素，这是因为油莎豆粉质变细，使溶剂与豆粕接触面积增大，传质阻力减少，油脂更易溶出也更容易提取完全；但油莎豆粉碎过细时豆粕易沉底被压实，不易被溶剂接触完全，增加了传质阻力，不利于豆油的提取，因此导致得率下降[32]。刘花花等[32]提取石榴籽油时也发现粉碎粒度超过60 目后得率也显著下降。因此粉碎粒度选择40～80 目为后续试验粉碎粒度。

2.2 单因素方差分析

由表2 可知，五个因素均对油的得率有极显著影响（P＜0.01），超声功率相对于料液比、超声时间、超声温度和粉碎粒度对油莎豆油的得率影响较小。考虑实验条件和效率，在响应面优化试验中选择料液比、超声时间、超声温度和粉碎粒度四个因素进行考察。

表2 单因素实验方差分析结果Table 2 Analysis of variance results of single factor experiments

2.3 响应面优化试验结果分析

2.3.1 试验结果与方差分析根据从单因素实验得出的最佳条件，对其进行了包括五组中心点实验在内的共29 组实验，以进行四因素三水平的响应面分析，具体结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology experimental

将上述实验数据通过Design-Expert 软件进行多元回归拟合，得到拟合二次多项回归方程。以超声温度A、超声时间B、料液比C 和粉碎粒度D 为自变量，以油莎豆油得率为响应值，回归方程为：Y=24.24+0.9417A+0.1258B+1.70C+1.86D+0.5750AB+0.8950AC+0.2800AD+0.0675BC-0.3250BD+0.9025CD-1.28A2-1.87B2-2.29C2-2.33D2。

回归模型进一步应用方差分析及显著性检验进行评估，结果见表4。F值和P值用于显著性评估。从表可知，模型F=147.44，P＜0.0001，表明回归模型极显著，具有统计学意义；失拟项F=0.2908，P＞0.05，说明了模型失拟相对于纯误差造成的油莎豆油得率变异之间差异不显著，拟合度好。四个因素对油莎豆油得率的影响程度大小为：粉碎粒度＞料液比＞超声温度＞超声时间。R2=0.9931，说明因变量与自变量间有一定的线性关系[33]；校正决定系数R2Adj=0.9865，预测决定系数R2Pred=0.9776，说明该回归模型选择合适，具有良好的拟合优度和预测能力[34]；变异系数C.V.%=1.34，说明结果准确性和可靠性较高。Adeq Precision 值大于4 表明模型抗干扰能力良好[34-35]，该模型Adeq Precision=35.9394，说明其在自变量范围内是准确可靠的。

表4 方差分析结果Table 4 Analysis of variance

2.3.2 响应面交互作用分析根据回归方程绘制对应的响应面图，两因素间的交互作用强弱可以从图像的等高线中体现，椭圆形代表交互作用对响应值的影响强；响应曲面的陡峭程度反映了各项因素得影响程度，陡峭代表因素对响应值的影响大。如图2 所示，所有3D 图像均表现出一定的“钟罩型”，说明中心条件选择恰当，得率在四因素的三个水平间都存在先升高再降低的趋势[32]。结合表4，AB、AC、BD、CD 的交互作用对响应值的影响显著（P＜0.05），CD 的交互作用对响应值的影响最强，AC 次之；AD、BC 的交互作用对响应值的影响不显著。此外，单因素对得率的影响是否显著会影响响应面的形状，由于B 对得率的影响不显著，所以图2a、图2d、图2e 图形的超声时间面相对平缓，整体呈现较标准的伞状。粉碎粒度的显著性最大，在图2c、图2e、图2f 中有所体现，得率显著提高，图形陡峭走高，图形呈现非对称性。

图2 两因素交互作用对响应面的影响Fig.2 Effects of the interaction between two factors on the response surface

2.3.3 响应面优化结果及验证通过软件分析，得到油莎豆油理论提取工艺为：料液比1:15.22（g/mL）、超声时间20.50 min、超声温度46.64 ℃、粉碎粒度71.02 目，油莎豆油的最大得率为25.59%；但考虑到实际操作的可行性，将工艺调整为：料液比1:15（g/mL）、超声时间20 min、超声温度47 ℃、粉碎粒度70 目，在该条件下重复提取3 次油莎豆油，实际得率为24.98%、25.03%、25.02%，相对标准偏差RSD=2.00%，与回归模型预测的得率最大值相比无显著差异，说明应用响应面模型优化油莎豆油超声辅助提取工艺条件的结果可靠。

2.4 不同工艺与温度对油品质的影响

2.4.1 不同温度及超声作用对油中活性成分和抗氧化性的影响选择25 ℃（常温）、47 ℃（超声辅助提取最佳温度）、60 ℃（高温）三个温度，分别在超声与不超声的条件下进行油莎豆油的提取，并对这6 组油莎豆油进行基本感官和总酚、总黄酮、DPPH 清除率的测定，结果如图3～图4 所示。由图3 可知，6 组油样因未进行精炼，在20 ℃放置24 h 后均呈现微浊状态，液体为黄橙色，无明显异味，具有豆类特有的香气。

图3 6 组油莎豆油毛油成品图Fig.3 Product diagram of 6 groups of tiger nut (Cyperus esculentus L.) crude oil

图4 不同温度及超声作用下油莎豆油的总酚、总黄酮含量及DPPH 自由基清除率Fig.4 Total phenolic and flavonoid contents and DPPH clearance rate of tiger nut oil under different temperatures and ultrasound effects

图4a 表示出不同温度及超声作用下的6 份油品中总酚含量的变化。在超声与未超声组中，25 ℃时的总酚含量在三个温度中最大，分别为0.54、0.48 mg/mL。从图4a 中可以看出，超声组总酚含量均显著（P＜0.05）高于未超声组。说明在超声作用下，油莎豆油中的酚酸类物质能更好的溶出，且在25～60 ℃间超声作用对酚酸类物质的结构破坏效应小。但随着温度的上升，油中总酚含量有些许下降，这种现象尤其体现在未超声组，说明体系温度对酚酸类物质的结构破坏效应相对较大，超声组的下降趋势不明显可能是因为超声作用下溶出的总酚比被高温破坏结构的总酚含量高，所以呈现出了这种结果。

图4b 表示了不同温度及超声作用下的6 份油品中总黄酮含量的变化，在提取油莎豆油的过程中，随着温度的增加，总黄酮的含量也有所增加，在60 ℃时油中总黄酮含量与47 ℃时的总黄酮含量无显著差异，但在之前的单因素实验中，油莎豆油的得率在60 ℃时相对于40 ℃显著（P＜0.05）下降，这说明油莎豆油的得率与油中的总黄酮含量可能无相互影响作用。另外，根据文献[36-37]的实验结果，黄酮类物质的提取最佳温度大致在50～60 ℃之间，本实验的趋势与其相符。在超声与未超声组的对比中，在25 ℃时超声作用对总黄酮的含量有显著（P＜0.05）的降低作用，这说明油莎豆油中的黄酮类物质容易被超声作用破坏，这种作用随着温度的升高而逐渐不明显，这可能是因为体系温度升高，加强了超声的空化作用，使油莎豆中的黄酮类物质更好地溶出，从而拉近了与未超声组的差距。

图4c 表示了不同温度及超声作用下的6 份油品的DPPH 自由基清除率，油莎豆油浓度在0～20 mg/mL 时对DPPH 自由基的清除率随着质量浓度的升高而增大，呈现一定的线性关系，说明油莎豆油中含有抗氧化性成分，超声与否对DPPH 自由基的清除率影响不显著，从整体趋势上看，温度升高会降低油脂的抗氧化活性。

2.4.2 油莎豆油脂肪酸组成分析将油莎豆油经甲酯化后通过气相色谱仪进行分析，得到6 组脂肪酸气相色谱图如图5 所示，油莎豆油的脂肪酸有较好地分离且经过样品前处理后没有杂质干扰。

图5 油莎豆油脂肪酸色谱图Fig.5 Chromatogram of fatty acids of tiger nut oil

对6 组油样进行脂肪酸组成含量检测分析，共检测出11 种脂肪酸，结果见表5。

表5 油莎豆油脂肪酸组成（%）Table 5 Fatty acid compositions of tiger nut oil (%)

由表5 可以看出，6 组油莎豆样品可检出的脂肪酸组成相同，因提取工艺和温度有微小的不同。油莎豆油脂中含量最高的脂肪酸是油酸（C18:1），含量在73.81%～74.00%左右，其次是棕榈酸（C16:0），含量大约为12.80%，与前人的研究结果类似[38-40]，再次证实了油莎豆油是一种富含油酸的植物油。并且本试验采用超声辅助正己烷所提取的油莎豆油中棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1n9c）和亚油酸（C18:2n6c）的含量均符合LS/T 3259-2018《油莎豆油》标准。

对6 组油样的每种脂肪酸及饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）、多不饱和脂肪酸（PUFA）、不饱和脂肪酸（UFA）的含量进行显著性分析，结果显示除硬脂酸（C18:0）和亚麻酸（C18:3n3）的含量在6 组油样中有显著性（P＜0.05）差异，其他脂肪酸含量的变化均不显著，这证明了在25～60 ℃超声作用和温度的变化对脂肪酸的种类和含量的影响不大。其中60 ℃未超声组的硬脂酸含量显著（P＜0.05）低于其他组，这可能是由于高温所导致的，也可能是试验误差导致；超声作用对亚麻酸的含量有一定影响，超声组的含量比未超声组的含量相对较高，温度对其含量的影响还需进一步研究。

3 结论

经超声温度、超声时间、料液比及粉碎粒度四个因素的响应面优化试验，确定油莎豆油的最优提取条件为：料液比1:15（g/mL）、超声时间20 min、超声温度47 ℃、粉碎粒度70 目，在此条件下，油莎豆油的得率为25.01%±0.03%，RSD=2.00%，油样为黄橙色微浊状态，具有豆类特有的香气。油莎豆油浓度在0～20 mg/mL 时对DPPH 自由基有一定的清除作用；在总酚含量测定中，超声在三组不同温度下均有显著性（P＜0.05）作用，未超声组的总酚含量随温度的上升而显著下降；在总黄酮含量测定中，超声与未超声组的总黄酮含量都随温度的上升而上升。研究证明超声作用使油莎豆中的营养物质能更好的溶出，但对油莎豆中黄酮类物质的破坏效应相对较大，而酚酸类物质在高温时含量显著（P＜0.05）下降。在25～60 ℃超声作用和温度的变化对脂肪酸的种类和含量的影响不大，油酸（C18:1）含量最高，约为73.81%～74.00%。

油莎豆作为一种新型油料作物，本研究为油莎豆油的开发利用及新标准的制定提供了客观依据，油莎豆油作为新型能源具有重要研究意义和应用价值。