组蛋白去甲基化酶JMJD2E抑制肝癌细胞恶性进展的研究*

李晓华 郑志刚

福建医科大学附属福州市第一医院 1 乳腺外科 2 普通外科,福建省福州市 350009

肝癌是一种严重威胁全球公共卫生的高度致命恶性肿瘤,特征为快速生长、高度浸润性和广泛转移。肝癌的诊断常在晚期,限制了有效治疗的机会。据世界卫生组织报告,肝癌已成为全球第四大癌症致死原因,每年导致近一百万人死亡,给全球卫生系统和患者家庭造成了沉重的负担[1]。现有治疗方法包括手术、放射、化疗等,但晚期患者的治疗效果有限[2]。因此,寻找新的治疗策略和靶点以提高患者的生存率和生活质量至关重要。组蛋白修饰控制着染色质的功能,而JMJD2家族成员(特别是JMJD2E)是调节这些修饰的关键。可以解除染色质的紧密结合,从而激活与细胞增殖、生长和转录调控相关的基因,这种活动可能导致肿瘤细胞中致癌基因的过度表达,从而促进肿瘤生长和扩散[3]。microRNA-372(miR372)已被证明在几种人类癌症中发挥重要作用。同时,在多种癌细胞中也发现了JMJD2E对miR372的调控作用[4]。本研究主要探讨JMJD2E在肝癌细胞中的作用机制,以及其与miR372之间的调控关系。

1 实验方法

1.1 体外肝癌细胞生长影响检测 为了深入探究JMJD2E对肝癌细胞增殖的影响,笔者构建了稳定表达JMJD2E的Hep3B细胞株。为了验证JMJD2E对细胞增殖的潜在抑制作用,笔者设计了CCK8实验来定量分析细胞活力。此外,为了评估其对细胞克隆能力的影响,笔者进行了菌落形成效率实验,其中细胞被种植在平皿中,允许形成可见菌落,进一步以结晶紫染色和计数来确定菌落数量,这些实验的设计旨在模拟细胞在无限制条件下的生长能力。

1.2 体内肝癌细胞生长影响检测 在体内实验中,笔者采用了异种移植模型来评估JMJD2E在活体内对肝癌细胞生长的影响。通过将JMJD2E转染的Hep3B细胞悬浮液注射到Balb/C小鼠的皮下,笔者建立了肿瘤生长模型。肿瘤生长被定期监测,随后肿瘤被摘除并称重,以物理量度来评估肿瘤体积变化。此外,笔者对摘除的肿瘤进行了详尽的组织学分析,包括HE染色,以确定肿瘤的细胞学特征和异质性,从而提供对JMJD2E在体内抑制肝癌细胞生长效果的直接证据。

1.3 JMJD2E对miR372表达影响检测 考虑到miR372在肝癌发展中的潜在角色,笔者采用了一系列分子生物学技术来研究JMJD2E如何调节其表达。利用RT-PCR和Western blotting,笔者定量分析了miR372及其相关转录因子的mRNA和蛋白表达水平。通过CHIP实验,笔者评估了JMJD2E对miR372启动子区域结合蛋白的影响。EMSA和RIP实验被用来研究特定蛋白与miR372启动子区域的相互作用,以及这些相互作用对miR372表达调节的潜在影响。这些技术的综合使用使笔者能够全面地分析JMJD2E对miR372表达的调控作用。

2 结果

2.1 JMJD2E在体外抑制肝癌细胞生长 笔者研究了JMJD2E对Hep3B肝癌细胞生长的影响。通过建立两个Hep3B细胞株,一个作为对照组(转染pCMV6-AC-GFP),另一个过表达JMJD2E(转染pCMV6-AC-GFP-JMJD2E),笔者通过RT-PCR和Western blotting确认了JMJD2E的表达水平。实验结果表明,JMJD2E显著抑制了细胞的增殖(见图1a),过量的JMJD2E显著减少了生长肝癌细胞Hep3B含量(见图1b)。同时,JMJD2E显著抑制了菌落形成(见图1c),BrdU标记的增殖率也显著降低(见图1d)。验证了JMJD2E能减缓Hep3B细胞的恶性生长。

图1 JMJD2E在体外抑制肝癌细胞生长

2.2 JMJD2E在体内抑制肝癌细胞生长 笔者进一步在Balb/C小鼠模型中研究了JMJD2E的体内效果(Balb/C小鼠腋下皮下注射转染了pCMV6-AC-GFP、pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B细胞后形成的异种移植肿瘤)。JMJD2E的过表达显著减少了小鼠体内异种移植肿瘤的重量(见图2a、b),并且肿瘤组织学分析肿瘤切片苏木精—伊红(HE)染色结果显示低分化细胞减少(见图2c)。这些结果表明,JMJD2E在体内也能抑制肝癌细胞的生长。

图2 JMJD2E在体内抑制肝癌细胞生长

2.3 JMJD2E在表观遗传学上减弱miR372的表达 考虑到JMJD2E与miR372在肝癌中可能的负相关关系,笔者检查了JMJD2E对miR372表达的影响。笔者在转染了pCMV6-AC-GFP-JMJD2E的Hep3B细胞系中,观察到JMJD2E的过表达(见图3a)。笔者发现JMJD2E促进了H3K36me3和DNMT1与miR372启动子的相互作用,增加了甲基化(见图3b、c)。此外,笔者发现JMJD2E促进了miR372启动子区域的甲基化(见图3d)。JMJD2E还减少了CRE元件的活性及多个转录因子的负载(见图3e～g),并抑制了CTCF介导的染色质环的形成,影响了CREB、P300、RNApolII进入该环(见图3h)。这导致了miR372各个成熟阶段的显著降低(见图3i、j)。这些发现支持了JMJD2E通过表观遗传学机制抑制miR372,从而可能影响肝癌细胞的恶性行为。

图3 JMJD2E在表观遗传学上减弱miR372的表达

3 讨论

肝癌是一种高度恶性的癌症,寻找有效的治疗靶点对于提高患者生存率至关重要[5]。本研究探讨了组蛋白去甲基化酶JMJD2E在肝癌细胞中的作用及其与miR372的关系。首先,笔者通过转染稳定的Hep3B细胞株,发现JMJD2E的高表达显著抑制了细胞的增殖和生长,并降低了集落形成效率。此外,异种移植实验进一步证明了JMJD2E的抑制效应。在分子水平上,JMJD2E过表达导致JMJD2E mRNA和蛋白的显著降低。笔者进一步研究了JMJD2E对miR372的表观遗传学调控机制。实验结果表明,JMJD2E促进了miR372启动子区域的甲基化,并降低了关键调节因子如CREB、P300和RNApolII在该区域的负载。这导致了miR372的表达和成熟的显著降低。总的来说,本研究揭示了JMJD2E在抑制肝癌细胞的生长和在表观遗传学水平上减弱miR372的表达中的关键作用,为肝癌治疗提供了新的潜在靶点和策略。

以铂为基础的药物如顺铂(cisplatin,CP)是非小细胞肺癌(NSCLC)的一线化疗药物。相关研究结果显示,JMJD2去甲基化酶是克服NSCLC CP耐药性的潜在治疗靶点[6]。Chen等[7]研究显示,JMJD2D在多发性恶性肿瘤,特别是结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)的进展中也是一种成熟的表观遗传促进因子。LI等[8]研究人员发现,JMJD2A通过下调肿瘤抑制因子miR-491-5p促进宫颈癌细胞生长并抑制细胞凋亡。因此,JMJD2家族在多种癌症类型中的异常表达与癌症的发病和进展密切相关。深入了解JMJD2酶家族在癌症发展中的确切作用和分子机制将有助于揭示新的治疗靶点和癌症干预策略,为癌症患者的治疗提供新的希望[9]。笔者的研究揭示了JMJD2E在人肝癌细胞株Hep3B中的抑制作用。通过转染稳定的Hep3B细胞株,笔者证实了JMJD2E的高表达能够显著减少Hep3B细胞的增殖和生长。这一现象在分子水平上得到了支持,因为JMJD2E的过表达导致了JMJD2E mRNA和蛋白的显著降低。此外,集落形成实验和BrdU阳性率测定结果均表明,JMJD2E的高表达可显著降低Hep3B细胞的集落形成效率和增殖活性。更具意义的是,笔者的体内异种移植实验进一步证明了JMJD2E的抑制效应,因为JMJD2E的过表达使异种移植物肿瘤的生长明显减缓,同时还导致了肿瘤组织中低分化细胞的减少,表明JMJD2E在调控肝癌细胞生长方面发挥着关键作用。

Lin等[10]研究观察表明,miR372通过miR372-YB-1-β-catenin-LEF/TCF4-PKM2-erbB-2轴激活癌细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)-细胞周期蛋白 E-P21/Cip1复合物来促进肝脏周期进程,提示miR372可以作为肝癌的一种新的治疗靶点。另一项研究结果表明,miR-372抑制了在肝癌中高度表达的 ATAD2的表达,并在肝癌发展中发挥了原癌基因的作用[11]。同时,在多种癌症类型中,miR-372的过表达已被观察到,特别是在肝癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌等肿瘤中。这种过表达与肿瘤细胞的增殖和侵袭能力的增强相关,可能通过抑制抑癌基因的表达以及促进癌基因的表达来推动肿瘤生长和扩散[12]。笔者进一步研究了JMJD2E与miR372之间的调控机制,特别是在表观遗传学水平上。前期研究已经发现JMJD2E在人肝癌组织中与miR372呈负相关,因此笔者对JMJD2E是否能够减弱miR372的表达进行了深入探究。本研究发现,在JMJD2E过表达的Hep3B细胞中,JMJD2E促进了H3K36me3与miR372启动子之间的相互作用,这可能导致miR372的抑制。此外,JMJD2E还增加了DNMT1与miR372启动子之间的相互作用,导致miR372启动子区域的甲基化增加。这些结果表明JMJD2E通过改变染色质结构和甲基化状态,以及对关键调节因子如CREB、P300和RNApolII的调控,抑制了miR372的正常表达和成熟。总体而言,JMJD2E在表观遗传学水平上对miR372的抑制作用揭示了其在肝癌发展中的潜在重要性。

总之,组蛋白去甲基化酶JMJD2E可抑制肝癌细胞的恶性进展,其机制可能与抑制miR372的表达相关。这些研究结果不仅有助于深入理解JMJD2E在肝癌中的作用机制,还为肝癌治疗和相关疾病的治疗策略提供了新的见解和潜在靶点。然而,仍需进一步研究以确定JMJD2E与miR372之间的分子交互作用的详细机制,并且需要进一步研究确定其在肝癌发展中的具体调控网络。